Comparative analysis of efficiency of bacteriological and molecular-biological methods for the assessment of microbial contamination of hospital environment objects

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Стратегической задачей здравоохранения является обеспечение качества медицинской помощи и создание безопасной среды пребывания для пациентов и персонала в медицинских учреждениях [6]. Неотъемлемой составляющей мер по обеспечению безопасности и качества медицинской деятельности является оптимизация
системы эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием
медицинской помощи (ИСМП). Актуальность ИСМП определяется их широким
распространением, негативным воздействием на здоровье и жизнь пациентов, увеличением расходов на оказание медицинской помощи и др. [9].
Результаты научных исследований показали, что ИСМП поражают в Российской
Федерации в среднем 10% госпитализированных пациентов, составляя ежегодно не
менее 2,5 — 3 млн случаев [5]. Общий экономический ущерб, причиняемый ИСМП
ежегодно, при этом может достигать 300 млрд рублей [1].
В каждой медицинской организации циркулируют те или иные микроорганизмы, которые представляют собой угрозу развития ИСМП у пациентов. Уровень
колонизации ими больничных объектов при использовании бактериологических
методов исследования составляет от 5% до 36% [4, 7]. В то же время, проблема профилактики ИСМП требует качественного эпидемиологического анализа ситуаций с
привлечением современных высокочувствительных методов, которые используются
в диагностике традиционных инфекционных заболеваний, в том числе для выявления источников инфекции и факторов передачи возбудителя во время эпидемических вспышек.
В настоящее время методы молекулярной биологии, основанные на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), находят все более широкое применение в целях диагностики и экспресс-анализа разнообразного биологического
материала. Интенсивное развитие подобных методик обусловлено очень высокой
чувствительностью ПЦР, возможностью быстрого получения результатов, низкой
стоимостью получаемых результатов (по сравнению с другими методиками) и
технологичностью. Их использование необходимо для решения таких серьезных
проблем, как широкое распространение устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к лекарственным препаратам, что наиболее ярко проявляется
в отношении возбудителей ИСМП [12]. В последние годы отмечается глобальный характер распространения детерминант резистентности к антимикробным
препаратам, при этом значительную угрозу представляет возможность выноса за
пределы стационаров и распространения в обществе устойчивых к антимикробным препаратам микроорганизмов или генетических структур, содержащих гены
антибиотикорезистентности [11].
Эпидемиологические и медицинское значение заболеваний, вызываемых устойчивыми к антибиотикам патогенами, чрезвычайно велико, так, например, лишь
с нечувствительными к цефалоспоринам 3 поколения K.pneumoniae, E.coli и метициллинрезистентным Staphylococcus aureus (MRSA) в России связаны общие затраты на лечение пациентов в РФ в размере более 12 млрд руб. [2]. Генетической характеристикой всех MRSA, независимо от генотипов SCCmec
элемента, является наличие гена mecA, обусловливающего устойчивость данных
штаммов к оксациллину и бета-лактамным антибиотикам, и генов ccr-комплекса,
которые кодируют белки, осуществляющие эксцизию и сайт специфическую интеграцию mecA в геном стафилококков [13].
На основании результатов исследований, проведенных в последние годы, рекомендовано использование методов молекулярно-биологической диагностики при
проведении микробиологического мониторинга, в т.ч. и состояния объектов внутрибольничной среды, что позволит быстро реагировать на эпидемические вспышки, обусловленные «госпитальными» штаммами, сформировавшимися в стационарах, и штаммами, заносимыми в стационары из других медицинских организаций
[3, 8, 10].
Цель исследования — провести сравнительный анализ эффективности использования бактериологических и молекулярно-биологических методов для оценки
микробной обсемененности объектов внутрибольничной среды как факторов передачи микроорганизмов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проведено комплексное лабораторное обследование объектов внутрибольничной среды хирургических, реанимационных, гематологических отделений
крупной многопрофильной клиники в течение 2017 года. Отобрано 215 проб с
наиболее значимых в эпидемиологическом плане объектов: рук и спецодежды медицинского персонала, телефонных аппаратов, клавиатуры компьютера, кнопок
перфузора, ручек дозаторов, мониторов аппаратов ИВЛ, манипуляционных столиков, дверных ручек, спинок кроватей пациентов, штативов для внутривенных
инфузий, консолей.
Смывы с объектов внутрибольничной среды проводили с использованием
традиционных питательных сред (мясо-пептонный бульон, среды Эндо, ВильсонБлер, псевдомонадный агар, манитолагар, среда Сабуро). Для идентификации
микроорганизмов бактериологическим методом использовали автоматический
микробиологический анализатор «Vitek-2» (Лашенкова Н.Н., НМХЦ им. Н.И. Пирогова).
Выявление в образцах биоматериала ДНК основных бактериальных возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и генетических
детерминант их антибиотикорезистентности проводили методом мультиплекстной ПЦР-РВ с использованием методик и наборов реагентов, разработанных в
ЦНИИ эпидемиологии. Использованные методики и наборы реагентов основаны
на ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации с помощью флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов. ПЦР-исследование выполнялось с помощью систем для проведения ПЦР-РВ RotorGene
Q и CFX96 Touch. Экстракцию ДНК из образцов биоматериала (смывы с объектов
внутрибольничной среды) проводили с использованием комплектов реагентов
«РИБО-преп».
Для выявления ДНК Aсinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus spp., Streptococcus spp. и Enterococcus
spp. использовали методику, включающую два мультиплексных ПЦР-РВ-теста, позволяющие детектировать специфические фрагменты ДНК возбудителей инфекций
каждого из выявляемых видов или групп бактерий по отдельному каналу флуоресцентной детекции. Для выявления генов приобретенных карбапенемаз основных групп —
металло-бета-лактамаз (MBL) групп VIM, NDM и IMP у основных грам-отрица-тельных возбудителей инфекций использовали наборы реагентов «АмплиСенс®
MDR-MBL-FL» и «АмплиСенс® MDR-KPC/OXA-48-FL». Для выявления ДНК
метициллин-резистентных стафилококков (как MRSA, так и MRCNS) и идентификации ДНК S.aureus использовали набор реагентов «АмплиСенс® MRSA-скринтитр-FL» (Савочкина Ю.А., Скачкова Т.Н., ЦНИИ эпидемиологии).
Рассчитывали интенсивные показатели частоты выделения микроорганизмов,
экстенсивные показатели распределения структуры выделенных микроорганизмов,
коэффициент линейной корреляции между выделением микроорганизмов и ДНК
микроорганизмов, достоверность различий показателей оценивали с использованием критерия Стьюдента (t). Статистическая обработка данных осуществлялась с
помощью программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
За период проведения исследования микробная обсемененность объектов внутрибольничной среды составила 54,0±2,8% на основании данных бактериологического изучения и 80,0±3,4% — по результатам использования молекулярно-биологических методов. Между частотой бактериологического выделения микроорганизмов
и определением ДНК возбудителей в различных отделениях стационара выявлена
сильная прямая корреляционная связь (r=0,92).
С помощью бактериологического метода обнаружено 129 микроорганизмов,
с преобладанием коагулазонегативных стафилококков (КНС) в 91 (70,5%) случае.
Использование методов молекулярной диагностики позволило выявить 288 микроорганизмов с преимущественным выделением ДНК КНС в 160 (55,6%), Streptococcus
spp. — в 57 (19,8%) и Enterococcus spp. — в 48 (16,7%) случаях.
Микроорганизмы на объектах внутрибольничной среды были обнаружены как
в изолированном виде, так и в виде ассоциаций. Достоверно чаще сочетания различных микроорганизмов выявлялись с помощью молекулярно-биологического
метода по сравнению с бактериологическим методом: 30,9±2,8% против 13,5±1,2%
(p<0,05). В ассоциациях микроорганизмов доминирующими являлись следующие
сочетания: КНС с Enterococcus spp. — в 33,3±4,6% и КНС с Pseudomonas spp. — в
27,8±3,8% случаев. Методом молекулярной диагностики чаще всего обнаруживали
комбинации таких микроорганизмов как КНС и Streptococcus spp. — 24,7±1,2%,
КНС и Enterococcus spp. — 14,6±2,6% и КНС, Streptococcus spp. и Enterococcus spp. —
39,3±1,5%.
Частота выделения эпидемиологически значимых микроорганизмов, относящихся к группе ESCAPE, составила 22,7±4,3% с использованием бактериологического метода и 41,3±3,2% — при молекулярно-биологическом тестировании (p<0,05).
Наиболее часто выделялись Enterococcus spp. (6,0% и 16,7%), а также Staphylococcus
аureus (2,6% и 3,1%), соответственно.
Достоверно чаще молекулярно-биологическим методом исследования обнаруживали ген mec A (устойчивости к метициллину) у Staphylococcus spp. — 58,1±8,7%,
чем бактериологическим методом исследовании выявляли метициллинрезистентные стафилококки (MRS) — 30,0±5,4% (p<0,05).
Также молекулярно-биологическим методом исследования в 19,4±7,2% случаев
были выявлены гены металло-β-лактамазы (VIM, NDM, IMP), тогда как бактериологическим методом металло-β-лактамазы выявлены не были (p<0,05).
Наиболее часто встречаемым микроорганизмом при использовании двух методов исследования являлся КНС, однако частота его выявления варьировала в зависимости от отделения. Совпадение результатов двух методов исследования установлено только в 65 случаях. В остальных пробах отмечено несовпадение результатов:
положительные результаты бактериологических исследований и отрицательные мо-лекулярно-биологических исследований определены в 26 случаях, а отрицательные
результаты бактериологических исследований на фоне положительных молекулярно-биологических исследований — в 95 случаях.
Проведенное исследование не позволяет дать ответ на вопрос о жизнеспособности микроорганизмов, находящихся на объектах внутрибольничной среды, однако
обнаружение ДНК возбудителей свидетельствует о том, что они в течение времени
контаминировали поверхности и могли являться источником внутрибольничного
заражения пациентов, что согласуется с результатами ранее опубликованных работ о
возможности использования ПЦР в реальном времени как метода прогнозирования
загрязнения внутрибольничной окружающей среды [14].
Таким образом, основным назначением молекулярно-биологических методов в
эпидемиологии ИСМП в ближайшее время должно стать слежение за популяционной структурой возбудителей, а также определение колонизации объектов внутрибольничной среды, как факторов их передачи, с целью оценки, прогнозирования
эпидемической ситуации и обоснования своевременного вмешательства в ход эпидемического процесса.

About the authors

O. A. Orlova

Pirogov National Medical and Surgical Center;
Gamaleya National Research Centеr of Epidemiology and Microbiology;
Central Research Institute of Epidemiology

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

T. A. Semenenko

Gamaleya National Research Centеr of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

V. G. Akimkin

Central Research Institute of Epidemiology

Email: fake@neicon.ru
Moscow Russian Federation

References

Supplementary files