Email this article Immunophenotyping of blood cells of experimental animals immunized with Brucella abortus thermoextracts
- Authors: Balakhonov S.V.1, Dubrovina V.I.1, Voitkova V.V.1, Korytov K.M.1, Barannikova N.L.1, Nikolaev V.B.1, Shkaruba T.T.1
-
Affiliations:
- Irkutsk Research Institute for Plague Control
- Issue: Vol 96, No 4 (2019)
- Pages: 25-31
- Section: ORIGINAL RESEARCHES
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/426
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-4-25-31
- ID: 426
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. To study the subpopulational structure of blood cells of the experimental animals immunized with thermoextracts (TE) of Brucella abortus in L- and S-form. Materials and methods. Total 100 certified («Vector», Novosibirsk) outbred mice were immunized with B. abortus I-206 TE in L- and S-form in 20 μg protein dose. After 1, 3, 7, 14 and 21 days of observation the phenotypes (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD69) of blood cells were detected. Results. General regularities were revealed after injection of the experimental preparations. So, B. abortus TE in L- and S-form caused the immune response that increased granulocyte number and expression of early activation marker CD69 by T- and B-lymphocytes of blood in early period of observation (1-3 days), decrease in general B-lymphocyte content in late periods of observation (7-21 days). Thus, mice received B. abortus ТE in L-form demonstrated authentically higher CD69 expression of blood lymphocyte subpopulations than mice received B. abortus ТE in S-form. Distinctions in formation of humoral immune response were revealed that probably was connected with alteration of Brucella chemical composition in the course of L-transformation. Conclusion. The investigation established that B. abortus TE in L- or S-form caused immunological reorganization in the experimental animal organisms. On the basis of the fin
Keywords
Full Text
ВВЕДЕНИЕБруцеллез — острое высокоинвазивное инфекционное заболевание с высокой
потенциальной возможностью перехода в хроническую форму. Бруцеллез характе-
ризуется длительностью протекания, трудно поддается лечению и поражает прак-
тически все органы и системы организма (опорно-двигательный аппарат, сердечно-
сосудистая, нервная системы и др.), что нередко сопровождается инвалидизацией
больного. Заболевают, как правило, люди трудоспособного возраста, профессио-
нальная деятельность которых связана с уходом за животными, переработкой сырья
и продуктов животного происхождения, а также в результате употребления инфици-
рованного мяса, молока и молочных продуктов, не прошедших достаточную терми-
ческую обработку [2]. Кроме того, особой группой риска являются дети, среди кото-
рой ежегодно регистрируются случаи впервые диагностированного бруцеллеза [1].
Несмотря на то, что по данным Роспотребнадзора за 2018 год зарегистрировано сни-
жение количества впервые выявленного бруцеллеза у людей на 12,7%, тем не менее,
эпидемиологическая обстановка по бруцеллезу рассматривается как неустойчивая в
связи с ухудшением эпизоотологической ситуации по бруцеллезу крупного рогатого
скота в регионах с развитым животноводством [9].
Важным мероприятием поддержании эпидемиологического благополучия на-
селения РФ по бруцеллезу является вакцинопрофилактика сельскохозяйственных
животных и людей. В настоящее время для вакцинации людей применяют живую
лиофилизированную вакцину из штамма Brucella abortus 19-ВА. Известно, что дан-
ный препарат обеспечивает развитие иммунитета продолжительностью до года с
максимальной напряженностью на 5-6 месяце [6]. Однако данная вакцина может
вызывать тяжелые поствакцинальные осложнения [10]. В связи с этим, актуальным
направлением исследований является оценка иммунологической эффективности
различных антигенных препаратов.
Цель работы — изучение влияния термоэкстрактов Brucella abortus в L- и S-фор-
мах на клеточный состав крови мышей.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Исследование проводили на 100 сертифицированных мышах массой 15-20 г
(НПО «Вектор», Новосибирск), содержавшихся в стандартных условиях.
В качестве объектов исследования использовали 2 препарата термоэкстрактов
(ТЭ), полученных из штамма B. abortus И-206 в L- (группа 1) и S-формах (группа 2).
Подопытным животным подкожно вводили препараты ТЭ в ранее установленной
иммунизирующей дозе 20 мкг по белку в 0,2 мл забуференного физиологического
раствора (ЗФР) pH 7,2. Контролем служили мыши, получившие ЗФР в объеме 0,2
мл — группа 3. Животных выводили из эксперимента в соответствии с Правилами
лабораторной практики в Российской Федерации (GLP). Учет результатов проводи-
ли на 1, 3, 7, 14 и 21 сутки.
Фенотип клеток крови мышей определяли методом фенотипирования с ис-
пользованием реагентов фирмы Becton Dickinson (США): CD45, CD3, CD4, CD8,
CD19, CD69 [3]. Окрашивание образцов проводили в пробирках для абсолютного
подсчета клеток BD Trucount™ и анализировали на проточном цитофлуориметре
BD FACS Canto™ II (Becton Dickinson, CШA) в программе BD Diva версии 6.0. В
каждой пробе анализировалось 10 000 событий CD45+-клеток, которые выделяли
на графике SSC/CD45. Оценивали абсолютное содержание (109 кл./л) лейкоци-
тов, в том числе гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов, а также их относитель-
ное содержание (%). В лимфоцитарном гейте определяли процентное содержание
следующих субпопуляций: общее содержание Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелпе-
ров (CD3+CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), В-лимфоцитов
(CD3—CD19+). Для оценки функционального состояния клеток крови оценивали
уровень экспрессии CD69.
Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 6.1.
Проверка нормальности количественных признаков была проведена с использова-
нием Шапиро-Уилка. Поскольку все исследуемые показатели удовлетворяли гипо-
тезе о нормальном распределении, анализ данных проводили с помощью ANOVA.
Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибке среднего.
Различия считали достоверными при уровне значимости Р<0,05.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В ходе экспериментов статистически значимых различий содержания лейко-
цитов и их популяций в крови мышей опытных групп по сравнению с контролем
выявлено не было. Абсолютное содержание лейкоцитов у экспериментальных жи-
вотных, иммунизированных ТЭ B. abortus, находилось в пределах физиологичес-
кой нормы (от 5,1 до 11,6·109 кл./л). Средние показатели абсолютного содержания
гранулоцитов в группе 1 и 2 колебались от 0,79 до 2,18х109 кл./л, лимфоцитов — от
2,0 до 7,0х109 кл./л, моноцитов — от 0,06 до 0,23х109 кл./л. Относительный уровень
основных популяций лейкоцитов у всех групп экспериментальных животных также
находился в пределах физиологической нормы: моноциты 0,7 — 2,6%; гранулоциты
10 — 41%; лимфоциты 63 — 75% [5]. Тем не менее, у мышей опытных групп на 7
сутки наблюдения отмечено повышение относительного количества гранулоцитов
(P<0,05) в среднем в 1,3 раза по сравнению с контролем (24,9±7,4%). У животных
1 группы также имело место увеличение моноцитов (3,0±0,3%, P=0,003) на 3 сутки
по сравнению с интактными животными (2,2±0,6%). Следует отметить, что у мы-
шей, получивших экспериментальные препараты, была зарегистрирована тенден-
ция (0,05>P<0,10) к снижению содержания лимфоцитов на 7 сутки наблюдения.
В случае экспериментальных животных 1 группы (ТЭ B. abortus в L-форме) тенден-
ция к снижению лимфоцитов отмечалась и на 3 сутки после введения препарата.
Наиболее чувствительным и информативным показателем протекающего вос-
палительного процесса является изменение процентного содержания Т-лимфоци-
тов, которым отводится ведущая роль при формировании иммунитета к бруцелле-
зу [13]. В ходе эксперимента у животных, иммунизированных ТЭ B. abortus в L- и
S-форме, статистически значимых изменений относительно уровня CD3+-клеток,
а также Т-хелперов не выявлено. Тем не менее, при детальном анализе динамики
содержания Т-лимфоцитов наблюдалась тенденция к повышению этих клеток на
3 сутки после введения экспериментальных препаратов мышам в среднем в 1,1 ра-
за (ТЭ B. abortus в L-форме — 62,9±4,7%; ТЭ B. abortus S-форме — 66,1±4,7%) по
сравнению с контролем (56,8±7,7%). Аналогичное наблюдение отмечено в случае
Т-хелперов. Статистически значимое повышение процентного количества цито-
токсических Т-лимфоцитов (Т-киллеров) отмечалось только у мышей 2 группы на
14 сутки после введения (13,3±1,6%) по сравнению с контролем (10,7±2,3%). Кроме
того, исследуемые препараты оказывали однонаправленный эффект на В-лимфо-
циты (CD3—CD19+), а именно, у мышей опытных групп на 7 и 14 сутки наблюде-
ния регистрировалось снижение количества данной популяции клеток в среднем в
1,5 раза по сравнению с контрольной группой (табл. 1).
При оценке функционального состояния клеток крови отмечалась тенденция
к снижению моноцитов, экспрессирующих маркер пролиферации CD69, который
проявляется на поверхности клеток уже через 2—3 часа после их стимуляции, у мы-
шей опытных групп в зависимости от введенного препарата. Так, у мышей, полу-
чивших ТЭ B. abortus в L-форме, изменение процентного содержания этих клеток
имело место на 1 (0,49±0,14%) и 3 (0,36±0,09%, P<0,01) сутки наблюдения, а у мы-
шей, получивших ТЭ B. abortus в S-форме — на 7 (0,44±0,10%), в то время как в
контрольной группе этот показатель составил 0,73±0,23 %. В случае CD69+-грануло-
цитов регистрировалось уменьшение их относительного уровня у мышей 2 группы
(0,31±0,10%, P<0,05) на 14 сутки наблюдения.
Результаты статистического анализа CD69-позитивных клеточных субпопуля-
ций лимфоцитов представлены в табл. 2, из которой видно, что все исследуемые
препараты оказывали влияние на экспрессию данного маркера Т- и В-клетками.
Так, у экспериментальных животных всех групп наблюдалось увеличение содержа-
ния CD3+CD69+, CD3+CD8+CD69+ и CD3+CD4+CD69+ клеток на 1 и 3 сутки после
иммунизации. При этом у мышей 1 группы наблюдалось более выраженное повы-
шение данных показателей (Р<0,05). Также выявлены изменения экспрессии CD69
В-лимфоцитами. В случае введения мышам ТЭ B. abortus в L-форме увеличение
CD3-CD19+
клеток отмечалось на 1 сутки, а ТЭ B. abortus в S-форме — 3 сутки на-
блюдения. Последующая динамики изменения В-лимфоцитов, экспрессирующих
CD69+, у мышей 2 группы носила фазный характер — снижения этих клеток на 7 и
21 сутки наблюдения.
Бруцеллез является распространенным зоонозным заболеванием, вызываемым
грамотрицательными бактериями Brucella sрp. и представляющим серьезную про-
блему для здравоохранения. Основным фактором распространения инфекции яв-
ляется длительное выделение бруцелл при абортах и родах у больных животных, а
также с молоком и мочой. В связи с неустойчивой эпизоотологической ситуацией
по бруцеллезу крупного рогатого скота в регионах с развитым животноводством
наиболее экономичным способом борьбы с бруцеллезом является вакцинация жи-
вотных с целью минимизации потенциального риска инфицирования человека.
В настоящее время для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого
скота на территории РФ могут применяться вакцины из штаммов B. abortus 19-ВА,
B. abortus 17/100, B. abortus 82, B. abortus 75/79-А, а для вакцинопрофилактики насе-
ления РФ с целью поддержания эпидемиологического благополучия по бруцеллезу
применяют живую лиофилизированную вакцину из штамма
B. abortus 19-ВА. Однако эти вакцины имеют множество недостатков, таких как
поствакцинальные осложнения [10], потенциальная возможность вызывать аборт у
беременных животных [4], остаточная контагиозность, влияние на диагностические
тесты и другие. Кроме того, разработаны ДНК-вакцина, субъединичные, векторные
и рекомбинантные вакцины [12], которые также имеют ряд недостатков, среди ко-
торых высокая стоимость, необходимость проведения многократной вакцинации,
низкая иммуногенная активность. В связи с этим, разработка эффективной и безо-
пасной вакцины для борьбы с бруцеллезом остается актуальной проблемой.
У людей данное заболевание приводит к развитию острого воспаления практи-
чески во все органах и часто сопровождается хронизацией инфекционного процес-
са. Известно, что для людей, больных бруцеллезом, характерно значительное изме-
нение субпопуляционного состава клеток крови [8, 11], что зависит от формы бру-
целлеза (хронический, резидуальный), от длительности заболевания и стажа работы
[8]. Следует отметить, что одной из причин хронизации бруцеллезной инфекции
является трансформация возбудителя бруцеллеза из S-формы в другие измененные
варианты, наиболее значимым из которых является L-форма [4]. Бруцеллы в L-фор-
ме представляют собой бактерии полностью или частично утратившие клеточную
оболочку, а также с существенными особенностями антигенной структуры. Нами
было проведено иммунофенотипирование клеток крови мышей, иммунизирован-
ных термоэкстрактами B. abortus в L- и S-формах, с целью оценки их иммунологи-
ческой эффективности.
В ходе исследования установлено, что введение экспериментальным животным
ТЭ B. abortus в L- или S-форме приводило к увеличению процентного содержания
гранулоцитов. В случае с ТЭ B. abortus в L-форме также отмечалось увеличением
процентного содержания моноцитов в крови. Параллельно с этим отмечалось сни-
жение числа моноцитов и гранулоцитов, экспрессирующих CD69, что, возможно,
свидетельствует о миграции активированных клеток в очаг воспаления, мобили-
зации пристеночного пула клеток и формировании клеточного иммунного ответа.
Повышение относительного содержания CD3+-, CD3+CD69+-, CD3+CD4+CD69+-
и CD3+CD4+CD69+-клеток в крови экспериментальных животных также свиде-
тельствует о формировании клеточного иммунитета. Увеличение цитотоксически
Т-лимфоцитов на последние сроки после введения ТЭ B. abortus в S-форме может
быть связано с увеличением регуляторных CD8+-клеток, обладающих иммуносуп-
рессивными функциями, способных эффективно блокировать иммунный ответ и
поддерживать иммунный гомеостаз организма [15].
При воспалительных процессах, вызываемых как внеклеточными, так и внут-
риклеточными патогенами, важную роль играют гуморальный и клеточный имму-
нитет. Адекватное соотношений между ними способствует эффективной элими-
нации патогена. Для оценки гуморального иммунитета диагностическое значение
имеет относительное количество В-лимфоцитов. Интересным является факт, что
на первые сутки после введения ТЭ B. abortus в L-форме экспериментальным жи-
вотным имело место увеличение CD19+CD69+ популяции клеток, что указывает
на наличие Т-независимых антигенов в составе термоэкстракта. Кроме того, оба
препарата приводили к снижению содержания В-лимфоцитов на поздних сроках
течения воспалительного процесса. В случае ТЭ B. abortus в S-форме также име-
ло место увеличение CD19+CD69+-клеток на 3 сутки наблюдения с последующим
их снижением что, возможно, связано с перераспределением B-лимфоцитов и
формированием гуморального иммунного ответа. Ранее в результате гистологи-
ческого исследования нами было продемонстрировано увеличение интенсивнос-
ти процесса пролиферации антителообразующих клеток в лимфатических узлах
и селезенке, которая была более выражены у мышей, иммунизированных ТЭ B.
abortus в S-форме.
Таким образом, проведенные исследования показали, что термоэкстракты
B. abortus в L- или S-форме приводят к иммунологической перестройке организма
экспериментальных животных, что согласуется с ранее полученными нами данны-
ми [7, 14]. Выявлены общие закономерности при введении исследуемых препаратов.
Так, ТЭ B. abortus в L- и S-форме приводят к формированию иммунного ответа,
который проявляется увеличением содержания гранулоцитов и экспрессии раннего
маркера активации CD69 Т- и В-лимфоцитами крови на ранних сроках наблюде-
ния (1-3 сутки), снижением общего содержания В-лимфоцитов на поздних сроках
наблюдения. При этом у мышей, получивших ТЭ B. abortus в L-форме, показатели
экспрессии CD69 субпопуляций лимфоцитов крови были достоверно выше, чем
у мышей, получивших ТЭ B. abortus в S-форме. Кроме того, выявлены различия
в формировании гуморального иммунного ответа, что, возможно, связано с изме-
нением химического состава бруцелл в процессе L-трансформации. Полученные
данные обосновывают необходимость дальнейшего изучения вопросов иммунного
ответа на ТЭ B. abortus в L- или S-форме.
×
About the authors
S. V. Balakhonov
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Russian Federation
V. I. Dubrovina
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
д.б.н.
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78, р.т. (3952)22-01-39
Russian FederationV. V. Voitkova
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Russian Federation
K. M. Korytov
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Russian Federation
N. L. Barannikova
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Russian Federation
V. B. Nikolaev
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Russian Federation
T. T. Shkaruba
Irkutsk Research Institute for Plague Control
Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Russian Federation
References
- Атаходжаева Д.Р. Клинико-иммунологическая характеристика острого бруцеллеза у детей. Запорожский медицинский журнал. 2013, 6 (81): 6-9.
- Балахонова С.В., Дубровина В.И., Токарева Л.Е., Загоскина Т.Ю., Витязева С.А., Марков Е.Ю., Старовойтова Т.П., Баранникова Н.Л., Коновалова Ж.А., Войткова В.В., Ястремская К.Ю. Бруцеллез: вопросы патогенеза и иммуногенеза. Иркутск, ООО «Принт-2», 2017.
- Войткова В.В., Дубровина В.И., Колесникова О.Б., Коновалова Ж.А., Лукьянова С.В., Бельков А.И. Методические рекомендации по выявлению фосфатидилсерина на лимфоцитах кроимышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCantoTM II. Иркутск, 2010.
- Косилов И.А., Аракелян П.К., Димов С.К., Хлыстунов А.Г. Бруцеллез сельскохозяйственных животных. Под. ред. И.А. Косилова. Новосибирск, 1999. Линева А.П. Физиологические показатели нормы животных. Справочник. М., «Аквариум» ФГУИППВ, 2003.
- Линева А.П. Физиологические показатели нормы животных. Справочник. М., «Аквариум» ФГУИППВ, 2003
- Медуницин Н.В. Вакцинология. 3-е изд., переработанное и дополненное. М.: «Триада-Х», 2010.
- Михайлов Л.М., Баранникова Н.Л., Токарева Л.Е., Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Дубровина В.И., Балахонов С.В. Изучение иммуногенных свойств термоэкстрактов из бруцелл в S- и L-формах на морских свинках. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016, 4(89): 82-86.
- Пономарева О.Г., Тархов А.Е., Ерениев С.И., Сафонов А.Д., Соколова Т.Ф., Иванова Е.А. Показатели клеточного иммунитета у больных профессионально обусловленным хроническим и резидуальным бруцеллезом. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010, 6: 25-30.
- Пономаренко Д.Г., Русанова Д.В., Куличенко А.Н. Об эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в Российской Федерации в 2016 г. и прогноз на 2017 г. Пробл. особо опасных инф. 2017, 2: 23-27. doi: 10.21055/0370-1069-2017-2-23-27.
- Цирельсон Л.Е., Желудков М.М., Кулаков Ю.К. Обзор проблем вакцинопрофилактики бруцеллеза. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2013, 3 (70): 77-81.
- Ющук Н.Д., Ахмедова М.Д., Магомедова С.А. Т- и В-клеточный иммунитет у больных бруцеллезом. Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. 2008, 3 (28): 90-92.
- Dorneles E.M., Sriranganathan N., Lage A.P. Recent advances in Brucella abortus vaccines. Vet. Res. 2015, 46(1): 76. doi: 10.1186/s13567-015-0199-7.
- Dorneles E.M., Teixeira-Carvalho A., Araъjo M.S. et al. Immune response triggered by Brucella abortus following infection or vaccination. Vaccine. 2015, 33 (31): 3659-66. doi: 10.1016/j.vaccine.2015.05.057.
- Dubrovina V.I., Balakhonov S.V., Yurieva O.V. et al. Effects of thermoextracts of Brucella S and L forms on lipid peroxidation and antioxidant defense in organs of laboratory animals. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2018, 165 (2): 239-242.
- Yu Y., Ma X., Gong R. et al. Recent advances in CD8+ regulatory T cell research. Oncol Lett. 2018, 15 (6): 8187-8194. doi: 10.3892/ol.2018.8378.
Supplementary files
