Immunophenotyping of blood cells of experimental animals immunized with Brucella abortus thermoextracts

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Бруцеллез — острое высокоинвазивное инфекционное заболевание с высокой
потенциальной возможностью перехода в хроническую форму. Бруцеллез характе-
ризуется длительностью протекания, трудно поддается лечению и поражает прак-
тически все органы и системы организма (опорно-двигательный аппарат, сердечно-
сосудистая, нервная системы и др.), что нередко сопровождается инвалидизацией
больного. Заболевают, как правило, люди трудоспособного возраста, профессио-
нальная деятельность которых связана с уходом за животными, переработкой сырья
и продуктов животного происхождения, а также в результате употребления инфици-
рованного мяса, молока и молочных продуктов, не прошедших достаточную терми-
ческую обработку [2]. Кроме того, особой группой риска являются дети, среди кото-
рой ежегодно регистрируются случаи впервые диагностированного бруцеллеза [1].
Несмотря на то, что по данным Роспотребнадзора за 2018 год зарегистрировано сни-
жение количества впервые выявленного бруцеллеза у людей на 12,7%, тем не менее,
эпидемиологическая обстановка по бруцеллезу рассматривается как неустойчивая в
связи с ухудшением эпизоотологической ситуации по бруцеллезу крупного рогатого
скота в регионах с развитым животноводством [9].
Важным мероприятием поддержании эпидемиологического благополучия на-
селения РФ по бруцеллезу является вакцинопрофилактика сельскохозяйственных
животных и людей. В настоящее время для вакцинации людей применяют живую
лиофилизированную вакцину из штамма Brucella abortus 19-ВА. Известно, что дан-
ный препарат обеспечивает развитие иммунитета продолжительностью до года с
максимальной напряженностью на 5-6 месяце [6]. Однако данная вакцина может
вызывать тяжелые поствакцинальные осложнения [10]. В связи с этим, актуальным
направлением исследований является оценка иммунологической эффективности
различных антигенных препаратов.
Цель работы — изучение влияния термоэкстрактов Brucella abortus в L- и S-фор-
мах на клеточный состав крови мышей.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Исследование проводили на 100 сертифицированных мышах массой 15-20 г
(НПО «Вектор», Новосибирск), содержавшихся в стандартных условиях.
В качестве объектов исследования использовали 2 препарата термоэкстрактов
(ТЭ), полученных из штамма B. abortus И-206 в L- (группа 1) и S-формах (группа 2).
Подопытным животным подкожно вводили препараты ТЭ в ранее установленной
иммунизирующей дозе 20 мкг по белку в 0,2 мл забуференного физиологического
раствора (ЗФР) pH 7,2. Контролем служили мыши, получившие ЗФР в объеме 0,2
мл — группа 3. Животных выводили из эксперимента в соответствии с Правилами
лабораторной практики в Российской Федерации (GLP). Учет результатов проводи-
ли на 1, 3, 7, 14 и 21 сутки.
Фенотип клеток крови мышей определяли методом фенотипирования с ис-
пользованием реагентов фирмы Becton Dickinson (США): CD45, CD3, CD4, CD8,
CD19, CD69 [3]. Окрашивание образцов проводили в пробирках для абсолютного
подсчета клеток BD Trucount™ и анализировали на проточном цитофлуориметре
BD FACS Canto™ II (Becton Dickinson, CШA) в программе BD Diva версии 6.0. В
каждой пробе анализировалось 10 000 событий CD45+-клеток, которые выделяли
на графике SSC/CD45. Оценивали абсолютное содержание (109 кл./л) лейкоци-
тов, в том числе гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов, а также их относитель-
ное содержание (%). В лимфоцитарном гейте определяли процентное содержание
следующих субпопуляций: общее содержание Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелпе-
ров (CD3+CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), В-лимфоцитов
(CD3—CD19+). Для оценки функционального состояния клеток крови оценивали
уровень экспрессии CD69.
Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 6.1.
Проверка нормальности количественных признаков была проведена с использова-
нием Шапиро-Уилка. Поскольку все исследуемые показатели удовлетворяли гипо-
тезе о нормальном распределении, анализ данных проводили с помощью ANOVA.
Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибке среднего.
Различия считали достоверными при уровне значимости Р<0,05.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
В ходе экспериментов статистически значимых различий содержания лейко-
цитов и их популяций в крови мышей опытных групп по сравнению с контролем
выявлено не было. Абсолютное содержание лейкоцитов у экспериментальных жи-
вотных, иммунизированных ТЭ B. abortus, находилось в пределах физиологичес-
кой нормы (от 5,1 до 11,6·109 кл./л). Средние показатели абсолютного содержания
гранулоцитов в группе 1 и 2 колебались от 0,79 до 2,18х109 кл./л, лимфоцитов — от
2,0 до 7,0х109 кл./л, моноцитов — от 0,06 до 0,23х109 кл./л. Относительный уровень
основных популяций лейкоцитов у всех групп экспериментальных животных также
находился в пределах физиологической нормы: моноциты 0,7 — 2,6%; гранулоциты
10 — 41%; лимфоциты 63 — 75% [5]. Тем не менее, у мышей опытных групп на 7
сутки наблюдения отмечено повышение относительного количества гранулоцитов
(P<0,05) в среднем в 1,3 раза по сравнению с контролем (24,9±7,4%). У животных
1 группы также имело место увеличение моноцитов (3,0±0,3%, P=0,003) на 3 сутки
по сравнению с интактными животными (2,2±0,6%). Следует отметить, что у мы-
шей, получивших экспериментальные препараты, была зарегистрирована тенден-
ция (0,05>P<0,10) к снижению содержания лимфоцитов на 7 сутки наблюдения.
В случае экспериментальных животных 1 группы (ТЭ B. abortus в L-форме) тенден-
ция к снижению лимфоцитов отмечалась и на 3 сутки после введения препарата.
Наиболее чувствительным и информативным показателем протекающего вос-
палительного процесса является изменение процентного содержания Т-лимфоци-
тов, которым отводится ведущая роль при формировании иммунитета к бруцелле-
зу [13]. В ходе эксперимента у животных, иммунизированных ТЭ B. abortus в L- и
S-форме, статистически значимых изменений относительно уровня CD3+-клеток,
а также Т-хелперов не выявлено. Тем не менее, при детальном анализе динамики
содержания Т-лимфоцитов наблюдалась тенденция к повышению этих клеток на
3 сутки после введения экспериментальных препаратов мышам в среднем в 1,1 ра-
за (ТЭ B. abortus в L-форме — 62,9±4,7%; ТЭ B. abortus S-форме — 66,1±4,7%) по
сравнению с контролем (56,8±7,7%). Аналогичное наблюдение отмечено в случае
Т-хелперов. Статистически значимое повышение процентного количества цито-
токсических Т-лимфоцитов (Т-киллеров) отмечалось только у мышей 2 группы на
14 сутки после введения (13,3±1,6%) по сравнению с контролем (10,7±2,3%). Кроме
того, исследуемые препараты оказывали однонаправленный эффект на В-лимфо-
циты (CD3—CD19+), а именно, у мышей опытных групп на 7 и 14 сутки наблюде-
ния регистрировалось снижение количества данной популяции клеток в среднем в
1,5 раза по сравнению с контрольной группой (табл. 1).
При оценке функционального состояния клеток крови отмечалась тенденция
к снижению моноцитов, экспрессирующих маркер пролиферации CD69, который
проявляется на поверхности клеток уже через 2—3 часа после их стимуляции, у мы-
шей опытных групп в зависимости от введенного препарата. Так, у мышей, полу-
чивших ТЭ B. abortus в L-форме, изменение процентного содержания этих клеток
имело место на 1 (0,49±0,14%) и 3 (0,36±0,09%, P<0,01) сутки наблюдения, а у мы-
шей, получивших ТЭ B. abortus в S-форме — на 7 (0,44±0,10%), в то время как в
контрольной группе этот показатель составил 0,73±0,23 %. В случае CD69+-грануло-
цитов регистрировалось уменьшение их относительного уровня у мышей 2 группы
(0,31±0,10%, P<0,05) на 14 сутки наблюдения.
Результаты статистического анализа CD69-позитивных клеточных субпопуля-
ций лимфоцитов представлены в табл. 2, из которой видно, что все исследуемые
препараты оказывали влияние на экспрессию данного маркера Т- и В-клетками.
Так, у экспериментальных животных всех групп наблюдалось увеличение содержа-
ния CD3+CD69+, CD3+CD8+CD69+ и CD3+CD4+CD69+ клеток на 1 и 3 сутки после
иммунизации. При этом у мышей 1 группы наблюдалось более выраженное повы-
шение данных показателей (Р<0,05). Также выявлены изменения экспрессии CD69
В-лимфоцитами. В случае введения мышам ТЭ B. abortus в L-форме увеличение
CD3-CD19+
клеток отмечалось на 1 сутки, а ТЭ B. abortus в S-форме — 3 сутки на-
блюдения. Последующая динамики изменения В-лимфоцитов, экспрессирующих
CD69+, у мышей 2 группы носила фазный характер — снижения этих клеток на 7 и
21 сутки наблюдения.
Бруцеллез является распространенным зоонозным заболеванием, вызываемым
грамотрицательными бактериями Brucella sрp. и представляющим серьезную про-
блему для здравоохранения. Основным фактором распространения инфекции яв-
ляется длительное выделение бруцелл при абортах и родах у больных животных, а
также с молоком и мочой. В связи с неустойчивой эпизоотологической ситуацией
по бруцеллезу крупного рогатого скота в регионах с развитым животноводством
наиболее экономичным способом борьбы с бруцеллезом является вакцинация жи-
вотных с целью минимизации потенциального риска инфицирования человека.
В настоящее время для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого
скота на территории РФ могут применяться вакцины из штаммов B. abortus 19-ВА,
B. abortus 17/100, B. abortus 82, B. abortus 75/79-А, а для вакцинопрофилактики насе-
ления РФ с целью поддержания эпидемиологического благополучия по бруцеллезу
применяют живую лиофилизированную вакцину из штамма
B. abortus 19-ВА. Однако эти вакцины имеют множество недостатков, таких как
поствакцинальные осложнения [10], потенциальная возможность вызывать аборт у
беременных животных [4], остаточная контагиозность, влияние на диагностические
тесты и другие. Кроме того, разработаны ДНК-вакцина, субъединичные, векторные
и рекомбинантные вакцины [12], которые также имеют ряд недостатков, среди ко-
торых высокая стоимость, необходимость проведения многократной вакцинации,
низкая иммуногенная активность. В связи с этим, разработка эффективной и безо-
пасной вакцины для борьбы с бруцеллезом остается актуальной проблемой.
У людей данное заболевание приводит к развитию острого воспаления практи-
чески во все органах и часто сопровождается хронизацией инфекционного процес-
са. Известно, что для людей, больных бруцеллезом, характерно значительное изме-
нение субпопуляционного состава клеток крови [8, 11], что зависит от формы бру-
целлеза (хронический, резидуальный), от длительности заболевания и стажа работы
[8]. Следует отметить, что одной из причин хронизации бруцеллезной инфекции
является трансформация возбудителя бруцеллеза из S-формы в другие измененные
варианты, наиболее значимым из которых является L-форма [4]. Бруцеллы в L-фор-
ме представляют собой бактерии полностью или частично утратившие клеточную
оболочку, а также с существенными особенностями антигенной структуры. Нами
было проведено иммунофенотипирование клеток крови мышей, иммунизирован-
ных термоэкстрактами B. abortus в L- и S-формах, с целью оценки их иммунологи-
ческой эффективности.
В ходе исследования установлено, что введение экспериментальным животным
ТЭ B. abortus в L- или S-форме приводило к увеличению процентного содержания
гранулоцитов. В случае с ТЭ B. abortus в L-форме также отмечалось увеличением
процентного содержания моноцитов в крови. Параллельно с этим отмечалось сни-
жение числа моноцитов и гранулоцитов, экспрессирующих CD69, что, возможно,
свидетельствует о миграции активированных клеток в очаг воспаления, мобили-
зации пристеночного пула клеток и формировании клеточного иммунного ответа.
Повышение относительного содержания CD3+-, CD3+CD69+-, CD3+CD4+CD69+-
и CD3+CD4+CD69+-клеток в крови экспериментальных животных также свиде-
тельствует о формировании клеточного иммунитета. Увеличение цитотоксически
Т-лимфоцитов на последние сроки после введения ТЭ B. abortus в S-форме может
быть связано с увеличением регуляторных CD8+-клеток, обладающих иммуносуп-
рессивными функциями, способных эффективно блокировать иммунный ответ и
поддерживать иммунный гомеостаз организма [15].
При воспалительных процессах, вызываемых как внеклеточными, так и внут-
риклеточными патогенами, важную роль играют гуморальный и клеточный имму-
нитет. Адекватное соотношений между ними способствует эффективной элими-
нации патогена. Для оценки гуморального иммунитета диагностическое значение
имеет относительное количество В-лимфоцитов. Интересным является факт, что
на первые сутки после введения ТЭ B. abortus в L-форме экспериментальным жи-
вотным имело место увеличение CD19+CD69+ популяции клеток, что указывает
на наличие Т-независимых антигенов в составе термоэкстракта. Кроме того, оба
препарата приводили к снижению содержания В-лимфоцитов на поздних сроках
течения воспалительного процесса. В случае ТЭ B. abortus в S-форме также име-
ло место увеличение CD19+CD69+-клеток на 3 сутки наблюдения с последующим
их снижением что, возможно, связано с перераспределением B-лимфоцитов и
формированием гуморального иммунного ответа. Ранее в результате гистологи-
ческого исследования нами было продемонстрировано увеличение интенсивнос-
ти процесса пролиферации антителообразующих клеток в лимфатических узлах
и селезенке, которая была более выражены у мышей, иммунизированных ТЭ B.
abortus в S-форме.
Таким образом, проведенные исследования показали, что термоэкстракты
B. abortus в L- или S-форме приводят к иммунологической перестройке организма
экспериментальных животных, что согласуется с ранее полученными нами данны-
ми [7, 14]. Выявлены общие закономерности при введении исследуемых препаратов.
Так, ТЭ B. abortus в L- и S-форме приводят к формированию иммунного ответа,
который проявляется увеличением содержания гранулоцитов и экспрессии раннего
маркера активации CD69 Т- и В-лимфоцитами крови на ранних сроках наблюде-
ния (1-3 сутки), снижением общего содержания В-лимфоцитов на поздних сроках
наблюдения. При этом у мышей, получивших ТЭ B. abortus в L-форме, показатели
экспрессии CD69 субпопуляций лимфоцитов крови были достоверно выше, чем
у мышей, получивших ТЭ B. abortus в S-форме. Кроме того, выявлены различия
в формировании гуморального иммунного ответа, что, возможно, связано с изме-
нением химического состава бруцелл в процессе L-трансформации. Полученные
данные обосновывают необходимость дальнейшего изучения вопросов иммунного
ответа на ТЭ B. abortus в L- или S-форме.

About the authors

S. V. Balakhonov

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Россия

V. I. Dubrovina

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

д.б.н.

664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78, р.т. (3952)22-01-39

Россия

V. V. Voitkova

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Россия

K. M. Korytov

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Россия

N. L. Barannikova

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Россия

V. B. Nikolaev

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Россия

T. T. Shkaruba

Irkutsk Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
664047, Иркутск, ул. Трилиссера, 78 Россия

References

Supplementary files