SCIENTIFIC AND METHODOLOGICAL SUPPORT FOR DEVELOPMENT OF PATHOGENIC MICROORGANISM COLLECTION OF VOLGOGRAD RESEARCH INSTITUTE FOR PLAGUE CONTROL

Full Text

Коллекции патогенных микроорганизмов играют важную роль в целом ряде ме-
роприятий, направленных на обеспечение санитарно-эпидемиологического благо-
получия населения. Изучение свойств возбудителей инфекционных заболеваний
необходимо при мониторинге территорий в случае природно-очаговых инфекций и
расследовании путей завоза и распространения на неэндемичных для них регионах.
К направлениям совершенствования деятельности учрежденческих коллекций
патогенных микроорганизмов относятся: оптимизация существующих методов и раз-
работка новых технологий консервации, использование современных методов фено-
типической и молекулярно-генетической паспортизации, внедрение новых инфор-
мационных технологий каталогизации, паспортизации и учета движения патогенных
штаммов, а также формирование универсальной единой базы данных.
Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа (Burkholderia mallei)
относятся к микроорганизмам II группы патогенности (опасности) и являются по-
тенциальными агентами биотерроризма группы В [9, 25, 33].
Роль B. pseudomallei и B. mallei в инфекционной заболеваемости человека и не-
которых животных рассматривается, главным образом, в связи с существованием
эндемичных регионов и появлением завозных случаев инфекций. Сап — зоонозная
антропургическая инфекция, регистрируемая в Монголии, Турции, Иране, Ираке,
странах Аравийского полуострова, Китае, Индии, Индонезии, Филиппинах [33].
Случаи заражения человека связаны с профессиональной деятельностью: ветеринары,
работники мясоперерабатывающих предприятий, сотрудники лабораторий, дресси-
ровщики лошадей. B. pseudomallei входит в состав микробиоты почвы и воды стоячих
водоемов. К странам, где распространен возбудитель мелиоидоза, относятся Индия,
Шри-Ланка, Филиппины, Индонезия, Таиланд, Сингапур, Вьетнам, Малайзия,
Бирма, Бразилия, Пуэрто-Рико, страны Тихоокеанского региона, Иран и Австралия.
В исследовании Sarovich D.S. et al., показано распространение B.pseudomallei в мире
с указанием эндемичности мелиоидоза также и для Африки [30]. В США, странах
Европы встречаются спорадические случаи этого заболевания у людей, прибывших
с эндемичных территорий [18]. Так, в 2016 г. был зарегистрирован случай заражения
мелиоидозом во Франции у туриста, прибывшего из Вьетнама [23].
Потенциальная возможность завоза мелиоидоза и сапа на территорию Российской
Федерации, а также опасность преднамеренного использования B.pseudomallei и
B.mallei в качестве средства биологического терроризма диктует необходимость на-
личия представительной коллекции охарактеризованных штаммов этих микроорга-
низмов как базы для проведения исследований (изучения свойств возбудителей,
разработки и испытания средств диагностики, внедрения современных методов и
новых технологий и др.).
Коллекция микроорганизмов Волгоградского научно-исследовательского проти-
вочумного института Роспотребнадзора входит в перечень биологических и генети-
ческих коллекций РФ (http://www.sevin.ru/collections/microorganisms.html) и вклю чает
14 штаммов B.mallei, выделенных в различных географических регионах (Монголия,
Югославия, Венгрия, Польша, Индия, Индонезия), и 59 штаммов B.pseudomallei
(Вьетнам, Австралия, Таиланд), полученных в 1970 — 1980 гг. прошлого столетия из
научно-исследовательских учреждений Советского Союза. Штаммы возбудителя
мелиоидоза и сапа содержатся и в коллекциях микроорганизмов США, Велико-
британии, Бразилии, Венесуэлы, Таиланда и Малайзии, а также в государственных
коллекциях патогенных бактерий РФ (Российский научно-исследовательский про-
тивочумный институт «Микроб», ГКПМ, Оболенск). Основная роль в изучении
данных видов микроорганизмов в РФ отводится Волгоградскому научно-
исследовательскому противочумному институту Роспотребнадзора, на базе которого
функционирует «Референс-центр по мониторингу за возбудителями сапа и мелиои-
доза» — координирующий, консультативно-методический, учебный, диагностиче -
ский и экспертный орган по вопросам индикации, экспресс-диагностики, иденти-
фикации и типирования B.pseudomallei и B.mallei на территории Российской
Федерации.
Технологии консервации. Первостепенной задачей коллекции микроорганизмов
является сохранение штаммов в неизменном состоянии в течение длительного пе-
риода времени. Это осуществляется чаще всего с помощью методов сублимационно-
го высушивания или криоконсервации при низких температурах (-20–85°С), каждый
из которых имеет преимущества и недостатки [12].
Лиофилизация (сублимационное высушивание, замораживание-высушивание)
— широко распространенный способ высушивания биоматериалов из замороженно-
го состояния, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда,
что позволяет полностью сохранять первичную структуру объекта. В зависимости от
способа размещения биопрепаратов при высушивании различают сублимационные
установки коллекторного и камерного типа [12].
Процесс лиофилизации представляет собой стрессовый фактор, вызывающий у
микробных клеток ряд различных изменений [2]. Отмечено, что после 24 лет хранения
в ампулах в лиофилизированном состоянии штаммы возбудителя сапа при высеве на
питательные среды оставались жизнеспособными. Однако с увеличением сублима-
ционных циклов высушивания наблюдалось снижение окислительной активности
штаммов B.mallei по отношению к глюкозе, а также потеря протеолитической способ-
ности по отношению к желатине, зависящей от сроков хранения штамма [4].
Аналогично, вакцинный штамм Francisella tularensis 15 НИИЭГ после 60 лет хранения
в лиофилизированном состоянии при высеве на питательные среды всё еще сохранял
жизнеспособность, однако характеризовался снижением иммуногенных свойств и
незначительными изменениями в геноме [13]. Такой длительный срок хранения кол-
лекционных штаммов с сохранением в целом основных свойств является преимуще-
ством рассматриваемого метода. Однако используемая для этого установка
К.Е.Долинова морально и физически устарела, но до сих пор является единственной,
на которую имеется регламентирующий документ федерального уровня «Инструкция
по лиофильному высушиванию возбудителей инфекционных заболеваний I — IV
групп на коллекторном аппарате системы К.Е.Долинова». Современные аппараты
для лиофильного высушивания предназначены для консервирования биологическо-
го и фармацевтического материала и не имеют регламентирующих документов, раз-
решающих их использование в работе с микроорганизмами I — IV группы патоген-
ности. Кроме того, современные установки не могут полностью обрабатываться
дезинфектантами и не подлежат автоклавированию.
В исследовании по оценке возможности применения различных сублимационных
систем для лиофилизации патогенных микроорганизмов бактериальной природы
было установлено, что препараты, полученные на трех лиофильных сушках коллек-
торного типа (аппарат системы К.Е.Долинова, Martin Christ Alpha 1-4 LDplus и Heto
Power Dry), сохраняют максимальное количество жизнеспособных клеток в процессе
хранения. Показатели выживаемости у штаммов, высушенных на этих аппаратах,
находились в интервале от 97,3 до 98,7%. При этом биопрепараты, полученные с по-
мощью современной установки Heto Power Dry, обладали максимальным прогнози-
руемым сроком хранения до 105 лет [11]. В работе Червяковой Н.С. и др. получены
данные по лиофилизации во флаконах при помощи современной сушки камерного
типа Martin Christ Epsilon 2-6D штаммов III — IV группы патогенности. Авторы ука-
зывают на недостатки камерной системы из-за наличия жизнеспособных клеток
микроорганизмов на рабочих поверхностях лиофильной камеры, что обусловливает
высокий риск создания аварийной ситуации с ПБА. Для обеспечения биологической
безопасности необходимо модернизировать данное инженерно-техническое обору-
дование с возможностью проводить дезенфекцию камеры в автоматическом режиме
до момента ее разгерметизации. В то же время, показатели жизнеспособности клеток,
лиофилизированных с помощью камерной сушки Martin Christ Epsilon 2-6D, зависе-
ли от вида микроорганизмов и были в целом ниже, чем у препаратов, лиофилизиро-
ванных на системах коллекторного типа [15].
В Волгоградском НИПЧИ для сублимационного высушивания микроорганизмов
IV группы патогенности используется лиофильная сушка коллекторного типа нового
поколения CoolSafe 110 Freeze Dryer. К преимуществам данной системы следует от-
нести короткий временной цикл лиофилизации (2,5 ч) и возможность обработки
дезинфектантами ее составляющих частей; к недостаткам — ограниченное количество
ампул, получаемых за один цикл работы (16) и риск возможной аварии с ПБА на
этапе их запаивания в ручном режиме. Для использования этого метода консервации
патогенных микроорганизмов необходима инженерно-техническая модернизация
системы CoolSafe 110 Freeze Dryer, обеспечивающая биологическую безопасность на
всех этапах работы. Кроме того, также необходимо создание регламентирующих до-
кументов, разрешающих использование данной системы для работы с микроорганиз-
мами I — IV группы патогенности с утверждением их на федеральном уровне.
Известно, что лиофилизированные культуры и в ампулах, и во флаконах необхо-
димо хранить в темноте при 1 — 4°С. При комнатной температуре и тем более при
30°С наблюдается быстрое отмирание клеток [5]. Поэтому для данного способа хра-
нения микроорганизмов необходимо наличие системы основного и резервного холо-
дильного оборудования в лаборатории коллекции.
Низкотемпературная консервация по сравнению с лиофилизацией для хранения
микроорганизмов более универсальна в связи с наличием и доступностью оборудо-
вания — низкотемпературных холодильников. Однако данный способ предполагает
наличие системы постоянного температурного контроля, аварийной сигнализации с
уведомлением об изменении температурного состояния, системы охлаждения по-
мещения хранилища, дублированное энергоснабжение, а также резервные морозиль-
ные камеры. Кроме того, время хранения биоматериала при этих температурах также
ограничено. Длительность хранения бактерий при этом зависит от биологических
особенностей штамма и от условий замораживания и хранения (скорость охлаждения-
оттаивания, температура и среда культивирования). По данным Gibson L.F. и Khoury
J.T., в холодильнике при температуре -70°C время хранения разных видов бактерий
колебалось в пределах 12 — 40 месяцев [24]. По данным De Paoli P. метод криокон-
сервации при низких температурах позволял сохранять бактериальные клетки без
пересевов до 10 лет [20]. Результаты исследований по хранению штаммов патогенных
микроорганизмов в государственной коллекции Роспотребнадзора показывают, что
штаммы Vibrio cholerae, Francisella tularensis, Brucella abortus устойчивы к заморажи-
ванию и хранению при -70°C с использованием оптимальной среды и в присутствии
криопротекторов [3, 7]. Для холерных вибрионов наиболее высокая выживаемость с
сохранением основных диагностических признаков наблюдалась при применении
лактозо-желатиновой среды, для штаммов возбудителя туляремии и бруцеллеза —
сахарозо-желатиновой среды и бульона Альбими с 10% глицерином. При этом уста-
новлено некоторое снижение количества жизнеспособных клеток как на этапе за-
мораживания, так и в процессе хранения.
В целом, оба описанных метода сохранения референтных штаммов патогенных
микроорганизмов необходимы для одновременного использования в коллекциях.
Культуры в лиофилизированном состоянии в виде ампул/флаконов удобны для транс-
портировки при передаче из учреждения в учреждение, а также в качестве резервно-
го многолетнего источника штаммов в замороженном состоянии — для оперативной
повседневной деятельности (выдача в структурные подразделения, изучение свойств
и т.д.).
Современные методы фенотипической и молекулярно-генетической паспортизации.
Важным направлением деятельности коллекций микроорганизмов является установ-
ление таксономической принадлежности штаммов и подтверждение их аутентичности
в процессе воспроизводства. Систематика бактерий постоянно обновляется и совер-
шенствуется, в связи с чем существует необходимость в периодическом проведении
номенклатурной ревизии штаммов коллекций. Нередки случаи, когда штамм, иден-
тифицированный по фенотипическим свойствам классическими методами как
определенный вид, при более детальном изучении оказывался иной видовой принад-
лежности [10, 14]. Внедрение в лабораторную практику новых методов и технологий
обусловливает применение их как для верификации видовой принадлежности кол-
лекционных штаммов, так и для изучения их свойств [10]. Поэтому в крупных между-
народных коллекциях и государственных коллекциях патогенных микроорганизмов
РФ для подтверждения аутентичности референтных штаммов сегодня используется
ряд современных автоматических технологий, в частности биохимическое профили-
рование с применением микробиологических анализаторов, масс-спектрометрия по
технологии MALDI-ToF, рибопринтинг, фрагментарное, мультилокусное и полно-
геномное секвенирование [10].
В 2012 г. 20 лабораторий, представляющих государственные, промышленные и
частные испытательные центры США, провели масштабные совместные испытания
по оценке идентификационной возможности тест-карты Gram-negative (GN) микро-
биологической системы VITEK 2 «bioMerieux» (Франция) по идентификации 720
культур микроорганизмов, включая Brucella melitensis, F.tularensis, B. mallei, B. pseudo
mallei и Yersinia pestis. В результате видовая принадлежность 707 штаммов была
определена верно, что позволило сделать вывод о приемлемости анализатора VITEK
2 GN для быстрой идентификации [17].
В РосНИПЧИ «Микроб» с помощью микробиологического анализатора VITEK
2 проводилось подтверждение аутентичности референтных штаммов патогенных
микроорганизмов, при этом было установлено, что некоторые из них не соответство-
вали видовой принадлежности, указанной в паспортных данных [10, 14].
Однако диагностические возможности любой современной системы идентифи-
кации ограничены полнотой сведений, заложенных в базу данных (БД) прибора.
Идентификационные ключи для отдельных видов микроорганизмов II группы пато-
генности либо отсутствуют в БД анализатора VITEK 2, либо представлены в ограни-
ченном количестве. В связи с этим, штаммы Brucella suis 1330 и B. abortus 19ВА были
определены только до рода [14]. Кроме того, штаммы, имеющие особенности в своем
профиле биохимической активности, не совпадающим с заложенным стандартом,
могут быть неверно идентифицированы. Так, авторы ряда работ указывали, что кли-
нические изоляты возбудителя мелиоидоза бактериологический анализатор VITEK 2
в некоторых случаях идентифицировал как виды комплекса Burkholderia cepacia, а
бактерий возбудителя сапа как виды Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas putida,
что было связано со спецификой биохимического профиля отдельных штаммов [27,
29, 36]. В исследовании Van den Beld M.J. et al. при идентификации бактерий
Pseudomonas brenneri, Pseudomonas gessardii или Pseudomonas proteolytica, выделенных
из промышленных вод в Нидерландах, автоматический анализатор VITEK 2 опреде-
лил как вид F. tularensis [32]. Проведенная расширенная характеристика по биохими-
ческой активности коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза
Волгоградским НИПЧИ с помощью данного анализатора показала, что 31 из 40
штаммов возбудителя мелиоидоза и 8 из 12 штаммов возбудителя сапа обладали ти-
пичным биохимическим профилем и были идентифицированы верно с вероятностью
90 — 99%. Остальные штаммы имели определенные особенности в биохимическом
профиле, что обусловливало их идентификацию как виды комплекса B. cepacia или
Sphingomonas paucimobilis. Для правильной идентификации системой VITEK 2 куль-
тур возбудителя мелиоидоза решающее значение имело наличие β-N-ацетилглюко-
заминидазной и β-N-ацетилгалактозаминидазной активности и отсутствие актив-
ности фермента целлобиазы, для культур возбудителя сапа — неспособность к
утилизации сахарозы и D-трегалозы, наличие активности L-пролинариламидазы и
тирозинариламидазы, отсутствие глицинариламидазной активности [8].
В целом, использование системы VITEK 2 позволяет проводить паспортизацию
по биохимическим свойствам микроорганизмов. Вместе с тем, для применения дан-
ного анализатора в коллекциях очевидна необходимость расширения его БД иденти-
фикационными ключами по отдельным видам микроорганизмов II группы патоген-
ности.
Еще одним современным методом идентификации и биотипирования микроор-
ганизмов является времяпролетная масс-спектрометрия с матрично-активированной
лазерной десорбцией/ионизацией. На данный момент для идентификации патогенных
микроорганизмов во многих лабораториях применяют аппаратно-программные ком-
плексы MALDI Biotyper «Bruker» (США) и S.A.R.A.M.I.S.™ «Anagnostec Gmbh»
(Германия), основанные на использовании MALDI-ToF масс-спектрометров линеек
Microflex™ «Bruker» (США) и Axima™ «Shimadzu» (Япония) соответственно.
Идентификационные БД содержат масс-спектры порядка 5 тыс. видов микроорга-
низмов, но референсные масс-спектры возбудителей особо опасных инфекций в
коммерческих сборках БД представлены в ограниченном количестве. В связи с этим,
на практике встречались случаи неправильной идентификации штаммов возбудителя
сапа и мелиоидоза [26]. Wang H. et al. (2016) в своем исследовании указали на отсут-
ствие масс-спектров B. pseudomallei в текущей версии базы данных системы Bruker
Biotyper (DB 5627), что затрудняло идентификацию клинических изолятов возбуди-
теля мелиоидоза. Внесение только что полученных в работе масс-спектров изучаемых
штаммов в базу данных MALDI-TоF MS (включая масс-спектры трех штаммов, не-
правильно определенных анализатором как виды B. putida и комплекса B. cepacia)
обусловило их верную 100% идентификацию как вид B. pseudomallei со значением
Score >2,000.
В работе Лопастейской Я.А. и др. приведены результаты исследования по допол-
нению БД S.A.R.A.M.I.S.™, «Anagnostec Gmbh» (Германия) масс-спектрами клеточных
белков 10 референтных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза коллекции
Волгоградского НИПЧИ для повышения эффективности дальнейшей идентифика-
ции. В результате проведенной работы все коллекционные штаммы B.pseudomallei и
B. mallei были корректно идентифицированы до вида, а в их паспорта были внесены
масс-спектрометрические белковые профили с их детальным анализом пиков с
определенными молекулярными массами (3780, 4815, 5202, 6560, 7090, 7560, 9624 и
10460 Da), характерными для этих видов [6].
В 2014 году были утверждены методические рекомендации «Использование ме-
тода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной
десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбу-
дителей I — II групп патогенности». В этом документе отражены такие разделы, как
культивирование исследуемых штаммов, получение из них белковых препаратов,
снятие спектров, дополнение базы данных спектрами референтных штаммов, про-
ведение идентификации, интерпретация полученных результатов. Представленный
унифицированный алгоритм позволяет проводить экспресс-идентификацию и хемо-
типирование микроорганизмов — возбудителей опасных инфекционных заболеваний
и стандартизует результаты, полученные методом масс-спектрометрии.
Для паспортизации коллекционных штаммов микроорганизмов необходима пол-
ная характеристика не только фенотипических свойств, но и их генотипов.
Универсального алгоритма молекулярно-генетической паспортизации не существует.
Полиморфность геномов таких видов как Vibrio cholerae, B. pseudomallei и Y. pestis
позволяет использовать большинство известных методов для их типирования. Выбор
методов исследования определяется возможностями каждой отдельной лабораторией.
Генотипы одних и тех же референтных штаммов, хранящихся в различных коллекци-
ях, зачастую охарактеризованы с помощью разных методов и поэтому не поддаются
сопоставлению.
Из всего многообразия методов генотипирования микроорганизмов, в отношении
изолятов патогенных буркхольдерий наиболее эффективными оказались VAT, DFR,
MLVA, MLST и полногеномное секвенирование. Метод амплификации дифферен-
цирующих фрагментов ДНК используют для генетической паспортизации, внутри-
видового дифференцирования и анализа филогенетических взаимоотношений штам-
мов B. pseudomallei с определением наличия 14 локусов и B. mallei с определением
наличия 9 локусов [1, 21]. При использовании метода MLVA для типирования штам-
мов возбудителя мелиоидоза определяют число тандемных повторов в 23 вариабель-
ных локусах [31] или в четырех, по упрощенной системе [19], для типирования штам-
мов возбудителя сапа — в 6 локусах [31]. Метод мультилокусного сиквенс-типирования
(MLST) применяется для выяснения географической принадлежности коллекционных
штаммов [30]. Для некоторых микроорганизмов, в том числе для возбудителя сапа,
метод MLST малоэффективен, так как у штаммов B. mallei было зарегистрировано
всего лишь два сиквенс-типа (www.mlst.net).
Для стандартизации получаемых результатов в рамках государственного сани-
тарно-эпидемиологического нормирования РФ учреждениями Роспотребнадзора
совместно разработаны методические указания «Порядок молекулярного типирова-
ния возбудителей особо опасных инфекционных болезней на базе Референс-центров
и Национальных центров верификации диагностической деятельности». Данный
документ определяет объем молекулярно-генетических исследований и методические
основы получения характеристик для каждого вида патогенных микроорганизмов I-II
группы, а также требования к организации и оснащению лабораторий. Таким образом,
согласно методическим указаниям для генетической паспортизация штаммов воз-
будителя мелиоидоза показано использовать методы VAT, MLVA и MLST/полноге-
номное секвенирование, для штаммов возбудителя сапа — DFR, MLVA и полноге-
номное секвенирование.
Формирование универсальной единой базы данных. В 1960-х годах Всемирная феде-
рация коллекций культур (WFCC, http://www.wfcc.info) инициировала разработку
международной базы данных о мировых биоресурсах. Был создан Всемирный центр
данных микроорганизмов (WDCM, www.wdcm.org), содержащий информацию о кол-
лекциях в мире (CCINFO, http://www.wfcc.info/ccinfo/home/), представленную в
виде глобального (GCM) и справочного каталогов микроорганизмов (РКК) и про-
граммы по сбору и анализу информации о штаммах из внешних источников (АВС)
[28]. GCM на данный момент содержит информацию о более, чем 368 000 штаммах
из 708 коллекций из 72 стран и регионов всего мира [34, 35]. В этих каталогах на те-
кущий момент отображены 25 коллекций РФ.
В 1985 году была создана Микробная информационная сеть Европы (MINE),
инициированная структурными подразделениями коллекций микроорганизмов
Германии, Нидерландов, Великобритании, Бельгии и Португалии [Gams W. et al.,
1990]. В результате была создана первая крупная многонациональная модель общего
каталога, который охватывал все микроорганизмы включая вирусы. Ключевой осо-
бенностью этой информационной системы было определение общих минимальных
универсальных наборов данных, включающих приблизительно 60 характеристик,
таких как таксономию, физиологические и биохимические свойства, географическое
происхождение, среды культивирования и т.д. [22], [Stalpers J.A. et al., 1990]. К сожа-
лению, краткосрочный характер финансирования не дал этому направлению даль-
нейшего развития. С 2000 г. с целью объединения и обеспечения всеобщего доступа
к фрагментированным ресурсам, информации и экспертным знаниям, имеющимся
в европейских общественных коллекциях микроорганизмов, была создана общеев-
ропейская научно-исследовательская инфраструктура (MIRRI), включающая более
40 коллекций общественных фондов и исследовательских институтов из 19 европей-
ских стран. Ключевым компонентом данной структуры является разработка дина-
мичной информационной системы. На сегодня отдельные каталоги различных кол-
лекций стран Европы доступны в режиме онлайн и взаимодействуют друг с другом,
продвигаясь к созданию совместимых баз данных. Этому во многом способствует
создание инфраструктуры исследований микробиологических ресурсов (MIRRI,
http://www.mirri.org/) [16].
В России коллекции, обеспечивающие хранение генетических и биологических
ресурсов, представлены самостоятельными специализированными организациями
— ботаническими садами РАН, структурными подразделениями научно-иссле-
довательских организаций (коллекции микроорганизмов и клеточных культур, рабо-
чими коллекциями лабораторий, ведущих исследования в области генетики и селек-
ции, а также рядом организаций, для которых хранение генетического материала не
является основной функцией (питомники, зверофермы, зоопарки и т.п.). Эти орга-
низации принадлежат различным ведомствам (в т.ч. РАН, Минсельхоз, Минобразо-
вания и науки, Минздрав, Минобороны, Роспотребнадзор и др.). В 2004 г. была соз-
дана информационная система, состоящая из каталога-перечня коллекций РФ (92
коллекции биологических и генетических ресурсов различных организаций) и объ-
единенный каталог микроорганизмов Российских коллекций немедицинского про-
филя, http://www.sevin.ru/collections/microorganisms.html. Открытый каталожный
фонд ВКМ (www.vkm.ru) представлен микроорганизмами более 750 родов и 3300 ви-
дов и превосходит по таксономическому разнообразию каталогизированные фонды
других микробных коллекций РФ. Сведения по культурам открытого фонда ВКМ
включены в электронный сводный каталог российских коллекций и WFCC Global
Catalogue of Microorganisms (GCM — gcm.wfcc.info/).
Во всех учреждениях Роспотребнадзора, на базе которых имеются структурные
подразделения коллекций патогенных микроорганизмов, разработано информаци-
онное сопровождение оперативной коллекционной деятельности. Информация в
базах данных достаточно разнородна и зависит, в частности, от исходных данных по
единицам хранения, предназначения коллекции, наличия инструментов информа-
ционных технологий и персонала. Такая гетерогенность каждой конкретной коллек-
ции как по содержанию, так и по формату затрудняет информационный взаимо-
обмен.
В настоящий момент в рамках унификации коллекционной деятельности в учреж-
дениях Роспотребнадзора разрабатывается «Положение об обеспечении коллекцион-
ной деятельности в области патогенных микроорганизмов». Целью данного докумен-
та является создание единой формы учетной документации, единого алгоритма
выборки изолятов, подлежащих хранению, единой процедуры паспортизации кол-
лекционного штамма и общего электронного каталога патогенных микроорганизмов
для обеспечения информационного взаимообмена между структурами этого ведом-
ства.
В Волгоградском НИПЧИ создан электронный каталог (Microsoft Excel) коллек-
ционных штаммов патогенных микроорганизмов и база данных (Microsoft Access)
«Коллекционные штаммы патогенных буркхольдерий ФКУЗ Волгоградский научно-
исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора» (государственная
регистрация № 2017620285).
Главной задачей при создании БД являлось проектирование такой системы, ко-
торая была бы достаточно гибкой и позволяла в дальнейшем включать в нее новые
разделы. При разработке структуры базы данных учитывалась необходимость отра-
жения всего многообразия свойств и связей рассматриваемых объектов, обеспечения
быстрого и удобного способа получения информации. Созданная БД является реля-
ционной и представляет собой систему связанных таблиц, каждая из которых описы-
вает определенную информационную категорию, определяемую рядом характерных
признаков. Наиболее значимыми являются категории «штамм», «фенотипические
свойства» и «генотипические свойства», каждая из которых несет определенную
функциональную информацию. Большое значение имеют подразделы, выполненные
в форме справочников и описывающие биохимические свойства и особенности ге-
нетических характеристик. В них характеризуются свойства, важные для определения
таксономического положения штамма и его практического использования.
Разработанная структура БД позволяет хранить и отображать разнообразную ин-
формацию о содержащихся объектах, формализованную, текстовую и графическую
информацию, а также документы, созданные другими приложениями. Структу-
рированная таким образом информация по коллекционным штаммам B.pseudomallei
и B. mallei представляет единую систему, обеспечивающую быстрый переход между
логически связанными объектами, целенаправленный отбор объектов и их групп по
определенным признакам и упрощает повседневную оперативную деятельность кол-
лекции. Вместе с тем, очевидна необходимость создания ежегодно обновляемого
единого каталога коллекционных штаммов организаций держателей государственных
и учрежденческих коллекций Роспотребнадзора.
В обзоре рассмотрены основные направления совершенствования коллекционной
деятельности. Для сохранения коллекционных штаммов в виде лиофилизированных
культур необходима разработка регламентирующих документов, определяющих по-
рядок использования современных аппаратов для сублимационного высушивания
микроорганизмов I — IV группы патогенности, а также мер по соблюдению требова-
ний биологической безопасности и снижения риска возникновения аварии с ПБА. В
случае применения метода низкотемпературной консервации необходимо наличие
системы постоянного температурного контроля низкотемпературных холодильников,
аварийной сигнализации с уведомлением об изменении температурного состояния,
системы охлаждения помещения хранилища, дублированное основное энергоснаб-
жение и аварийное от дизельного генератора, а также резервные морозильные каме-
ры. Проведение ревизии с подтверждением таксономической принадлежности
штаммов и паспортизации коллекций патогенных буркхольдерий необходимо осу-
ществлять с использованием современных автоматических бактериологических
анализаторов, например VITEK 2, метода MALDI ToF масс-спектрометрии, а также
методов исследования генома: VAT, MLVA и MLST/полногеномное секвенирование
— для B.pseudomallei, DFR, MLVA и полногеномное секвенирование — для B. mallei.
Создание единого электронного каталога реализовано в программе Microsoft Excel, а
базы данных — Microsoft Access, как универсального и доступного информационно-
го обеспечения.

About the authors

E. V. Molchanova

Volgograd Research Institute for Plague Control

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

к.б.н.,

400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7

(8442)37-37-74

Russian Federation

N. P. Ageeva

Volgograd Research Institute for Plague Control

Email: fake@neicon.ru
Russian Federation

References

Supplementary files