ANTIMICROBIC MECHANISMS OF NEUTROPHILES AS PERSPECTIVE TARGETS FOR PHARMACOLOGICAL MODULATION OF NON-SPECIFIC PROTECTION OF THE ORGANISM

Full Text

Несмотря на то, что фагоцитарная гипотеза была предложена еще в 1883 году
И.И.Мечниковым, значение нейтрофильных гранулоцитов в защите организма оста-
ется недооцененным. Долгое время нейтрофилы считались пассивными участниками
эффекторного звена иммунной системы. Однако многочисленные исследования по-
казали, что это наиболее активные и многочисленные фагоцитарные клетки, которые,
препятствуя инфицированию организма хозяина, могут использовать как фагоцитоз,
так и дегрануляцию, а также генерировать нейтрофильные внеклеточные ловушки
(NETs).
Первой реакцией на микробную инвазию организма является покидание нейтро-
филами сосудистого русла и их миграция к очагу инфицирования. Этот процесс со-
стоит из трех основных этапов: инициирование адгезии нейтрофилов к активирован-
ным эндотелиальным клеткам, проникновение через сосудистую стенку и их
миграция к месту заражения.
Процесс фагоцитоза протекает в несколько этапов: хемотаксис к микроорганизму,
распознавание рецепторов, активация клеток, всасывание и переваривание патогена
[1]. Хемотаксис — направленная миграция лейкоцитов в ткани хозяина в ответ на
инфекцию и воспаление. Градиент концентрации хемоаттрактанта определяет на-
правленное движение фагоцитов. Исследова тели определяют две группы хемоаттрак-
тантов как эндогенных, так и экзогенных [3]. Молекулы, высвобождаемые при гибе-
ли клеток, биоактивные пептиды (лейкотриен LTB4), хемокины (IL-8, CXCL2,
CXCL1), провоспалительные цитокины (IL-1β, TNF-α), продуцируемые стромаль-
ными, эпителиальными и иммунными клетками, также могут быть хемоаттрактанта-
ми [7].
При инфицировании организма эндотоксины попадают в кровь, извлекаясь через
клеточные мембраны бактерий или при разрушении патогена. После этого они рас-
познаются LPS-связывающим белком (LBP), циркулирующим в сыворотке крови и
относящимся к острофазным белкам. Полученный белково-рецепторный комплекс
LBP-LPS связывается с провоспалительными рецепторными комплексами, располо-
женными на поверхности нейтрофилов, содержащих Toll-подобный рецептор 4
(TLR4), кластер дифференцировки 14 (cD14) и миелоидный фактор дифференциров-
ки 2 (MD-2). Дальнейший иммунный ответ организма инициируется с участием
внутриклеточного TiR-домена сигнального рецептора и цитозольного адаптацион-
ного белка MyD88 [46].
Узнавание микроорганизмов нейтрофилами основано на обнаружении микро-
организмов с использованием классов поверхностных и внутриклеточных рецепторов.
Нейтрофилы распознают посторонние объекты с использованием PRR [11]. В орга-
низме человека наиболее значимыми нейтрофильными структурами подобного типа
являются Toll-подобные рецепторы (TLRs): TLR1, TLR2, TLR3, ... TLR10. Эти рецеп-
торы имеют существенное родство в структуре и механизме действия. Каждый из TLRs
связывается с его высококонсервативным микробным лигандом для распознавания.
Лиганд является специфическим для больших групп микроорганизмов. TLRs также
связываются с многочисленными эндогенными лигандами, которые образуются при
повреждении собственных тканей организма (фибриноген, белки теплового шока и
др.). Например, липопептиды являются лигандами для TLR1, а пептидогликаны
грамположительных и грамотрицательных бактерий являются лигандами для TLR2,
эндотоксин грамотрицательных бактерий — лиганд для TLR4 [34]. Связывание TLRs
со специфическими лигандами приводит к активации нейтрофилов, замедляет их
апоптоз и индуцирует секрецию цитокинов.
Опсонизация патогенов с участием классических опсонинов IgG и c3b и рецеп-
торов нейтрофилов Fcγ (FcγRI, FcγRII, FcγRIII) и лектинов C-типа (маннозные ре-
цепторы, лектины, мутантные рецепторы) является мощным усилителем активности.
Фагоцитоз неэффективен в отсутствие опсонизации патогена [7, 11, 46]. Однако при
взаимодействии нейтрофилов с биопленками микробов опсонизация патогена не
требуется, так как в матриксе содержатся вещества, которые активируют нейтрофилы
[22].
Процесс разрушения инфекционных объектов нейтрофилами зависит от трех
основных механизмов: 1) связанного с рецептором поглощения патогена с образова-
нием вакуоли; 2) продуцирование в вакуолях высокотоксичных активных форм кис-
лорода (ROS); 3) слияние вакуолей с нейтрофильными гранулами, содержащими
различные антимикробные компоненты, с образованием фагосомы [12].
Далее образуется фаголизосома путем слияния фагосомы и содержимого гранул
нейтрофилов (внутриклеточная дегрануляция). Внутриклеточное «переваривание»
инфекционных агентов реализуется в результате активации двух сложных механизмов
внутриклеточного уничтожения. Микроорганизмы внутри фаголизосомы уничтожа-
ются действием содержимого гранул, таких как дефенсины, кателицины, катепсины,
пентаксины и лактоферрин, при кислород-независимом механизме киллинга [36,
43].
Окислительное уничтожение основывается исключительно на производстве
противомикробных ROS с помощью NADPH-оксидазного комплекса (NOX). Этот
процесс также называют «респираторным взрывом», потому что потребление глюко-
зы и кислорода увеличивается в несколько раз в течение нескольких секунд [43].
NOX инициирует окислительный или респираторный взрыв, превращая кислород
в супероксид, который с помощью супероксиддисмутаз расщепляет перекись водо-
рода. Перекись водорода, в свою очередь, используется миелопероксидазой (MPO)
для образования более токсичных ROS [11]. ROS одинаково токсичны как для объ-
ектов фагоцитоза, так и для нейтрофилов. Поэтому перекись водорода может быть
превращена в воду под действием каталазы [36]. Кроме того, миелопероксидаза пре-
вращает перекись водорода в хлорноватистую кислоту, которая обладает мощной
антимикробной активностью и является аутокринным регулятором активации ней-
трофилов [13].
Респираторный взрыв изменяет экспрессию ряда генов, в результате чего грану-
лоцит подвергается апоптозу после фагоцитоза. Другая форма программированной
гибели нейтрофилов, возникающая после фагоцитоза — некроз, при котором нару-
шается целостность внешней мембраны и теряется сегментация ядра. Некроз связан
с влиянием факторов бактериальной патогенности, которые вызывают повреждение
и гибель нейтрофилов [2].
В результате контакта опсонизированного объекта с мембраной фагоцита фаго-
сомы и гранулы сливаются. Для максимальной эффективности пищеварения это
происходит в определенной последовательности [36, 37]. Процесс поглощения опсо-
низированных частиц при нейтрофильном фагоцитозе происходит менее чем за 20
секунд [40]. Однако микробные клетки в биопленках менее доступны для фагоцито-
за, чем отдельные клетки, называемые «планктонными» клетками. Когда нейтрофи-
лы взаимодействуют с биопленками Staphylococcus aureus in vitro, почти полное от-
торжение двухдневной биопленки происходит в течение 45-минутного воздействия.
Это является следствием разрушения внеклеточного матрикса ферментативными
продуктами фагоцитов, а также прямого фагоцитоза биопленки стафилококков ней-
трофилами. Исследования показали, что внеклеточный матрикс биопленок (неза-
висимо от таксономической принадлежности образующих их микроорганизмов)
содержит структуры, ослабляющие фагоцитарные реакции [9].
Биопленка — уникальное сообщество микробов, закрепленных на поверхности
или между собой, заключенных в матрикс полимерных веществ, выделяемых клетка-
ми. Микробам в биопленке свойственен модифицированный фенотип, характери-
зующийся иными параметрами роста и экспрессии специфических генов [8]. Таким
образом, свойства свободноживущих планктонных клеток и микроорганизмов, вхо-
дящих в биопленку, существенно различаются. Например, клетки бактерий в био-
пленке обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным факторам окру-
жающей среды, включая влияния различных антимикробных агентов [6, 21]. В этом
случае биопленки вносят отрицательные свойства в инфекционный процесс: повто-
ряющийся курс, склонность к хронизации, устойчивость к традиционным антибио-
тическим препаратам.
Популяция клеток в бактериальной биопленке неоднородна. Бактерии, которые
образуют биопленки, могут быть как сессильными (находясь в составе самой био-
пленки), так и планктонными (при их дисперсии из биопленки). Планктонные бак-
терии могут впоследствии образовывать новые биопленки, то есть входить в сессиль-
ную форму, когда они фиксируются на биотическом или абиотическом субстрате [10].
Согласно исследованиям, клетки, высвобождаемые из биопленки, могут быть осо-
бенно эффективными при активации воспалительных и антиген-представляющих
клеток и индуцировании клеточного апоптоза, а также вызывать более высокую про-
дукцию провоспалительных цитокинов [26]. Вместе с быстрорастущими бактериями
существуют так называемые «persisters» — особый тип микробных клеток, в которых
замедляются обменные процессы, что помогает биопленке переживать неблагопри-
ятные условия. Клетки-persisters формируются из свободноплавающих бактерий. Эти
клетки повышают устойчивость к антибиотикам, что значительно усложняет лечение
бактериальных инфекций [10, 44].
Структура биопленок включает бактериальные клетки (от 5 до 35% от общего
объема биопленки), часто разных видов, могут присутствовать клетки грибов и виру-
сов. Основной объем занят слизистым межклеточным слоем, называемым матриксом
биопленки или внеклеточным полимерным веществом. Матрикс состоит из полиме-
ров мукополисахаридов и белков. Кроме того, матрикс включает липополисахариды,
протеогликаны, гликопротеины, эндополисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты
и ионы металлов [8, 10]. Нуклеиновые кислоты представлены внеклеточной ДНК
(eDNA) [23]. Химический состав матрикса отличается для разных микроорганизмов.
Большинство бактерий в качестве экзополисахарида содержат либо линейный гомо-
гликан β-1,6-N-ацетилглюкозамин, либо целлюлозу. Некоторые микроорганизмы
одновременно синтезируют несколько внеклеточных полисахаридов, включая β-1,6-
N-ацетилглюкозамин, целлюлозу и колановую кислоту [6]. Даже в пределах вида
состав внеклеточного полимерного матрикса может быть разнообразным: например,
полисахариды различных штаммов термофильного стрептококка имеют различные
мономерные композиции, коэффициенты и различные молекулярные массы [35].
Биопленка формируется в несколько этапов: первичная адгезия из окружающей
среды, фиксация или окончательное (необратимое) прикрепление, созревание
(созревание-I), рост (созревание-II), дисперсия (распространение).
По-видимому, нейтрофилы действуют на биопленку на начальных стадиях ее об-
разования и на планктонные клетки в момент их распространения из биопленки.
Когда образуется биопленка, клетки иммунной системы образуют физический барьер
на поверхности биопленки. В этих местах накопления нейтрофилов их внутрикле-
точное содержимое (AMP, ROS и провоспалительные вещества) часто выделяется,
нанося вред поверхностным слоям биопленки, а также тканям хозяина [29].
Дегрануляция нейтрофилов является одним из процессов экзоцитоза, в результа-
те чего нейтрофильные гранулы сливаются с цитоплазматической мембраной, вы-
свобождая арсенал ферментов, антимикробных пептидов и других молекул в окру-
жающие ткани [11]. Вокруг активированных нейтрофилов в результате дегрануляции
образуется мощная протеолитическая среда, которая необходима для хемотаксиса
иммунных клеток и развития защитной воспалительной реакции [5].
Все типы гранул нейтрофила различаются по составу и обеспечивают антимикроб-
ную функцию нейтрофилов. В своих гранулах нейтрофилы содержат более 50 соеди-
нений: ферменты, пептиды, рецепторы, а также в процессе активации образуют
токсические метаболиты кислорода, азота, липидов, цитокинов и антицитокинов,
вторичные продукты протеолиза [4]. Гранулы делятся на четыре типа: первичные
(азурофильные), возникающие в процессе дифференцировки на стадии промиело-
цита; вторичные (специфические), возникающие при трансформации нейтрофилов
в миелоциты; третичные или желатиназные гранулы [25]; секреторные (везикулы),
появляющиеся в зрелых сегментированных формах [14]. Содержимое гранул высво-
бождается в цитоплазму и в межклеточное пространство строго детерминировано.
Интен сивность этого процесса регулируется структурными изменениями актинового
цитоскелета, которые зависят от ответа клеточных рецепторов на внешнее стимули-
рование сигнала [5].
Дегрануляция инициируется активацией нейтрофилов молекулярными паттерна-
ми грамотрицательных бактерий (липополисахаридов, ЛПС) и сопровождается се-
крецией провоспалительных цитокинов [39] при киллинге опсонизированных микро-
организмов или взаимодействии с белками внеклеточного матрикса, такими как
фибронектин, коллаген и ламинин [47]. В качестве маркера дегрануляционной актив-
ности нейтрофилов используется ряд количественных показателей, таких как увели-
чение внеклеточной активности эластазы, снижение внутриклеточного содержимого
первичных гранул, содержащих эластазу и сериновые протеазы [33], увеличение
уровня ПМН-эластаза/альфа1-протеиназа ингибиторов (PMN-E/alpha1-PI) в плазме
[20].
Нейтрофилы используют дегрануляцию вместе с фагоцитозом против биопленок
[29]. Jesaitis et al. [30] обнаружили, что нейтрофилы оседали на биопленках Pseudomonas
aeruginosa, где они подвергались дегрануляции, лишались подвижности из-за
потери своих псевдоподий, и показывали изменение в структуре мембраны на сторо-
не, прилегающей к бактериям. В присутствии бактерий опсонизированных сыворот-
кой миелопероксидаза высвобождалась в среду. Выделение миелопероксидазы сопро-
вождалось высвобождением другого компонента первичной гранулы, β-глюкуро -
нидазы. Лактоферрин, составляющий специфические гранулы нейтрофилов,
высвобождался после контакта нейтрофилов с опсонизированными и неопсонизи-
рованными сывороткой биопленками, предотвращал образование биопленок P.
aeruginosa путем повышения подвижности адгезивных бактерий [30]. Meyle et al. на-
блюдали дегрануляцию как ответ на биопленки S. aureus, что подтверждалось изме-
рением высвобожденного лактоферрина и эластазы [38].
Морфологические изменения, происходящие в нейтрофильных гранулоцитах и
отличающиеся от процесса апоптоза и некроза, были описаны Takei H. et al. в 1996
году [45]. В 2004 году Brinkmann V. et al. доказали существование внеклеточных лову-
шек нейтрофилов (NETs) и установили их антимикробный эффект в качестве важно-
го звена врожденного иммунитета [15]. Результаты многочисленных научных иссле-
дований и наблюдений подтвердили и расширили первоначальные суждения о роли
NETs в патогенезе бактериальных, вирусных, протозойных и грибковых инфекций.
Некоторое время цель создания нейтрофильных внеклеточных ловушек была не со-
всем ясна, но вскоре после того, как это свойство было обнаружено в тучных клетках
и эозинофилах, стало понятно, что эти большие внеклеточные структуры обеспечи-
вают физический барьер против микробного распространения, изолируют и уни-
чтожают микробные патогены, предотвращая дальнейшую колонизацию организма-
хозяина [17]. В настоящее время стратегия NETs прочно утвердилась в качестве
одного из основных биологических механизмов, используемых нейтрофилами при
инфекционных заболеваниях. Кроме того, нейтрофильные внеклеточные ловушки
вовлечены во многие воспалительные и аутоиммунные нарушения и участвуют в
регуляции неинфекционных процессов [16, 32]. Феномен формирования NETS —
перспективная для изучения форма программируемой клеточной гибели (нетоз).
NETs состоят из деконденсированных волокон хроматина, покрытых антимикроб-
ными гранулированными и цитоплазматическими белками, такими как миелоперок-
сидаза, нейтрофильная эластаза (NE), α-дефенсины [42], положительно заряженные
гистоновые белки ( в 100 раз больше бактерицидной активности, чем у дефенсинов),
а также различные ферменты и белки — более 30 компонентов [24].
Результаты многолетних исследований позволили установить механизмы образо-
вания внеклеточных ловушек нейтрофилов. На данный момент существуют данные
о трех моделях формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек. Первая модель
рассматривается как suicidal NETosis, длительностью 2 — 4 часа. Это наиболее опи-
санная модель нетоза, как формы программированной гибели клеток, связанная с
нарушением целостности плазматической мембраны и высвобождением деконден-
сированного хроматина и содержимого гранул во внеклеточное пространство [27].
Эта модель NETosis зависит от NADPH-оксидазы и характеризуется изменением
морфологии ядра, которое теряет свою специфическую структуру.
После связывания белково-рецепторного комплекса LBP-LPS с провоспалитель-
ными рецепторными комплексами, расположенными на поверхности нейтрофилов,
кальциевые хранилища эндоплазматического ретикулума выделяют Са++ в цито-
плазму (стадия 1). Повышенный уровень цитоплазматического кальция активирует
семейство протеин киназы C (protein kinase C, PKC), которое непосредственно от-
вечает за активацию NADPH-оксидазы. NOX генерирует ROS и, в частности, супе-
роксидные ионы. Генерация ROS приводит к разрыву гранул и ядерной оболочки
(стадия 2). NE и MPO, обычно хранящиеся в азурофильных гранулах, мигрируют в
ядро. NE разрушает линкер гистонов H1 и обрабатывает основные гистоны. В это же
время катионы Ca++ действуют как кофакторы для пептидил-аргинин-деиминазы 4
(PAD4). Преобразование некоторых остатков аргинина в цитруллины в основных
гистонах с помощью PAD4 исключает положительный заряд из этого остатка и, таким
образом, ослабляет связывание гистонов с ДНК, способствуя деконденсации хрома-
тина. MPO усиливает деконденсацию хроматина (стадия 3) [24, 49]. Наконец, нити
цитоскелета сокращаются, цитоплазматическая мембрана теряет свою целостность,
и активные вещества в виде молекулярного облака высвобождаются во внеклеточное
пространство, формируя NETs. Это приводит к гибели клетки (стадия 4) [15].
Вторая модель формирования нейтрофильных ловушек — vital NETosis [48].
Остается открытым вопрос, можно ли считать этот процесс настоящим нетозом, по-
скольку после высвобождения NETs нейтрофилы все еще способны фагоцитировать
патогены, и продолжительность их жизни не зависит от потери ДНК. Pilsczek F. et al.
обнаружили диффузные структуры NETs, сформированные уже через 5 мин после
инкубации с S.aureus. NETs были выпущены через небольшую область на поверхности
нейтрофилов. Со временем NETs заполнили всю область обзора, и NETs из несколь-
ких нейтрофилов слились. Признаков лизиса нейтрофилов авторы не обнаружили
[41]. Byrd А. S. et al. сообщили, что наблюдали высвобождение NETs через 30 минут
осле контакта нейтрофилов с Candida albicans, обработанных фибронектином.
Фибронектин подавлял продуцирование ROS [19], что указывает на отличие между
этой моделью образования внеклеточных нейтрофильных ловушек и суицидальным
нетозом. Из-за короткого периода времени, необходимого для формирования NETs,
этот процесс также был назван быстрый нетоз.
После стимуляции S. aureus нейтрофилы подверглись массивному расширению
между внутренней и внешней ядерными мембранами, называемому blebbing. Внутри
этого разделения ядерной мембраны были пряди ДНК со связанными нуклеосомами,
имевшие ультраструктурный вид «бисера на струне». Позднее в цитоплазме активи-
рованных нейтрофилов наблюдались везикулы, отпочкованные из ядерной оболочки,
в просвете которых были «бусины на струне» нитей ДНК. Но разрушение ядерной
мембраны не было очевидным. Эти везикулы высвобождались во внеклеточное про-
странство, где они затем лизировались, а их содержимое формировало NETs.
Некоторые цитоплазматические гранулы также высвобождались во внеклеточное
пространство или сливались с плазматической мембраной, при этом содержимое
гранул и ДНК везикул смешивалось во внеклеточном пространстве. Полное разру-
шение ядерной оболочки чаще всего наблюдалось через 60 мин, и ДНК заполняла
цитоплазму. Но это не приводило к гибели нейтрофила [41] .
Третья модель рассматривается как альтернативный механизм vital NETosis, кото-
рый связан с образованием внеклеточных нейтрофильных ловушек из митохондри-
альной ДНК интактных нейтрофилов при индукции ROS. Везикулы, выпущенные из
митохондрий во внеклеточное пространство, содержат ДНК, которые собираются в
NETs. Исследования Yousefi S. et al. показали, что в высвобожденной из клетки ДНК
были обнаружены только митохондриальные гены, что указывало на то, что активи-
рованные нейтрофилы специфически выделяют митохондриальную ДНК. Также как
vital NETosis с выделением ядерной ДНК, этот механизм требует активации нейтро-
филов, протекает быстро (уже через 15 — 20 минут после активации) и не связан с
гибелью клеток [50].
Независимо от модели образования нейтрофильные внеклеточные ловушки пред-
ставляют собой большие внеклеточные структуры с электростатическим зарядом [18]
и сильно локализованной бактериальной активностью. Они способны обеспечивать
физиологический барьер, предотвращать распространение микроорганизмов и уве-
личивать интерстициальную локализацию противомикробных веществ, что в конеч-
ном итоге инактивирует факторы бактериальной патогенности [16]. Микроорга -
низмы, попавшие в ловушки, теряют мобильность и впоследствии устраняются
макрофагами. Исследования показали влияние NETs на планктонные формы грам-
положительной и грамотрицательной флоры, грибков, на внутриклеточные микро-
организмы, а также на простейших, которые во много раз больше нейтрофилов [17,
18, 28, 49]. Имеются данные об образовании NETs при взаимодействии нейтрофилов
и биопленок S. epidermidis [22].
С биопленками C. albicans ситуация несколько отличается. Johnson C. et al. [31]
исследовали реакцию нейтрофилов во время роста биопленки C. albicans. В отличие
от планктонных C. albicans, биопленки вызывали незначительное высвобождение
внеклеточных ловушек нейтрофилов. После опознавания биопленки нейтрофилы
округлились и стали прилипать к гифам. Через 1 час нейтрофилы были явно прикре-
плены к гифам и демонстрировали расширенные филоподии, часто растягивающие-
ся на несколько гиф. Однако через 4 ч нейтрофилы снова оказались округлыми и
неактивными. Нейтрофилы оставались жизнеспособными в это время, но очень не-
многие из них выпустили NETs. По мнению авторов, матрикс биопленки C. albicans
ингибирует высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов, способствуя укло-
нению от иммунитета и обеспечивая преимущество выживания [31].
Таким образом, в настоящее время общепризнаны 3 механизма антибактериаль-
ной защиты нейтрофилов: фагоцитоз, дегрануляция, формирование нейтрофильных
внеклеточных ловушек (NETs). Открытие NETs произошло благодаря развитию
молекулярных биологических методов и улучшению качества методов визуали -
зации. Образование NETs характеризуется выбросом генетического материала с со-
держимым цитоплазмы и гранул на скопление крупных патогенов, формированием
сетеподобных фибриновых структур. Номенклатурный комитет по клеточной гибели
(NCCD) в 2009 году рекомендовал феномен формирования NETs считать новой фор-
мой ПКГ под названием нетоз (NETosis). Антибактериальные стратегии нейтрофилов
рассматриваются как перспективное направление для фармакологических модуляций
в условиях нарастающей резистентности к традиционной антибиотической тера-
пии.

About the authors

E. V. Matosova

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Russian Federation

B. G. Andryukov

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology

Email: fake@neicon.ru
Vladivostok Russian Federation

References

Supplementary files