STUDY OF CXCL12, CCR4, EGFR GENE EXPRESSION IN MIGRATING MYELOMONOBLASTIC LEUKEMIA CELLS BEFORE AND AFTER CHEMOTHERAPY

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Исследования в области онкологических заболеваний активно ведутся уже более двух столетий, однако, иммунологические аспекты опухолевой прогрессии изучают- ся совсем недавно. Важнейшими участниками онкологического процесса являются хемокины, которые участвуют не только в миграции опухолевых клеток, но также способствуют активному росту опухоли и ангиогенезу в солидные опухоли [2, 5]. По данным многочисленных исследований, показано, что такие хемокины как CXCL12, CCL2, CCL3 и CCL5 являются активными участниками ангиогенеза. CXCL12, CCL2, CCL3 и CCL5 активируют миграцию клеток-предшественников эндотелия (endothelial precursor cells — EPCs) с помощью митоген-активированных протеинкиназных путей (Janus kinase 2 (JAK2) — STAT5) и p3893, что ведет к ангио- генезу. CXCL12 также может активировать пролиферацию эндотелия сосудов через активацию рецептора CXCR4 на поверхности эндотелиальных клеток [2, 5, 6]. Другой важнейшей функцией хемокинов является способность активировать миграцию иммунных клеток в микроокружение опухоли, так называемый рекрутинг. Под действием хемокинов, в основном таких как CCL20, CXCL14,CXCL12,CCL2, CXCL8, в опухолевую ткань мигрируют антигенпрезентирующие клетки (дендрит- ные клетки, макрофаги, миелоидные супрессорные клетки, В-клетки), которые оказывают противоопухолевый эффект, подавляя активированные опухолевыми антигенами CD8+ Т-клетки [6, 7]. Показано, что хемокины участвуют в миграции опухолевых клеток. На данный момент по научным данным известно, что по меньшей мере двадцать три типа опу- холей экспрессируют CXCR4, способствуя миграции опухолевых клеток к CXCL12 по градиенту концентрации. Большинство исследований, направленных на изучение миграции опухолевых клеток к CXCL12, показывают, что повышенная экспрессия CXCR4 коррелирует с плохим прогнозом и более низким уровнем выживаемости у пациентов с онкологическими заболеваниями, в частности при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ). Однако, последние годы появляются новые данные, которые ука- зывают на неоднозначность участия CXCL12 и его рецепторов в прогрессии опухо- ли. Luke J. Drury и его коллеги (2011) обнаружили, что хемотаксис клеток зависит от олигомерного состояния хемокина: мономерный вид и мутантный димерный белок CXCL12 снижали хемотаксис опухолевых клеток, способствуя их гибели. Lorena Hernandez и ее коллеги (2011) также показали, что в зависимости от уровня экс- пресии рецепторов CXCL12 (CXCR4 и CXCR7), данный хемокин проявляет разное действие на опухолевую клетку. С учетом данных последних исследований и неоднозначности участия CXCL12 в регуляции опухолевой прогрессии в нашей работе была поставлена цель изучить влияние CXCL12 на миграцию мононуклеарных клеток, выделенных от здоровых пациентов, пациентов с миеломонобластным лейкозом до и после химиотера- пии, а также изучить экспрессию генов CCR4, EGFR, CXCL12 после воздействия CXCL12. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы Были отобраны здоровые доноры в возрасте 20-40 лет (n=10), у которых не бы- ло иммунодефицитных состояний, онкологических, аутоиммунных заболеваний, а также инфекционных заболеваний для формирования группы контроля. Во второй клинической группе были пациенты в возрасте 20-50 лет (n=5) с миеломоноблас- тным лейкозом без наличия сопутствующих инфекционных, иммунодефицитных и аутоиммунных заболеваний до и после химиотерапии цитозаром и даунорубици- ном (пациенты отделения клинической гематологии и иммунотерапии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского). Для выделения мононуклеарных клеток (МНК) использовался Diacoll-1077 (Диа-М, Россия). Для исследования хемотаксиса использовалась камера Бойдена фирмы MERCK MultiScreen Migration Invasion and Chemotaxis Filter Plate (Германия) с размерами пор 5 и 8 мкм. В качестве хемоаттрактанта использовался СXCL12 (ThermoFisher,США). В качестве контроля использовали среду RPMI-1640 (ПанЭко, РФ). Выделение РНК из клеток проводилось с помощью набора «РИБО-сорб» (ИЛС, РФ), далее проводили реакцию обратной транскрипции с помощью «Набора реагентов ОТ-1» (ИЛС, РФ) и ПЦР- РВ («Набор реагентов с SYBR Green1», Синтол, РФ) на амплификаторе ДТпрайм («ДНК-Технология», РФ). Последовательности праймеров для исследования экспрессии CCR4, EGFR, CXCL12 были получены из GeneBank (NCBI), после чего синтезированы компанией Синтол (РФ). Были выделены МНК от здоровых доноров и пациентов с миеломонобластным лейкозом до и после химиотерапии методом центрифугирования в градиенте плот- ности. На первом этапе оценивали количество мигрировавших клеток. Динамику миграции оценивали через 10, 60 мин и через сутки. В верхний отсек камеры поме- щалась взвесь клеток в объеме 60 мкл и количестве 60±1 х 103. В нижний отсек ка- меры вносили хемоаттрактант в объеме 175 мкл в концентрации 200нг/мл (СXCL12) и контроль. На втором этапе исследовалась экспрессия генов CCR4, EGFR, CXCL12 в кон- трольных образцах и активированных клетках. Уровень экспрессии оценивали от- носительно уровня β-актина. Статистический анализ проводили с использованием компьютерной статистической программой BioStat, а также программы Excel. Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е На первом этапе мы оценивали миграцию МНК от здоровых доноров и пациен- тов с миеломонобластным лейкозом. Миграция мононуклеарных клеток здоровых доноров относительно CXCL12 была достоверно выше миграции контроля в 2 раза через 60 минут и 24 часа. Миграция МНК от пациентов с миеломонобластным лей- козом до начала химиотерапии под действием CXCL12 и в контроле не имела досто- верных отличий, однако была достоверно ниже миграции клеток здоровых доноров под действием CXCL12 через 10 минут, 60 минут и 24 часа в 9 раз. Миграция МНК от пациентов после химиотерапии относительно CXCL12 была достоверно выше контроля в 1,5 раза через час, но через 10 минут и сутки достоверных отличий не было. Миграция МНК от пациентов после химиотерапии относительно CXCL12 бы- ла достоверно выше миграции МНК от пациентов до химиотерапии через 10 минут в 4 раза и совпадала с количеством миг- рировавших МНК от здоровых доноров через 10 минут. Через 60 минут мигра- ция МНК от пациентов после химиоте- рапии к CXCL12 была достоверно выше миграции МНК от пациентов до химио- терапии в 3,5 раза, однако через 24 часа достоверных отличий не было (рис.). На втором этапе оценивалась экс- прессия CCR4, EGFR, CXCL12. Экс- прессия гена CXCL12 под воздействием CXCL12 не изменялась на протяжении всего эксперимента в МНК от здоровых доноров, а также достоверно не отлича- лась от экспрессии гена CXCL12 в интак- тных клетках (в контроле).

Миграция мононуклеарных клеток пациентов с лейкозом до и после проводимой терапии по сравнению с показателями у здоровых доноров. 1 — МНК лейкоз СХСL12, 2 — МНК лейкоз контроль, 3 — МНК здоровые СХСL12, 4 — МНК контроль здоровые, 5 — МНК лейкоз после терапии СХСL12, 6 — МНК контроль после терапии.

Экспрессия гена CXCL12 в интактных МНК от па- циентов с миеломонобластным лейкозом была достоверно выше контроля через 10 минут и через 60 минут в 16 и 4 раза соответственно, достоверных отличий через 24 часа обнаружено не было. Экспрессия гена CCR4 в интактных клетках миеломонобластного лейкоза и здоровых доноров не отличается достоверно в течение 60 минут, однако экспрессия гена ССR4 в МНК миеломонобластного лейкоза достоверно увеличивается относи- тельно экспрессии в МНК от здоровых доноров в 9 раз через сутки. Экспрессия гена ССR4 в МНК миеломонобластного лейкоза под действием CXCL12 в 39 раз досто- верно выше контроля через 10 минут, достоверных отличий через час не наблюда- лось, и достоверно ниже в 5000 раз относительно контроля через 24 часа. Экспрессия гена CCR4 в МНК миеломонобластного лейкоза под действием CXCL12 достоверно выше экспрессии гена CCR4 в МНК здоровых доноров под действием CXCL12 в 4,6 раза на 10 минуте и достоверно не отличается через 60 минут и через сутки. Достоверных отличий в экспрессии гена EGFR в интактных МНК здоровых до- норов, МНК здоровых пациентов под действием CXCL12 и МНК миеломоноблас- тного лейкоза под действием CXCL12 не обнаружено. Экспрессия EGFR в интакт- ных МНК от пациентов с миеломонобластным лейкозом достоверно отличается от контроля в 17 раз на десятой минуте, однако не отличается достоверно от контроля через 60 минут и через сутки. В качестве исследуемого материала нами был выбран миеломонобластный лей- коз, так как по многочисленным исследованиям именно исход данного онкологи- ческого заболевания зависит от пары оси хемокина и рецептора CXCL12-CXCR4 [7]. Для исследования аутоактивации хемотаксиса был выбран самый значимый для данного типа опухоли хемокин — CXCL12, экспрессию гена которого мы исследо- вали. Также в качестве опосредованно экспрессируемых генов были выбраны EGFR и CCR4, так как по немногочисленным данным известно, что возможно усиление хемотаксиса через ось CXCL12-CXCR4, путем активации CCR4, когда, в свою оче- редь, активация CXCR4 может значительно повышать экспрессию EGFR, что ведет к активной пролиферации опухоли [7, 8]. Получены данные, что у пациентов с миеломонобластным лейкозом до химио- терапии спонтанная и индуцированная миграция снижена в 7 раз относительно миг- рации МНК здоровых доноров в течение всего эксперимента. После применения хи- миотерапии миграционная способность частично восстанавливается. Также показан высокий уровень экспрессии гена СXCL12 в интактных клетках миеломонобластного лейкоза, в то время как под действием хемокина экспрессия достоверно снижалась. Предположительно опухолевые клетки самостоятельно продуцируют CXCL12 в боль- шом количестве, что необходимо для нарушения межклеточных взаимодействий и дальнейшей интравазии. Стимуляция хемокином CXCL12 достоверно повышала хе- мотаксис опухолевых клеток после химиотерапии только через час, миграции МНК от пациентов до терапии достоверно не отличалась от контроля, что, скорее всего, обус- ловлено неотвечаемостью рецепторов вследствие повышенной сенситизации рецепто- ра вследствие аутоактивации выделяемым хемокином и также внешней стимуляции. Уровень экспрессии CCR4 в опухолевых клетках под действием CXCL12 момен- тально повышается через 10 минут, что может способствовать активации миграции опухолевых клеток, однако до конца не ясен механизм спонтанной экспрессии CCR4, как и EGFR, в опухолевых клетках через 24 часа. Таким образом, основываясь на ис- следованиях других ученых и полученных нами данных, можно говорить о том, что хемотаксис опухолевых клеток может происходить без внешней стимуляции путем аутоактивации, которая при определенных условиях может приводить как к гибели клетки, так и к ее распространению в зависимости от стадии опухолевого процесса. В дальнейшем планируется исследование экспрессии вышеописанных рецеп- торов в МНК миеломонобластного лейкоза после химиотерапии, а также CXCR4, CXCR7 и TLRs в МНК от здоровых доноров и от пациентов с миеломонобластным лейкозом до и после химиотерапии по направлению к CXCL12 и TLRs лигандам, что поможет более детально изучить взаимосвязь факторов врожденного иммунитета в онкологических процессах [1, 3, 4].

About the authors

A. B. Filina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,
Sechenov First Moscow State Medical University

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

O. A. Svitich

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,
Sechenov First Moscow State Medical University,
Pirogov Russian National Research Medical University

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

Yu. I. Ammur

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

A. K. Golenkov

Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institutе

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

E. F. Klinushkina

Vladimirskiy Moscow Regional Research Clinical Institutе

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

V. V. Zverev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera,
Sechenov First Moscow State Medical University

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

References

Supplementary files