Comparative analysis of adaptation properties in typical and genetically altered Vibrio cholerae El Tor strains

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
В истории холеры зарегистрировано семь пандемий, которые были вызваны
штаммами Vibrio cholerae О1 серогруппы, включающей два биовара — классический
и El Tor. Чрезвычайно вирулентные штаммы классического биовара предположительно были возбудителями первых шести пандемий. С 1961 года и по настоящее
время продолжается седьмая пандемия холеры, вызванная типичными штаммами
V. cholerae О1 биовара El Tor. Несмотря на то, что классические и El Tor вибрионы
относятся к одной О1 серогруппе, они имеют ряд фенотипических и генетических
различий, а также отличаются по выживанию во внешней среде. Классические вибрионы продуцируют больше холерного токсина (ХТ), вызывают тяжелые формы
болезни, но быстро погибают при попадании в открытые водоемы. В то же время,
El Tor вибрионы синтезируют меньше ХТ, имеют легкую клинику («мягкая» холера), но способны длительное время сохранятся во внешней среде [1]. При изучении
выживаемости классических и El Tor вибрионов методом конкурентной пробы было выявлено, что El Tor вибрионы лучше растут и доминируют над классическими
вибрионами, которые в итоге переходят в некультивируемое состояние [10]. Однако
несмотря на проводимые интенсивные молекулярно-генетические и биохимические исследования, механизмы, ответственные за широкое распространение El Tor
вибрионов и вытеснения классических вибрионов, до сих пор не установлены.
В 90-х годах прошлого столетия возникли и получили широкое распространение генетически измененные штаммы (или геноварианты) V. cholerae биовара El Tor.
Геноварианты отличаются от типичных El Tor вибрионов повышенной вирулентностью, что выражается в более тяжелых проявлениях болезни и высоких показателях
смертности. Данные штаммы содержат в опероне ctxАB, кодирующем биосинтез ХТ,
ген ctxB классических вибрионов (ctxB1) в отличие от типичных El Tor вибрионов,
имеющих аллель ctxB El Tor (ctxB3). Геноварианты синтезируют повышенное количество ХТ I (классического) типа, приближаясь по данному показателю к высокотоксигенным штаммам классического биовара [2, 6, 9, 12]. Несмотря на интенсивные
фенотипические и молекулярно-генетические исследования штаммов геновариантов, причины их глобального распространения и вытеснения типичных изолятов
также не установлены. Высказано предположение, что селективные преимущества
штаммов геновариантов обусловлены повышенной вирулентностью в совокупности
с высокой способностью к выживанию и множественной устойчивостью к антибиотикам [11]. При этом данных о способности штаммов геновариантов выживать при
действии различных неблагоприятных факторов внешней среды получено не достаточно.
Цель работы состояла в изучении биологических свойств природных штаммов
геновариантов V. cholerae биовара El Tor, влияющих на их адаптационные способности в условиях недостатка питательных веществ, при сравнительном анализе с
типичными штаммами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования были проведены на 8 штаммах V. cholerae биовара El Tor, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб»
(Саратов).
Конкурентную пробу проводили по методу R. Freter с соавт. путем посева смеси
клеток двух сравниваемых штаммов в автоклавированную речную воду [7]. Штаммы
выращивали на LB агаре при температуре 370
С в течение ночи и готовили в физиологическом растворе суспензии одинаковой оптической плотности (ОП), контролируя её на спектрофотометре «Biowave DNA» (Biochrom Ltd, Англия). Полученные
суспензии доводили до концентрации 1х107
КОЕ/мл и вносили по 0,5 мл в 4,5 мл
стерилизованной речной воды так, чтобы конечная концентрация каждого штамма
составляла 5х106
КОЕ/мл. Параллельно для контроля выживаемости исследуемые
штаммы засевали в автоклавированную воду по отдельности. Посевы культивирова-ли при комнатной температуре (22-25о
С), делая высевы на агар LB как из смеси, так
и из контрольных проб, и подсчитывали число выросших колоний.
Скорость роста штаммов определяли по значению оптической плотности (ОП)
при длине волны 600 нм на спектрофотометре «Biowave DNA» (Biochrom Ltd, Англия)
через 4 часа выращивания в LB бульоне. Параллельно с определением ОП подсчитывали количество выросших колоний при высеве бактерий на пластинки LB агара.
Экспрессию гена rpoS определяли методом ОТ-ПЦР в реальном времени на термоциклере «Rotor-Gene Q 5plex» (Qiagen Inc, GMBH, Германия) с праймерами (rpoSRT1 — GAACCAAACACGCACCATTC и rpoS-RT2 — TCATCGACAGGTCGGTCTAA)
и TaqMan зондом (FAM)GCCTTGACCACGAACCTACACCAG-(BHQ1), рассчитанными авторами и синтезированными в «Синтол» (Россия). Для изучения экспрессии штаммы выращивали в течение 4 часов в LB бульоне на шейкере при 37 о
С.
Тотальную РНК из клеток выделяли с использованием набора реактивов «SV total
RNA isolation system» (Promega, США). Определение концентрации выделенных
препаратов РНК и их выравнивание проводили на спектрофотометре «Biowave DNA»
(Biochrom Ltd, Англия). Синтез кДНК на матрице РНК осуществляли с помощью
набора реагентов «Реверта» (InterLabServis, Россия). В качестве стандартов для построения калибровочной кривой использовали разведения плазмидной ДНК (от 107
до 103
) c клонированным участком исследуемого гена. Нормирование полученных
данных проводили относительно конститутивно экспрессирующегося гена recA методом 2-ΔΔС
Т [8]. Праймеры и зонд на данный ген также рассчитаны авторами (recART1 — ACGGGTAACCTCAAGCAATC; recA-RT2 — TATCCAAACGAACAGAAGCG;
recA-зонд — (FAM)CCACTGGCGGTAACGCACTGA-(BHQ1). ПЦР проводили на
трех независимо полученных образцах кДНК. В качестве контрольного штамма,
экспрессия которого принималась за 1, использовался штамм V. cholerae М818.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программ Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Inc) и Rotor-Gene Q Software version 2.3.1
(Qiagen).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первом этапе работы была изучена способность штаммов геновариантов
V. cholerae биовара El Tor выживать в конкурентной пробе с типичными штаммами в
условиях недостатка питательных веществ (автоклавированная речная вода). Для постановки конкурентной пробы методом селекции на питательных средах, содержащих
антибиотик, были получены мутанты, устойчивые к определенному антибиотику, что
было необходимо для последующей дифференциации штаммов в конкурентной пробе. Среди полученных штаммов, несущих спонтанные мутации устойчивости к рифампицину, спектиномицину, канамицину и стрептомицину, были отобраны клоны,
показавшие наибольшую стабильность наследования приобретенного признака.
Далее из произвольно взятых штаммов были сформированы четыре пары (типичный/геновариант) штаммов с разной чувствительностью к антибиотикам.
Типичные штаммы (М1011, М1062, М893, М818) были изолированы в 1970-1972 гг.,
штаммы геновариантов (М1270, Р17644, Л3226, 301) — в 1993-2011 гг. (таблица).
Штаммы были помещены в автоклавированную речную воду.
В результате проведенных исследований установлено, что типичные штаммы
имели более низкий уровень выживаемости по сравнению со штаммами геновариантов. Так, в конкурентной пробе M1011KmR/M1270 SpR КОЕ геновариантов уже на
4 сутки превышало КОЕ типичных штаммов в 77,6 раза. На 6 сутки их совместной
инкубации наблюдалось отсутствие роста типичного штамма V. cholerae M1011 KmR
на фоне активного роста штамма геноварианта M1270 SpR, популяция которого сократилась незначительно. В популяции штаммов М893RifR/301SpR на 4 сутки исследования КОЕ обоих штаммов было примерно одинаковым. Однако на 18 сутки КОЕ
штамма геноварианта 301SpR было в 3,9 раза больше, чем у М893RifR, а количество
бактерий штамма P17644SpR (проба P17644SpR/M1062RifR) превышало количествобактерий типичного штамма в данный период времени в 3,2 раза. Необходимо отметить, что, несмотря на отсутствие роста некоторых типичных штаммов (М1011
KmR, М818 RifR) в конкурентной пробе, в контрольных пробирках (монокультура)
указанные штаммы продолжали высеваться (таблица).
Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что при совместном культивировании типичных штаммов и геновариантов V. cholerae биовара
El Tor в автоклавированной речной воде при комнатной температуре уровень адаптации последних был выше, чем у типичных штаммов.
На основании полученных сведений о доминировании штаммов геновариантов
в конкурентной пробе нами было высказано предположение, что они могут отличаться от типичных изолятов более высокой скоростью роста. Действительно, в
результате проведенных исследований установлено, что изученные штаммы геновариантов росли быстрее, чем типичные штаммы. Так, через 4 часа выращивания ОП
штамма геноварианта М1270 SpR (из пары М1011 KmR/М1270 SpR) превышала данный показатель типичного штамма в 4,8 раза. ОП штамма геноварианта V. cholerae
Л3226 StrR (М818 RifR /Л3226 StrR) была в 1,2 раза, а у штаммов геновариантов Р17644
SpR и 301 SpR соответственно в 1,7 и 1,8 раза больше, чем у типичных изолятов в паре.
При этом данные по оптической плотности полностью согласовывались со сведениями, полученными при подсчете количества выросших на агаре колоний (таблица).
Итак, изученные штаммы геновариантов V. cholerae биовара El Tor отличаются
от типичных штаммов повышенной скоростью роста, что, возможно, способствует
увеличению их адаптационных свойств при совместном нахождении с типичными
штаммами.
Согласно данным литературы скорость роста бактерий является сложным процессом, зависящим от экспрессии многих генов. При этом важная роль в изменении
экспрессии генов в условиях недостатка питательных веществ принадлежит альтернативным сигма-субъединицам, в том числе σs
, кодируемой геном rpoS [5]. Учитывая
данные литературы, на следующем этапе работы были проведены эксперименты по
изучению экспрессии гена rpoS в анализируемых штаммах. В результате установлено, что экспрессия rpoS в штаммах геновариантов была в 1,3-7,9 раза больше, чем
у типичных изолятов (таблица). Исключение составил только типичный штамм
V. cholerae М893, у которого экспрессию гена rpoS определить не удалось. Возможно, в данном штамме изменена структура гена rpoS, но для проверки данного предположения необходимы дополнительные исследования.
Для подтверждения полученных экспериментальных данных мы расширили
выборку штаммов, взяв в анализ еще 8 штаммов геновариантов, в том числе завезенных на территорию РФ в последние годы. В результате все проверенные штаммы геновариантов также отличались от типичных изолятов повышенной скоростью
роста и увеличенной экспрессией гена rpoS (данные не приводятся).
В ходе работы установлено, что штаммы геновариантов имеют конкурентные
преимущества при их совместном нахождении с типичными штаммами в условиях
недостатка питательных веществ (автоклавированная речная вода). Согласно данным литературы выживание бактерий при действии различных стрессовых факторов (в том числе и при недостатке питательных веществ) зависит от скорости роста
клеток непосредственно перед стрессом [5]. Действительно нами было установлено,
что штаммы геновариантов в отличие от типичных изолятов растут быстрее, что,
возможно, является одним из механизмов их лучшей адаптации при совместном
нахождении с типичными штаммами. При этом необходимо отметить, что высокая
скорость роста штаммов геновариантов могла быть обусловлена изменением процессов метаболизма, в том числе установленной нами ранее измененной способностью к ферментации глюкозы данными штаммами [4].
На основании выявленных селективных преимуществ штаммов геновариантов
в условиях недостатка питательных веществ и способности к быстрому росту было
высказано предположение, что в данных штаммах может быть увеличена экспрессия гена rpoS, являющегося глобальным регулятором стрессового ответа в штаммах
холерного вибриона. По данным литературы ген rpoS кодирует биосинтез альтернативной сигма субъединицы σS
, связывающейся с РНК-полимеразой и контролирующей экспрессию более 25 генов в штаммах холерного вибриона, в том числе
необходимых для выживания в условиях стресса [13]. Специфическое накопление
белка RpoS начинается в начале стационарной фазы роста бактерий, а при попадании бактерий в неблагоприятные условия (низкий рН, повышенная температура,
осмотический и оксидативный стресс, недостаток питательных веществ) обеспечивает своевременную транскрипцию набора генов, необходимых для роста клеток в
данных стрессовых условиях [5, 13]. Действительно при изучении экспрессии гена
rpoS методом ОТ-ПЦР было установлено, что в штаммах геновариантов его уровень
экспрессии в 1,3-7,9 раза выше, чем у типичных штаммов. На наш взгляд, полученные сведения о повышенном уровне экспрессии гена rpoS в штаммах геновариантов
будут востребованы в дальнейшей работе при изучении экологических свойств современного возбудителя холеры, а также могут объяснить некоторые ранее полученные результаты, в том числе повышенную устойчивость штаммов геновариантов по
сравнению с типичными изолятами к осмотическому и оксидативному стрессу [3].
Таким образом, в результате проведенной работы установлено, что штаммы геновариантов V. cholerae биовара El Tor при совместном нахождении с типичными изолятами
в условиях недостатка питательных веществ обладают выраженными адаптационными
преимуществами. Одним из выявленных механизмов их селективного преимущества
является повышенная скорость роста клеток. Важным, на наш взгляд, является установление повышенной экспрессии гена rpoS в штаммах геновариантов, что может способствовать их лучшей выживаемости при действии других стрессовых факторов.

About the authors

S. P. Zadnova

Russian Research Institute for Plague Cоntrol «Microbe»

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Saratov. Россия

A. A. Kritsky

Russian Research Institute for Plague Cоntrol «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
Saratov. Россия

N. A. Plekhanov

Russian Research Institute for Plague Cоntrol «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
Saratov. Россия

N. B. Cheldyshova

Russian Research Institute for Plague Cоntrol «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
Saratov. Россия

N. I. Smirnova

Russian Research Institute for Plague Cоntrol «Microbe»

Email: fake@neicon.ru
Saratov. Россия

References

Supplementary files