Influence of bacteriophages on sensitivity of conditionally pathogenic bacteria to antibacterial prepar ations

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Известно, что бактериофаги играют важную роль в эволюции бактерий и приобретении ими новых свойств благодаря феномену фаговой или лизогенной конверсии. Доказано, что фаги могут изменять морфологические признаки бактерий [1]. Присутствие большого числа фаговых частиц в популяции может привести к значительной интенсификации процессов передачи плазмид и в результате к формированию множественно устойчивых популяций [2]. Бактериофаги являются векторами для горизонтального переноса генов резистентности между бактериальными патогенами [6, 7, 10]. Бактериофаги представляют собой вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Антибактериальный эффект препаратов бактериофагов обусловлен внедрением генома фага в бактериальную клетку с последующим его размножением и лизисом инфицированной клетки [4]. Препараты бактериофагов могут использоваться в сочетании с любыми другими лечебными препаратами [3]. В настоящее время нельзя однозначно утверждать, что комбинированное использование фагов и антибиотиков будет полезным. Возможность передачи генетических детерминант резистентности к антибактериальным препаратам посредством бактериофагов показана во многих исследованиях [8 — 10]. В случаях, когда антибиотики мешают бактериальной клетке поддерживать репликацию фагов, комбинированное использование предположительно снижает эффективность лечения фагами и терапии в целом. Однако в других исследованиях, в которых фаги и антибиотики применялись одновременно (например, для лечения хронических легочных нагноений), показано, что данное сочетание улучшало результат терапии [Мозговая Ю.А., 2015]. Полагают, что использование фагов как в монотерапии, так и совместно с антибиотиками может препятствовать появлению антибиотикоустойчивых и фагоустойчивых бактериальных мутантов, так как механизмы возникновения антибиотикоустойчивости и фагоустойчивости различны [5]. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния специфических бактериофагов на формирование резистентности условно патогенных бактерий к антибактериальным препаратам. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование чувствительности к антибиотикам и влияние бактериофагов на антибиотикорезистентность проведено на 108 штаммах Staphylococcus aureus и на 97 культурах бактерий рода Klebsiella (K.pneumoniae — 56 штаммов и 41 — K.oxytoca), выделенных из различных локусов новорожденных (слизистые зева, носа, глаза, анального отверстия, пупочного остатка, кожи). Выделенные штаммы первоначально исследовались на чувствительность к специфическим бактериофагам и антибиотикам. Определялась чувствительность каждого исследуемого штамма к специфическому бактериофагу: стафилококковый бактериофаг и бактериофаг клебсиелл поливалентный (ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Уфа). Чувствительность культуры к бактериофагу определяли по интенсивности мутности питательной среды. Литическую активность бактериофага оценивали как высокую, если мясо-пептонный бульон был прозрачен, как умеренную — если питательный бульон опалесцировал, как низкую, если культуральная среда после инкубации с бактериофагом оставалась мутной. В ходе проведения исследований ставился контроль стерильности питательной среды, бактериофага. Изучение влияния бактериофага на чувствительность бактерий к антибактериальным препаратам проводилось по следующей схеме. Суточные культуры бактерий исследовали на чувствительность к антибиотикам, затем в течение 18-24 часов при 37 °С культивировали этот же штамм со специфическим бактериофагом в пробирке с мясо-пептонным бульоном (5 мл бульона + 5 капель бактериофага + петля суточной агаровой испытуемой культуры). После взаимодействия с бактериофагом из всех пробирок производился высев на плотную питательную среду (мясо-пептон-ный агар) с целью выделения оставшихся жизнеспособных бактериальных клеток. Выросшие колонии отвивали на скошенный МПА. Через сутки культивирования при 37 °С готовили бактериальную суспензию (1,5*108 КОЕ/мл) и повторно исследовали на чувствительность к антибиотикам. Чувствительность бактерий к антибиотикам определялась диско-диффузионным методом на среде Мюллер-Хинтон (HiMedia, Индия) в соответствии с действующими методическими указаниями [8, 9]. Изоляты бактерий рода Klebsiella исследовались на чувствительность к ампициллину (АМП), гентамицину (ГЕН), тетрациклину (ТЕТ), офлоксацину (ОФ), цефотаксиму (ЦТК), цефтазидиму (ЦАЗ). Штаммы бактерий Staphylococcus aureus исследовались на чувствительность к оксициллину (ОКС), цефалексину (ЦФЛ), цефуроксиму (ЦОС), гентамицину, офлоксацину, эритромицину (ЭРИ). В данном исследовании использовались диски антибиотиков производства Biorad (США). Статистическая обработка результатов осуществлялась в программе «Excel» с вычислением показателей: средней арифметической, ошибки и достоверности полученных различий с использованием критерия Стьюдента. В исследовании использовались дискретные данные (типа Да/Нет — устойчивые/чувствительные). С применением лицензионной программы SPSS версия 14,0, предназначенной для научных исследований, проведен анализ таблиц сопряженности для расчета отношения шансов встречаемости исследуемых явлений в группах. Гипотеза о равенстве шансов встречаемости отвергалась, когда величина соответствующего критерия не равна 1, а его 95% доверительные интервалы не включали в себя 1. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделенные штаммы бактерий S.aureus первоначально были исследованы на чувствительность к стафилококковому бактериофагу, показатель составил 66,7 % (чувствительных штаммов 25; штаммов с промежуточной чувствительностью 47 и устойчивых — 36). Параллельно определяли чувствительность к антибактериальным препаратам. После взаимодействия с бактериофагом 38 культур не дали роста, поэтому повторно чувствительность к антибиотикам определялась у остальных 70 штаммов. Частота встречаемости резистентных (R) штаммов, штаммов с промежуточной чувствительностью (I) и чувствительных (S) в исследуемой популяции S. aureus представлена на рис. 1.Сравнительная характеристика штаммов стафилококков по чувствительности к антибиотикам до и после взаимодействия с бактериофагом стафилококковым показала, что после взаимодействия с фагом увеличилось количество штаммов, резистентных к оксациллину и цефалоспоринам (цефалексину, цефуроксиму), а также к гентамицину и офлоксацину. При этом статистически значимые различия выявлены только по гентамицину (критерий Мак-Немара).

Рис. 1. Чувствительность к антимикробным препаратам бактерий S. aureus до и после взаимодействия со стафилококковым бактериофагом (%).

Изучение литической активности бактериофага клебсиелл поливалентного в отношении штаммов бактерий рода Klebsiella показало следующие результаты: 59,8 % штаммов были чувствительными, 23,7% изолятов обладали промежуточной чувствительностью и 16,5% проявляли резистентность. Все штаммы исследованы на чувствительность к антибиотикам. Часть культур бактерий рода Klebsiella (50) после взаимодействия со специфическим бактериофагом лизировалась полностью, поэтому чувствительность к антибактериальным препаратам исследована у 47 штаммов. Результаты определения чувствительности клебсиелл к антибиотикам представлены на рис. 2.

Рис. 2. Чувствительность к антимикробным препаратам бактерий рода Klebsiella до и после взаимодействия с бактериофагом клебсиелл поливалентным (%).

Статистически значимые отличия по отношению шансов регистрируются по тетрациклину — после взаимодействия бактерий с бактериофагом их чувствительность к этому антибиотику возрастает в 2 раза. Известно, что бактерии семейства Enterobacteriaceae, и в частности рода Klebsiella, обладают природной устойчивостью к ампициллину. В исследованной нами популяции клебсиелл до взаимодействия с бактериофагом выявлено 77% штаммов, обладающих природной резистентностью. После взаимодействия с бактериофагом количество резистентных штаммов в этой популяции составило 68%. При суммировании количества чувствительных штаммов и штаммов с промежуточной чувствительностью к антибиотикам показано, что в популяции бактерий S. aureus после взаимодействия со специфическим бактериофагом количество штаммов S+I уменьшается, в то время как в популяции бактерий рода Klebsiella — увеличивается. Минимальные отличия в антибиотикограмме, скорее всего, являются проявлениями фенотипической вариабельности экспрессии определенного механизма резистентности. Таким образом, проведенные исследования влияния бактериофагов на чувствительность бактериальных культур к антибиотикам свидетельствуют о разнонаправленных взаимодействиях в различных популяциях бактерий in vitro. Зарегистрирована тенденция снижения числа чувствительных и умеренно устойчивых штаммов S.aureus к антибактериальным препаратам после взаимодействия со специфическим бактериофагом, достоверное снижение отмечено по гентамицину. Количество чувствительных к антибиотикам бактерии рода Klebsiella имеет тенденцию к увеличению под влиянием клебсиеллезного бактериофага. Выявлено достоверное увеличение штаммов чувствительных к тетрациклину. Скорее всего, это связано с морфофункциональными особенностями исследованных культур микроорганизмов. Изучение процессов влияния бактериофагов на чувствительность к антибиотикам различных популяций бактерий будет способствовать решению важных практических проблем, связанных с успешной терапией бактериальных инфекций. Результаты исследования свидетельствуют о необходимости дополнительного изучения данного вопроса с помощью современных молекулярно-генетических методов исследования.

About the authors

A. A. Vakarina

Tyumen Research Institute of Region Infection Pathology

Email: fake@neicon.ru

625026, Тюмень,  ул. Республики, 147.

Россия

L. V. Kataeva

Tyumen Research Institute of Region Infection Pathology

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Катаева Любовь Владимировна - кандидат медицинских наук.

625026, Тюмень,  ул. Республики, 147; р.т. (3452) 28-99-98,  доб. 1123.

Россия

T. F. Stepanova

Tyumen Research Institute of Region Infection Pathology

Email: fake@neicon.ru

625026, Тюмень,  ул. Республики, 147.

Россия

References

Supplementary files