AUTOPHAGY REGULATION BY RUBELLA VIRUS

M. K. Gulimov; Гулимов М. К.; L. R. Romantsova; Романцова Л. Р.; A. V. Astapenko; Астапенко А. В.; Yu. R. Schetinina; Щетинина Ю. Р.; E. V. Prokofeva; Прокофьева Е. В.; G. V. Movsesyan; Мовсесян Г. В.; V. V. Zverev; Зверев В. В.; Yu. I. Ammur; Аммур Ю. И.

doi:10.36233/0372-9311-2019-1-36-42

AUTOPHAGY REGULATION BY RUBELLA VIRUS

Authors: Gulimov M.K.¹, Romantsova L.R.¹, Astapenko A.V.¹, Schetinina Y.R.¹, Prokofeva E.V.¹, Movsesyan G.V.¹, Zverev V.V.², Ammur Y.I.¹
Affiliations:
1. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera
2. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Sechenov First Moscow State Medical University
Issue: Vol 96, No 1 (2019)
Pages: 36-42
Section: Articles
Submitted: 21.08.2019
Accepted: 21.08.2019
Published: 23.04.2019
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/362
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-36-42
ID: 362

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Aim. Some viruses can subvert host defense mechanism, autophagy, to their own benefit. We analysed the effect of Rubella virus (RV) infection on autophagy in human alveolar epithelial cells A549. Materials and methods. Cells were infected with the wild type and lab-attenuated strain, C-77w and C-77a, respectively, with a multiplicity of infection of 1.0, in parallel, the expression level of genes encoding Beclin1, Atg5, Rab7, and p62 (SQSTM1) proteins participating in different steps of autolysosome formation was measured. To investigate the role of autophagy on RV replication cycle, we measured the amount of infectious RV particles, together with the viral RNA in supernatants and cell lysates, after incubation of A549 cells with wild type or attenuated strain in the presence of the autophagy inhibitor, Bafilomycin A1, or inducer, Rapamycin. Results. The significant increase in Beclin1 and Atg5 gene expression at 24-48 (for the wild type) and 24-72 (for the attenuated type) hours after infection was observed, while significant induction of either Rab7 or SQSTM1 gene expression was not noticed. This effect was correlated with more delayed increase of IFNβ expression and IFNβ-mediated pro-apoptotic gene expression leading to apoptotic cell death 72-96 hours after infection. Moreover, Bafilomycin A1 diminished the RV infection non significantly, as evidenced by the RT-qPCR and plaque assay, while Rapamycin increased the amount of infectious RV particles released by the infected cells more dramatically with wild type comparing with attenuated strain. Conclusion. Thus, we hypothesized that RV can use an antiviral mechanism to prevent degradation and ensure its replication, differentially regulating the process of autophagy, by stimulating the initiation and suppression of later steps.

Keywords

rubella virus, autophagy

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Аутофагия — это эволюционно сложившийся клеточный автономный катабо- лический и защитный механизм, посредством которого клетки способны утилизи- ровать собственные органеллы, макромолекулы и патогены [5]. Аутофагия сложный процесс, в котором участвует более 30 различных белков, задействованных на раз- ных стадиях и выполняющих определенные функции. Инициация аутофагии происходит при слиянии белков Vps34 и Beclin1 под контролем mTORC1 (Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1) и активации ком- плекса белков ATG9, ATG18 и ATG2, перемещающихся в цитоплазме на мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭПР), где они принимают участие в образовании небольших выступов мембраны, так называемых омегасом [4]. Достраивание до аутофагосомы происходит во время стадии элонгации, где клю- чевая роль принадлежит двум комплексам генов: Atg12—Atg5, кодирующему белки Atg5/Atg12/Atg16L, и Atg8/LC3, кодирующему белки LC3-I (light chain 3-I) и LC3-II, обеспечивающих элонгацию. Кроме того, белок LC3-II вовлечен в перенос в ауто- фагосомы белков-адаптеров, в том числе p62, посредством которых впоследствии происходит избирательная доставка различных макромолекул для их деградации (например, вирусных частиц) [9, 11]. Аутофагосомы созревают в аутолизосомы последовательным слиянием аутофа- госомы с лизосомами с помощью ГТФазы Rab7 путем эндоцитоза, что приводит к утилизации содержащихся в ней макромолекул гидролазами и другими лизосомаль- ными ферментами с целью получения энергии или уничтожения чужеродных аген- тов для защиты организма [6]. При вирусной инфекции аутофагия может выполнять функцию механизма надзора, который поставляет вирусные белки в лизосомальные компартменты [5], однако многие РНК-вирусы могут регулировать процесс аутофагии, препятствуя активации дцРНК-зависимых защитных механизмов [15]. Так, известно, что многие РНК-вирусы способны нейтрализовать или использовать аутофагический процесс с целью изменения клеточной физиологии и метаболизма в пользу облегчения собс- твенной репликации [7]. Создание вирусных фабрик из мембранных внутриклеточных органелл имеет важное значение для размножения РНК-вирусов, накапливающих в качестве репликативных промежуточных продуктов дцРНК в своем жизненном цикле [15]. Было показано, что некоторые РНК-вирусы активируют сигнальный путь класса I PI3K/Akt, регулируя аутофагический процесс с целью обеспечения защит- ной среды для поддержания своей репликации и предотвращения аутофагической деградации вирионов потомства [3, 10, 15]. Так, вирусы Коксаки B3 [3], Зика [10], Денге [8] и, возможно, вирус краснухи, могут захватывать аутофагические мембраны для создания репликационных комплексов, а также блокировать последующие фа- зы аутофагии и, таким образом, скрываться от последующей элиминации [3]. Таким образом, точное распознавание уникальных молекулярных стратегий, участвующих в биогенезе мембранных вирусных фабрик, имеет решающее значение для лучшего понимания инфекций и идентификации новых терапевтических целей. Краснуха — острое вирусное заболевание, актуальность и социальная значимость которого обусловлена способностью вируса краснухи вызывать у женщин во вре- мя беременности серьезную фетопатию — синдром врожденной краснухи, нередко заканчивающуюся выкидышем или рождением ребенка с различными тяжелыми пороками развития, такими как слепота, глухота, врожденные пороки сердца [12]. Однако молекулярный механизм тератогенного эффекта, вызванного вирусом крас- нухи, еще полностью не известен. Известно, что вирус краснухи способен активиро- вать клеточные пролиферативные пути, такие как Ras/Raf/MEK/ERK и PI3K/Akt, регулирующие, кроме того, большую часть мембранного трафика и аутофагию, на- рушать цитоскелет и модулировать клеточную гибель [13, 14]. Медленное размноже- ние вируса краснухи связано с внутриклеточной эндомембранной системой — вирус краснухи проникает в клетку-хозяина при помощи эндоцитоза. Вирусная оболочка сливается с эндосомальной мембраной, после декапсидации в цитоплазме начинает- ся образование комплексов репликации вируса краснухи — сферул, захватывающих небольшой участок ЭПР и митохондрии, которые обеспечивают защитную среду для репликации вирусной РНК. Как было показано ранее на модели чувствитель- ной культуры клеток кролика SIRC, вирус краснухи замедляет процесс аутофагии, подавляя уровень конъюгации Atg12—Atg5 и ослабляя LC3B липидизацию, а также снижает среднее количество и размер аутофагосом в клетке [13, 14]. Вместе, эти дан- ные свидетельствуют о том, что в процессе репликации вирус краснухи способен подавлять аутофагию, не вызывая полного ее блока и, вероятно, приводя к апоптозу. Таким образом, мы предполагаем, что вирус краснухи может дифференциально ре- гулировать последовательность аутофагии в своих интересах. Нашей задачей было оценить взаимосвязь процесса аутофагии и репликации вируса краснухи в эпители- альных клетках А549. МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы Для проведения исследований из музея ФГБУ НИИВС имени И.И. Мечникова были получены ампулы с вирусом краснухи штамма С-77 на 5 (С-77w) и 38 (С-77а) пассажах, а также штамма Wistar RA 27/3 на 30 пассаже. Перевиваемые культуры клеток почки кролика (линия RK-13) и линии Vero были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Перевиваемая культура клеток карциномы легкого А549 была предоставлена Никоновой А.А. (НИИВС им. И.И. Мечникова). Перевиваемые клеточные линии RK-13, Vero, A549 культивировали в питатель- ных средах RPMI 1640 (Gibco, США), MEM (Gibco) или DMEM (Gibco), соответ- ственно, в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, HyClone, США), 1мМ глутамина (Gibco) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco) при температуре +37°С в атмосфере 5% СО2. При получении монослоя клеток проводили пересев культуры. За день до заражения клетки А549 высаживали из расчета 2×106 в 6-луночный планшет (Greiner Bio-One, Австрия), непосредственно перед заражением 80—90% клеточный монослой промывали раствора Хэнкса (Gibco) и инкубировали с со- ответствующим вирус-содержащим материалом со множественностью заражения (MOI) 1.0 инфекционная частица на клетку в течение 3 часов при 35°С в атмосфере 5% CO2, затем удаляли вирусный материал и культивировали зараженные клетки в 3.0 мл питательной среды DMEM с 2% ЭТС на лунку при 33 °С (С-77а) или 37 °С (С-77w) в атмосфере 5 % СО2. Клеточный монослой лизировали, используя 300 мкл лизирующего буфера RLT RNAeasy kit (Qiagen, Германия) на лунку через 0, 24, 48, 72 и 96 ч после заражения. Лизаты клеток центрифугировали при 1 000 об./мин в течение 5 мин. Супернатант хранили при -70 °C до использования. Аналогично проводили эксперименты, добавляя к культуре клеток ингибитор (Bafilomycin A1, BFLA, Sigma Aldrich, USA) или индуктор (Rapamycin, Sigma Aldrich, USA) аутофагии в конечной концентрации 100 нМ каждый за час непосредственно перед заражением. Титрование вируса краснухи по реакции цитопатического действия (ЦПД) про- водили в 96-луночном планшете (Greiner Bio-One) в культуре клеток RK-13. Клетки трипсинизировали, считали в камере Горяева и пересаживали на планшеты с плот- ностью 1.5-3*104 на лунку в 100 мкл среды. Готовили 10-кратные серийные разведе- ния вирусных образцов в среде без добавления ЭТС. Использовали 6 лунок на 8 раз- ведений каждого вирусного образца. В каждую лунку добавляли 100 мкл разведений вируса краснухи. Планшеты инкубировали при 32-37 °C при 5% CO2 втечение 10-12 дней. Учет результатов проводили через 8-12 суток. Титры вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в lgТЦД50/мл. Тотальную РНК выделяли из клеточных лизатов с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen) согласно инструкции производителя или фенол-хлороформной экстра- кцией. Очищенную РНК элюировали с мембраны колонок RNeasy Mini Spin дважды 50 мкл воды, не содержащей РНКаз, и оценивали концентрацию РНК на приборе NanoDrop 8 000 (Thermo Scientific, Германия). Примесь ДНК удаляли обработкой ДНКазой 20 U (Синтол, Россия) в течение 30 мин. При определении уровня экспрессии целевых генов 1 мкг тотальной РНК ин- кубировали при 42°C в течение 1 ч со следующими компонентами: 1 ед. обратной транскриптазы RevertAid H Minus (Thermo Scientific), 5 мкM случайных гексамеров или праймера oligo(dT) (Синтол, Россия), 5-кратный буферный раствор (250 мM Трис-HCl (pH 8.3), 250 мM KCl, 20 мM MgCl2, 50 мM DTT), 1 мM каждого dNTP и 20 ед. ингибитора РНКаз RiboLock (Thermo Scientific). Фермент инактивировали прогреванием реакционной смеси при 70 °C в течение 10 мин. Амплификацию с использованием ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, со- держащем 2.5ЧSYBR® Green PCR Master Mix (Синтол), по 200 нM прямого и об- ратного праймера для каждого анализируемого гена и 10—50 нг кДНК в двух повто- рах. ПЦР проводили на приборе DTprime5 (ДНК-технология, Россия): 15 мин при 95 °C, 40 циклов по 15 с при 95 °C и 30 с при 60 °C. Праймеры были подобраны в программе Primer 3 plus. Расчет уровня экспрессии генов проводили, используя ΔΔCt-метод: средние значения полученных пороговых циклов для каждого исследу- емого гена нормализовали относительно значений пороговых циклов, полученных для генов «домашнего хозяйства»: GAPDH, PGK1 и ACTB, которые анализировали параллельно для каждого образца (ΔСt), результаты представляли как кратность из- менения (FC) между нормализованными значениями пороговых циклов заражен- ной культуры клеток непосредственно перед заражением (0 ч) (ΔΔСt) для каждой временной точки (24, 48, 72 и 96 ч). Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е Для того, чтобы определить, является ли инициированная аутофагия следствием репликации вируса краснухи, эпителиальные клетки человека А549 заражали диким или аттенуированным вариантами штамма вируса краснухи — С-77w и С-77а, соот- ветственно, полученными и полностью секвенированными ранее в нашей лаборато- рии [1], а также штаммом сравнения Wistar RA27/3 со множественностью заражения 1 инф.ед./кл. Кинетику репродукции вируса в клетках отслеживали по накоплению вирусной РНК внутриклеточно через 24, 48, 72 и 96 ч после заражения с помощью метода ОТ-ПЦР-РВ.

Рис. 1. Накопление РНК вируса краснухи (левая шка- ла) штамма Wistar RA27/3 (RA) и штамма С-77 дикого (С-77W) и аттенуированного вариантов (С-77А), а также экспрессия мРНК белка Beclin1 (правая шкала) в культуре клеток А549 через 24-96 ч после ее заражения вирусом краснухи штаммами — Wistar RA27/3 или С-77 дикого и аттенуированного варианта. Здесь и на рис. 2 результаты представляют кратность изменения (FC) между нормализованными значениями пороговых циклов (ΔCt) зараженной культуры клеток непосредственно перед заражением (0 ч) (ΔΔСt) для каждой временной точки.

На рис. 1 представлено накопление геномной РНК вируса крас- нухи в культуре клеток А549. Как видно из рис. 1, количество вирусной РНК всех использованных штаммов вируса постепенно растет в культуре зараженных клеток, что свидетельствует о чувствительности данной культуры клеток к вирусу. Одновременно в этих же клетках был измерен уровень экспрессии генов, кодиру- ющих белки, участвующие в инициации, элонгации и образовании аутофагосомы — Beclin1, Atg5, Rab7 и SQSTM1 (р62). Наибольший уровень экспрессии мРНК генов Beclin1 (рис. 1) и Atg5 (рис. 2) был отмечен через 24-48 (для С-77w) и 24-72 (для С-77а) ч после зара- жения диким и аттенуированным вариантами вируса краснухи, со- ответственно. Однако, индукции экспрессии мРНК генов Rab7 и SQSTM1 после заражения культу- ры клеток как диким, так и атте- нуированными вариантами вируса краснухи не наблюдали. Таким об- разом, мы предполагаем, что вирус краснухи может дифференциально регулировать последовательность аутофагии, стимулируя иници- ацию и подавляя более поздние стадии, в результате не происходит слияние аутофагосомы с лизосо- мой, что позволяет вирусу исполь- зовать антивирусный механизм в своих интересах.

Рис. 2. Экспрессия мРНК белков ATG5 (левая шкала) и IFNβ (правая шкала) через 24-72 ч после заражения культуры клеток А549 вирусом краснухи штаммами Wistar RA27/3 (RA) или C-77 дикого (С-77W) и аттенуированного варианта (С-77А).

Кроме того, экспрессия генов Beclin1 и Atg5 через 24-48 ч после заражения культуры клеток А549 диким вариантом вируса краснухи и через 24-72 ч аттенуированным вариантом вируса обратно кор- релировала с экспрессией мРНК IFNβ на 48 и 72 ч после зараже- ния (рис. 2), соответственно, т.е. более отстроченной (на 24 ч) при заражении аттенуированным ва- риантом по сравнению с диким. Мы предполагаем, это может быть вызвано выходом собранно- го вирусного материала потомст- ва и вирусных частиц, включая промежуточные формы дцРНК, опосредованно инициирующие экспрессию IFNβ, из «репликаци- онных фабрик» в омегасомах, где происходила их сборка. В даль- нейшем экспрессия IFNβ при- водила к апоптотической гибели зараженных клеток начиная с 96 ч после заражения вследствии, в том числе, активации экспрессии интерферон-зависимых генов, в частности, таких как TNFSF10 (TRAIL) и XAF1, 2.5-5.0-кратное повышение экспрессии которых определяли через 72 ч после зара- жения. При этом значимой раз- ницы в индукции экспрессии мРНК про-апоптотических генов в культуре клеток А549 при ее заражении диким или аттенуированным вариантами штамма С-77 виру- са краснухи не было установлено. Однако при заражении диким вариантом штамма С-77 экспрессия мРНК гена Atg5 снижалась ранее (уже через 48 ч после заражения), приводя к более ранней экспрессии мРНК IFNβ, по сравнению с аттенуированным вариантом (рис. 2), при этом накопление РНК дикого варианта вируса в культуре клеток А549 замедлялось уже через 48 ч после ее заражения (рис. 1), что, возможно, указывает на ключевую роль Atg5 в процессе взаимодействия вируса краснухи и ауто- фагии. Важно также отметить, что по литературным данным способность вируса краснухи индуцировать апоптоз варьирует в зависимости от штамма вируса и типа инфицированных им клеток [2]. Кроме того, интересен тот факт, что вирус красну- хи способен активировать множественные апоптотические пути, однако насколько этот вирус влияет на механизмы запрограммированной гибели и микроокружения зараженной клетки до сих пор неизвестно. Для подтверждения участия аутофагии в процессе репликации вируса красну- хи, мы измерили концентрацию вирусных частиц в супернатантах, а также РНК вируса краснухи внутриклеточно в присутствии ингибитора (BFLA) или индуктора (Рапамицин) аутофагии при заражении культуры клеток А549 штаммом С-77 вируса краснухи через 48 часов после заражения. Основным регулятором аутофагии явля- ется протеинкиназа mTOR, состоящая из двух отдельных мультипротеиновых комп- лексов mTORC1 и mTORC2, схожих по своим компонентам, регуляции, функциям, но влияние на аутофагию оказывает непосредственно mTORC1 [5]. Протеинкиназа mTORC1 чувствительна к действию рапамицина, который ингибирует ее, иниции- руя процесс аутофагии [10]. BFLA блокирует аутофагию на стадии слияния аутофа- госомы с лизосомой, тем самым препятствуя элиминации патогена [3]. Установлено, что аутофагия вносила существенный вклад в продукцию вирусных частиц клетками А549, что следует из увеличения их выхода в супернатант в присутствии индуктора аутофагии и незначительного снижения в присутствии ингибитора, при этом зна- чимого эффекта на изменение концентрации вирусной РНК через 48 часов после заражения не наблюдали, что свидетельствовало о том, что вирус краснухи, по-ви- димому, использует индуцированную аутофагию для облегчения сборки вирионов потомства, а не для репликации РНК. Следует отметить, что наши результаты не воспроизводят ранее опубликованные данные, полученные группой венгерских ис- следователей при заражении штаммом вируса краснухи To336 эпителиальных кле- ток кролика SIRC, где при заражении клеток в присутствии индуктора аутофагии вирусный выход незначительно снижался [14]. Вероятно, это связано с использо- ванием разных штаммов и культур клеток. В любом случае, влияние аутофагии на продукцию вируса краснухи требует дальнейшего изучения. Широко известно, что пути Ras/Raf/MEK/ERK и I класса PI3K/Akt препятству- ют аутофагии путем активации mTORC1. В свою очередь, класс III PI3K оказывает противоположное действие, что имеет важное значение для инициации аутофагии и формирования омегасом [5]. Таким образом, взаимодействуя с Ras/Raf/MEK/ERK, PI3K класса I/Akt и PI3K класса III ветвями трансдукции сигнала, возможно, вирус краснухи может избирательно регулировать аутофагический каскад с последующей стимуляцией инициации и сильным подавлением более поздних этапов. Таким об- разом, мы предполагаем, что вирус краснухи может использовать антивирусный ме- ханизм для предотвращения деградации вирусного потомства и обеспечения своей репликации, дифференциально регулируя процесс аутофагии путем стимулирова- ния инициации и подавления более поздних стадий. Кроме того, известно, что процесс аутофагии принимает участие в некоторых фазах онтогенеза и органогенеза. Так, исследования показали, что аутофагия играет важную защитную роль в морфогенезе сердца и нервной системы при развитии поз- воночных животных [13]. В свете этих наблюдений, актуально предположить, что аутофагия, опосредованная вирусом краснухи, может принимать участие в патоге- незе пороков развития органов при синдроме врожденной краснухи. Таким образом, вероятно, терапевтические способы таргетинга процесса аутофагии могут помочь уменьшить тяжелые последствия синдрома врожденной краснухи.