New forms of home dust mite allergoid

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время около 150 млн людей в Европе и до 1 млрд в мире страдают аллергическими заболеваниями. По оценке Всемирной Организации Аллергии
(WAO) данные заболевания охватывают 30 — 40% населения. Европейская академия
аллергии и клинической иммунологии прогнозирует, что через 15 лет более 50% населения Европы будет страдать от той или иной формы аллергии[10, 14]. Тенденция
распространения данной патологии сохраняется на протяжении последних лет и за
рубежом, и у нас в стране. По данным статистики из разных источников той или
иной формой аллергии страдает от 17,5% до 30% населения России [7]. Основным
сенсибилизирующим компонентом жилища человека, инициирующим формирование атопических заболеваний верхних и нижних дыхательных путей, являются
пироглифидные клещи рода Dermatophagoides. Во всем мире примерно 10—20%
населения и 90% больных бронхиальной астмой имеют гиперчувствительность к
клещам домашней пыли Dermatophagoides pteronyssinus и Dermatophagoides farinae,
чья причинно-значимая роль в появлении симптомов атопических аллергических
заболеваний достоверно установлена[15, 16]. Клещи домашней пыли являются основной причиной таких аллергических заболеваний, как бронхиальная астма, круглогодичный ринит и атопический дерматит [17, 18]. Поэтому необходима разработка
новых эффективных подходов к терапии и профилактике аллергических состояний,
вызванных сенсибилизацией к ним. Единственным патогенетическим методом лечения атопических заболеваний на данный момент является аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ) [1]. Настоящее и будущее АСИТ связано с повышением
ее безопасности и эффективности, в связи с чем современные исследования направлены на разработку новых усовершенствованных препаратов.
Изначально для проведения АСИТ использовали водно-солевые экстракты
(ВСЭ) из культуры клещей. Но главными недостатками таких препаратов были их высокая аллергенность и слабые иммуногенные свойства. Снижение аллергенности и повышение иммуногенности препаратов путем модификации различными
химическими агентами всегда являлось актуальным направлением в разработке
современных форм для проведения АСИТ. Изначально были получены аллергоиды
— препараты аллергенов, полимеризованных формальдегидом и глутаральдегидом. Сни жение ал лерген ности (блокада IgE-связывающих эпитопов альдегидными группами) и од новре мен ное усиление им му ноген ности модифицированных
препаратов достигалось за счет увеличения молекулярной массы и устойчивости
к влиянию денатурирующих агентов, с чем связан также пролонгирующий эффект
[6, 9]. Полимеризованные аллергены по сравнению с нативными экстрактами аллергенов более интенсивно стимулируют увеличение циркулирующих Treg при
АСИТ [19]. Из литературных источников известно о выраженном снижении аллергенности ВСЭ после их полимеризации [5, 8, 11]. В дальнейшем модификация
аллергенов проводилась различными химическими агентами, с помощью которой
получали мономерные препараты. Данные аллергоиды могут быть получены путем
сукцинилирования (обработка янтарным ангидридом), малеинирования (обработка малеиновым ангидридом), карбомилирования (реакция с цианатом калия)
различных аллергенных экстрактов [9, 12, 13]. Мономерные аллергоиды обладают
необходимыми для АСИТ характеристиками: сниженная гипоаллергенность и высокая иммуногенность. Рост аллергических заболеваний среди населения диктует
необходимость постоянного совершенствования различных форм лечебных препаратов аллергенов.
Цель данного исследвания — разработать технологии приготовления полимерного аллергоида, полученного путем модификации формальдегидом экстракта
Dermatophagoides farinae и мономерного аллергоида, полученного методом сукцинилирования, Dermatophagoides pteronyssinus, и изучить их физико-химические и
иммунологические свойства.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Ранее была разработана технология получения аллергоида из клещей D. farinae, а также изучены его физико-химические и иммунологические свойства.
Модифицированные формы клещевого аллергена получали путем обработки клещевого экстракта формальдегидом (одноэтапный метод по Marsh D., 1970) и глутаровым альдегидом (методом Nakada Sh., 1985). Определяли содержание белка (по
Sedmak J., 1977), изоэлектрические точки белковых компонентов клещевого аллергена и аллергоида с помощью метода изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в агарозном
геле, эстеразную активность препаратов спектрофотометрически по начальным скоростям гидролиза синтетического субстрата — этилового эфира бензоил-L-аргинина (по методу Пасхина Т.С., 1968). Проводили гель-фильтрацию на сефарозе G-100
и сефакриле S-300. Антигенные свойства клещевого аллергоида изучали методами
иммунодиффузии (Ouchterlony O., 1958) и иммуноэлектрофореза (Аксель сен Н.,
1977). Реакцию активной системной анафилаксии воспроизводили на морских
свинках (метод Титова С.М., 1973). Для изучения аллергенных свойств препаратов
использовали сыворотки больных с сенсибилизацией к клещам D. farinae. Для характеристики специфической активности клещевого аллергена и аллергоида применяли микроточечный ИФА (МТИФА) (Михайлов А.Г., 1991). Степень снижения
аллергенности модифицированного формальдегидом препарата оценивали с помощью метода, основанного на количественном определении гистамина в условиях in
vitro с помощью спектрофлуориметрического метода (Shore P., 1959).На настоящий момент отработана технология получения модифицированной
формы аллергена в виде мономерного аллергоида (sD1) на основе водно-солевого
экстракта из клещей D. pteronyssinus методом сукцинилирования. Данная технология основана на модификации специфических белков путем сукцинилирования
e-групп лизина, приводящего к «разворачиванию» белковой молекулы. Клещевой
экстракт получен согласно действующему регламенту ФСП ЛП-000701, отвечающему требованиям ОФС 1.7.1.0001.15., и на основании патента RU №2331437 (НИИВС
им.И.И. Мечникова). Лиофилизированный экстракт модифицирован сукцинилированием янтарным ангидридом (сD1).
В раствор D1 (концентрация 1—5% по общему белку) при рН 8,5—9 и комнатной
температуре вводили порциями янтарный ангидрид (ЯА) при массовом соотношении ЯА: белок = 1:1, непрерывно поддерживая указанный рН. После стабилизации
рН (окончание реакции) раствор диализовали и лиофильно высушивали. Степень
модификации определяли количественно по реакции с ТНБС (2,4,6-тринитробензолсульфокислота). Концентрации белка в полученных образцах измеряли методом
Бредфорда. С целью анализа белков в нативном (D1) и модифицированном экстрактах (sD1) использовали стандартную методику электрофореза. Эквивалентные количества D1 и sD1 (по общему белку) после растворения в буфере образца и денатурирования вносились в объеме 10 мкл в 15% полиакриламидный гель. Электрофорез
проводили в камере VE-10(Helicon) при ограничении напряжения 200 вольт в течение 1,5 ч. Проявление производили красителем Coomassie Brilliant Blue. В качестве
контроля молекулярной массы использовали стандартные маркеры SeeBlue (Thermo
Fisher Scientific) и PageRuler (Thermo Fisher Scientific).
Для выявления присутствия в экстракте D1 мажорного аллергена Der p 1 был
получен его масс-спектр на масс-спектрометре Agilent 6460 (USA) при помощи использования ионизации электроспреем — Electro Spray Ionization (ESI). Для оценки
изменений третичной структуры белковых молекул использован метод спектрального кругового дихроизма (КД). Образцы экстракта D1 и модифицированного производного sD1, как и главного аллергена Der p 1 и его сукцинилированной формы sDer
p 1 растворяли в PBS . Изучение аллергенности sD1 проводили методом торможения
реакции связывания аллерген-специфического IgE, используя пуллированную сыворотку от 5 больных с сенсибилизацией к D. pteronyssinus (III—V классов). Оценку
иммуногенности D1 и sD1 осуществляли на мышах-самках линии BALB/c. Мышей
BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно четырехкратно с интервалом в 3 нед. D1
или sD1 в дозе 100 мкг/мышь (по белку) как без адъюванта, так и с адъювантом —
Al(OH)3 (в дозе 2 мг/мышь).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение клещевого аллергена, модифицированного глутаровым альдегидом,
показало, что данная обработка не привела к увеличению молекулярной массы и не
вызвала значительных изменений pI белков по сравнению с немодифицированным
препаратом. Дальнейшие исследования были связаны с модификацией клещевого
аллергена с помощью формальдегида. ИЭФ образцов исходного сырья и аллергоида позволил выявить различие в значениях pH белковых фракций этих препаратов.
Было обнаружено, что фракции немодифицированного аллергена более гетерогенны по заряду и располагаются в нейтральной и кислой областях pH. Фракции
аллергоида фокусировались в более кислых значениях pH. Различия в результатах
ИЭФ обусловлены взаимодействием формальдегида с положительно заряженными
группами белковых компонентов аллергена, при котором происходит изменение
суммарного поверхностного заряда. Проведение гель-фильтрации образцов натив-ного и модифицированного клещевых аллергенов на колонке с Сефакрилом S-S00
показало, что оба образца элюировали одним пиком, однако максимум кривой элюции аллергоида был несколько сдвинут в более высокомолекулярную область, но
при этом объем его выхода был несколько меньше. Это связано с конформационными преобразованиями белковых компонентов клещевого аллергена в результате их
взаимодействия с формальдегидом. Определение эстеразной активности показало
ее значительное снижение после обработки клещевого аллергена формальдегидом.
Клещевой аллергоид сохранил лишь 8% активности исходного клещевого аллергена. Изучение антигенных свойств клещевого аллергена и аллергоида проводили
иммунохимическими методами с использованием полученных кроличьих антисывороток. Результаты реакции двойной радиальной иммунодиффузии в агаровом
геле показали, что каждый препарат формирует отчетливые преципитаты с гомологичными антисыворотками. Выраженное взаимодействие клещевого аллергена с
анитиаллергоидной сывороткой указывало, что в антиаллергоидной сыворотке присутствуют антитела, сходные по специфичности с антителами, присутствующими в
сыворотке животных, иммунизированных нативным клещевым аллергеном.
Для получения мономерного аллергоида экстракт клещей домашней пыли
D.pteronissinus (D1) модифицировали сукцинилированием, после чего определяли
степень модификации и концентрацию белка. Сукцинилирование связано с модификацей ε-групп лизина белка, что приводит к разворачиванию белковой молекулы.
Степень модификации экстракта D1 составила 98,9%. Концентрация общего белка
в образцах D1 и модифицированного сукцинилированием экстракта (sD1) составляла соответственно 17,71 и 63,25 мкг/мг. В модифицированном препарате увеличение
концентрации белка происходило за счет диализа после процесса модификации. По
результатам электрофореза можно сделать вывод, что модификация D1 существенно не влияет на размер молекул белка в экстракте. Основное количество вещества
принадлежит двум фракциям — низкомолекулярной и фракции порядка 12—13 кДа.
Масс-спектрометрический анализ образца D1 выявил характеристические значения
m/z (отношение массы к заряду), которые свидетельствуют о присутствии Der p 1 в
экстракте D1. Изучение аллергенности sD1 показало, что модификация экстракта
D1 путем сукцинилирования приводит к существенному ее снижению. Методом
ИФА и хемилюминесцентного анализа показано, что связывание специфического
анти-Der p IgE с sD1 выражено более существенно, чем с немодифицированным D1.
Уровень гистамина, высвобождающегося из лейкоцитов крови больных с сенсибилизацией к D. pteronyssinus после ее инкубации с sD1 был значительно ниже такового
при инкубации с немодифицированным экстрактом D1. Для высвобождения одного
и того же количества гистамина требовалась концентрация sD1, в 100 раз превышающая концентрацию D1. При этом, как D1, так и sD1, взятые в широком диапазоне
концентраций, не обладали гистамин-высвобождающим действием при инкубации
с кровью доноров, не сенсибилизированных к Der p. Изучение иммуногенности sD1
в сравнении с D1 при иммунизации мышей BALB/c с адъювантом AL(OH)3 или без
него выявило ожидаемые изменения, характерные тем, что получены ранее при использовании модельного аллергена овальбумина. При иммунизации мышей D1 или
sD1 без адъюванта выраженный анти-Der p IgE-ответ наблюдался только после четвертой иммунизации, причем у мышей, иммунизированных немодифицированным
D1, он был значительно выше такового при иммунизации sD1. При иммунизации
мышей sD1 с адъювантом Al(OH)3 анти-Der p IgE-ответ даже после 4 иммунизации
был существенно ниже такового, чем при иммунизации D1 с Al(OH)3. Анти-Der p
IgG1-ответ при иммунизации sD1 без адъюванта был выше такового при иммунизации только D1, а при иммунизации D1 и sD1 с адъювантом уровень анти-Der p IgG1 были сходными после 2 и последующих иммунизаций. В то же время, уровень антиDer p IgG2а, начиная с 3 иммунизации, был существенно выше при иммунизации
sD1 по сравнению с иммунизацией D1 как с адъювантом, так и без него.
Одной из главных задач данного исследования являлось получение модифицированного полимерного препарата клещевого аллергена путем его формалинизации. Результатом модификации нативного аллергена является образование химических связей в виде внутримолекулярных метиленовых «мостиков», что приводит к
химическим и конформационным изменениям компонентов клещевого аллергена.
С помощью методов МТИФА и количественного определения гистамина, секретируемого тучными клетками крысы, установлено что, в результате формалинизации
снижается способность клещевого аллергоида взаимодействовать со специфическими к немодифицированному клещевому аллергену IgG антителами животных и
IgЕ антителами человека. Это доказывает значительное снижение аллергенной активности модифицированного препарата. При этом иммуногенные свойства клещевого аллергоида сохранены, и препарат способен индуцировать выработку антител,
специфичных к немодифицированному клещевому аллергену. Совокупность данных, полученных в работе, свидетельствует о том, что данная форма модификации
водно-солевого аллергена может быть использована для приготовления лечебного
аллергоида путем формалинизации.
Из данных литературных источников, посвященных химической модификации аллергенов, известна возможность модификации аллергена путем точечной
блокады ε-групп лизина в молекуле белка за счет конъюгации с носителем, которая приводит к заметному снижению аллергенности при сохраненной иммуногенности [2]. В ходе исследований стало очевидно, что блокаду ε-групп лизина можно осуществить ацилированием путем прямого воздействия, например, янтарного
ангидрида. Используя модельный аллерген овальбумин, показано, что обработка
янтарным ангидридом (сукцинилирование) приводила к существенному снижению
аллергенности за счет блокады В-клеточных эпитопов и сохранению иммуногенности за счет Т-клеточных эпитопов, в значительно меньшей степени подвергнутых
модификации. Экспериментальная АСИТ сукцинилированным овальбумином (ОА)
на мышиных моделях бронхиальной астмы и атопического дерматита показала более выраженный терапевтический эффект по сравнению с АСИТ немодифицированным ОА при лучшем профиле безопасности за счет пониженной аллергенности
[3, 4]. Данный подход (сукцинилирование) теоретически может быть применен к
любому аллергенному экстракту, что расширяет возможности создания новых препаратов мономерных аллергоидов для безопасной и эффективной АСИТ. В данном
исследовании использован экстракт из клещей домашней пыли D. pteronyssinus,
подвергнутый модификации сукцинилированием с целью получения мономерного
аллергоида. Показано, что аллергенность (IgE-связывающая активность) сукцинилированного экстракта sD1 значительно ниже таковой у немодифицированного,
причем иммуногенность в плане индукции антиаллергенных (анти-Der p) антител
субклассов G1 и G2a была даже несколько выше, чем у немодифицированного экстракта D1. Таким образом, полученный гипоаллергенный мономерный аллергоид
из клещей домашней пыли D. pteronyssinus может служить примером разработки
препаратов аллерговакцин для безопасной и эффективной АСИТ. То обстоятельство, что сукцинилированный экстракт sD1 сохраняет мономерность, является очень
важной характеристикой, позволяющей использовать такие препараты аллерговакцин для сублингвальной АСИТ. Предполагают, что мономерные аллергоиды могут
быть рекомендованы для проведения сублингвальной АСИТ, а полимерные аллергоиды — для классической инъекционной АСИТ. Это связано с тем, что полимерные аллергоиды (полученные обработкой альдегидами) значительно труднее проникают
через слизистую мембрану из-за большого размера конгломератов, состоящих из
150—250 отдельных белковых молекул [2].

About the authors

V. M. Berzhets

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru

Moscow

Россия

A. A. Babakhin

State Scientific Centre Institute of Immunology

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Россия

N. S. Petrova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Россия

A. V. Vasileva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Россия

S. V. Khlgatyan

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Россия

O. Yu. Emelyanova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru

Moscow

Россия

References

Supplementary files