Email this article IMMUNOGENIC PROPERTIES OF CELLULAR AND EXTRACELLULAR PROTEIN-CONTAINING ANTIGENS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS
- Authors: Gruber I.M.1, Egorova N.B.1, Astashkina E.A.1, Akhmatova N.K.1, Kurbatova E.A.1, Cherkasova L.S.1, Kukina O.M.1
-
Affiliations:
- Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
- Issue: Vol 96, No 1 (2019)
- Pages: 29-36
- Section: Articles
- Submitted: 21.08.2019
- Accepted: 21.08.2019
- Published: 23.04.2019
- URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/354
- DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-29-36
- ID: 354
Cite item
Full Text
Abstract
Aim. Comparative study of immunobiological properties of cell wall surface antigens and extracellular protein-containing antigens of Staphylococcus aureus. Materials and methods. Preparations: surface antigens of the cell wall (peptidoglycan, teichoic acids, protein antigens) of the strains of S. aureus containing in the staphylococcal vaccine «Staphylovac» (SV) and extracellular protein-containing antigens of S. aureus (EPCA). The parameters of innate immunity were evaluated by the effect of preparations on the immunophenotype of mononuclear leukocytes (ML) of the spleen of mice, expression of Toll-like receptors (using flow cytometry), phagocytic activity of macrophages of peritoneal exudate of mice after the introduction of SV and EPCA; the protective activity of preparations was studied in experiments of active protection of BALB/c mice. Results. To isolate EPCA, we used the virulent strain of S. aureus №6, and for obtaining surface antigens of the cell wall, 4 strains were selected, the most immunogenic of which was the low virulent strain of S. aureus №1991. Both preparations increased the number of TLR2 and MHC II expressing cells; CV administration caused an increase in the number of cells with CD25 marker, reflecting the early activation of immunocompetent cells, and EPCA immunization — led to a shorter expression of this marker. On the other hand, an increased number of CD19 positive cells were detected for a longer period of time during EPCA immunization. The longest activation of phagocytosis under the action of SV was established. High protective activity of bo-th types of the studied preparations was noted. Conclusion. The antigens of the cell wall and extracellular protein-containing experimental drugs possessed comparable immunological properties, however, the surface antigens to a greater extent activate innate immunity, and extracellular — adaptive immunity.
Full Text
ВВЕДЕНИЕЗаболевания, вызываемые Staphylococcus aureus, в настоящее время являются од-
ной из важнейших проблем здравоохранения всего мира; они разнообразны по фор-
мам и включают поражения кожи и мягких тканей, инвазивные инфекции. S. aureus —
оппортунистический бактериальный патоген, часто являющийся причиной инфек-
ций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) и внебольничных инфек-
ций (ВИ), включающих бактериемию, эндокардит, остеомиелит, септический артрит
и пневмонию. Повсеместное увеличение распространения заболеваний стафилокок-
ковой этиологии в последние годы [4] сопровождается увеличением резистентности
возбудителей к антибиотикам. Кроме того, многие антибиотики, обладая иммуно-
супрессивными свойствами, снижают защитные силы организма. Трудность терапии
определяют необходимость профилактики и комплексного лечения стафилококковой
инфекции, включающего использование антибактериальных и иммунобиологичес-
ких препаратов, активирующих иммунную систему [9]. Разработка стафилококковых
вакцин велась по нескольким направлениям: наиболее подробно изучали вакцины,
приготовленные из микробных клеток; втечение длительного времени использовали
анатоксины. При клинических исследованиях эффективность большинства разраба-
тываемых в последние годы препаратов не была подтверждена, поэтому в настоящее
время отсутствуют коммерческие противостафилококковые иммунопрепараты с эф-
фективностью, подтвержденной клиническими испытаниями [13].
В НИИВС им. И.И. Мечникова коллективом авторов под руководством
Н.Б. Егоровой разработана стафилококковая вакцина «Стафиловак» на основе ком-
плекса поверхностных антигенов клеточной стенки (пептидогликан, тейхоевые кис-
лоты, белковые антигены клеточной стенки) из иммуногенных штаммов S. aureus,
обладающих внутривидовой перекрестной протективной активностью. В клиничес-
ких исследованиях при включении в комплексную терапию хронических стафило-
кокковых инфекций она оказывала длительный терапевтический эффект [5]. В на-
стоящее время в вакцине расширен штаммовый состав, разработана промышленная
технология получения препарата и завершены доклинические исследования.
В последние годы при разработке противостафилококковых вакцин внима-
ние исследователей привлекает другое направление, связанное с использованием
конструкций, в которых участвуют экзопротеины — поверхностные и/или непосред-
ственно секретируемые в питательную среду факторы вирулентности [10, 13, 14].
Число этих факторов более 30 и по механизму действия они группируются как по-
верхностные белки, ответственные за адгезию и колонизацию тканей хозяина и за
распространение в тканях, подавляющие фагоцитоз и поддерживающие жизнеспо-
собность фагоцитов, способствующие уходу от иммунного ответа хозяина и модули-
рующие иммунный ответ, а также детерминанты присущей и приобретенной резис-
тентности к антибиотикам.
Исследования, проводимые в настоящее время, касаются, в основном, создания
и испытания 2 типов вакцин: предупреждающих колонизацию и индуцирующих
адаптивный иммунный ответ [11]. В последние годы до I фазы клинических испы-
таний успешно дошли 3 вакцины — «Стафиловак» (на основе комплекса поверхнос-
тных антигенов клеточной стенки), PentaStaph (на основе капсульных полисахари-
дов (КП) 5 и 8 типов, нетоксичной формы альфа-токсина, лейкоцидина Пантона-
Валентайна — PVL и тейхоевых кислот) и NDV-3 (содержащая хлопьеобразующий
фактор адгезии — ClfA), у которой завершена I фаза клинических исследований [3, 13].
К 2016 г. на I фазе клинических испытаний находились 2 токсоидные вакцины —
мультивалентная и рекомбинантная детоксицированная SEB вакцина; II фазу кли-
нических испытаний проходят 2 вакцины: четырехкомпонентная вакцина (GSK,
Бельгия), содержащая КП5 и КП8, конъюгированные со столбнячным токсоидом,
мутантные формы α-токсина и ClfA, и комплексная вакцина SA4Ag (Pfizer, США)
на основе ClfA, металл-связывающего компонента MntC, КП 5 и 8, представляюща-
яся (на данный момент) наиболее перспективной [12].
В НИИВС им. И.И. Мечникова исследования проводятся в двух направлениях:
как отмечено выше, они касаются поверхностных антигенов клеточной стенки, вхо-
дящих в «Стафиловак», и внеклеточных белоксодержащих антигенов S. aureus.
Цель исследования: сравнительный анализ иммунобиологических свойств по-
верхностных антигенов клеточной стенки и внеклеточных белоксодержащих анти-
генов S. aureus.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Проведено изучение двух типов препаратов: стафилококковой вакцины
«Стафиловак», содержащей в своем составе поверхностные антигены клеточ-
ной стенки (пептидогликан, тейхоевые кислоты, белковые антигены) 4 штаммов
Staphylococcus aureus №№5,9,1986,1991, полученных c использованием щадящих
методов выделения, позволяющих сохранить их структуру и, соответственно, ак-
тивность; внеклеточных белоксодержащих антигенов S. aureus (экспериментальных
белоксодержащих препаратов — ЭБСП), выделенных методом ионно-обменной
хроматографии из фильтрата культуральной жидкости, полученной после динами-
ческого периодического культивирования S. aureus №6 в полусинтетической среде
до конца фазы экспоненциального роста [1].
Показатели врожденного и адаптивного иммунитета оценивали по влиянию
препаратов на иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) селезенки мы-
шей и экспрессию Тoll-подобных рецепторов методом проточной цитометрии на
приборе Cytomix FC-500 (Beckman Coulter, США) с применением моноклональных
антител (МКА) (eBiosciences, США), меченных флуорохромом, к определяемому
маркеру. Мышей линии BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно трехкратно 200
мкг СВ или двукратно 1,2 мкг ЭБСП. Учет результатов проводили через 7 суток пос-
ле иммунизаций.
Фагоцитарную активность макрофагов перитонеального экссудата мышей
(СВА, 10-12 мг) изучали через 1 и 7 суток после внутрибрюшинного введения СВ
и ЭБСП. Фагоцитарную активность клеток оценивали по поглотительной способ-
ности S. aureus 1991 в мазках, сделанных после 30- и 60-минутной инкубации при
расчете показателей: фагоцитарного индекса (ФИ) — процента клеток, вступивших
в фагоцитоз, фагоцитарного числа (ФЧ) — среднего числа бактерий, находящихся
внутриклеточно (частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число
клеток, вступивших в фагоцитоз) и индекса бактерицидности фагоцитов (ИБФ) —
отношения числа убитых внутри фагоцитов микробов к общему числу поглощенных
фагоцитами микробов в %.
Протективную активность препаратов изучали в экспериментах активной за-
щиты мышей линии BALB/c (самцов) массой 12-14 г при разных способах иммуни-
зации и заражения.
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
Ранее в процессе разработки стафилококковой вакцины при исследовании штам-
мов-продуцентов протективных антигенов была изучена биологическая активность
16 свежевыделенных, музейных и производственных штаммов S. aureus [7]. При этом
была установлена их вариабельность и отсутствие корреляции между иммуногеннос-
тью штаммов и их вирулентностью и сенсибилизирующими свойствами. Наиболее
иммуногенным при выделении поверхностных антигенов клеточной стенки оказался
менее вирулентный шт. №1991 (табл. 1). Была выявлена его способность стимулиро-
вать систему врожденного иммунитета, т.к. уже через сутки после однократной имму-
низации выживало более 50% мышей, зараженных вирулентными штаммами №№ 6 и
1986. А препарат из клеточных стенок, полученный из наиболее вирулентного шт. №6,
практически не обладал протективной активностью и перекрестной протективной ак-
тивностью к различным условно патогенным микроорганизмам [8]. Использование
щадящего метода выделения поверхностных антигенов клеточной стенки (инактива-
ция диметилкетоном, водная экстракция) обеспечило сохранение иммуногенности
[6]. Полученный препарат стафилококковой вакцины (СВ) обладал протективной ак-
тивностью при невысоких показателях токсичности и сенсибилизирующих свойств.
Разработанная в НИИВС им. И.И. Мечникова сухая стафилококковая бесклеточ-
ная вакцина [6], приготовленная из комплекса поверхностных антигенов клеточной
стенки (пептидогликан, тейхоевые кислоты, белковые антигены клеточной стенки)
4 штаммов S. aureus №№5,9,1986,1991, была разрешена к применению в медицинской
практике еще в 1996 г. (Приказ МЗ РФ 3144/53 от 10.04.1996), однако ее производствен-
ный выпуск не был налажен. Вместе с тем, клинические исследования, проведенные
на разных базах, показали, что включение данной вакцины в комплексную терапию
хронических стафилококковых инфекций оказывает длительный терапевтический
эффект: она снижала тяжесть обострений, удлиняла период ремиссии, сокращала пот-
ребность антибиотикотерапии, способствовала индукции интерферона и антител [5].
Предложенная вакцина в настоящее время усовершенствована: разработана промыш-
ленная технология получения препарата, включающая осуществление реакторного
культивирования продуцентов в полусинтетической питательной среде, изменение
фазы роста микроба и методов выделения антигенных препаратов, что потребовало
изучения ее иммунобиологических свойств. В доклинических исследованиях серий
вакцины было установлено, что препарат обладает антигенными и протективными
свойствами, не токсичен, не обладает аллергизирующим действием, тератогенностью
и мутагенностью, не пирогенен, не иммунотоксичен in vitro и in vivo.
При определении штамма S. aureus — продуцента внеклеточных белоксодер-
жащих антигенов из охарактеризованных имеющихся в коллекции лаборатории,
была изучена протективная активность антигенов из двух штаммов, «оппозитных»
по вирулентности при внутрибрюшинном заражении: слабовирулентного вакцин-
ного штамма №1991 (LD50 = ( 0,5-2,0)х109 м.к.); высоковирулентного штамма №6
(LD50 = (0,04-1,9)х108 м.к.).
Полученные в этих опытах результаты оценки протективной активности стафи-
лококковой вакцины и внеклеточных экспериментальных белоксодержащих препа-
ратов , приготовленных из высоко- и слабовирулентных штаммов, представлены в
табл. 1. Установлено, что препарат поверхностных антигенов клеточной стенки из
наиболее вирулентного штамма №6 оказался практически неэффективным. В то же
время, при двукратной иммунизации мышей внеклеточными белоксодержащими
антигенами в дозе 1,0 мкг белка, полученными по разработанной технологии [2],
из иммуногенного слабо вирулентного шт. №1991 и вирулентного шт. №6, отмечена
большая выживаемость мышей, иммунизированных препаратом из вирулентного
шт. №6, при заражении 2,2 LD50 штаммов №№1986 и 6 (что составило, соответс-
твенно, 2,5х109 и 0,4х109 м.к.). Эти результаты явились предпосылкой для последую-
щего использования штамма S. aureus №6 при получении ЭБСП.
Внеклеточные ЭБСП выделяли из фильтрата культуральной жидкости, получен-
ной после динамического периодического культивирования S. aureus №6 в полусин-
тетической среде до конца фазы экспоненциального роста [1]. Наиболее очищенная
фракция, при изучении электрофоретической подвижности которой показано при-
сутствие одной полосы в области 90-100 кДа, четырех раздельных полос в области
31-60 кДа и одной четкой полосы в области 24 кДа, содержит 31,2±18,1мкг/мл бел-
ка, 9,5±3,1мкг/мл углеводов и 7,0±2,5мкг/ мл нуклеиновых кислот. В этой фракции
установлено присутствие факторов патогенности: хлопьеобразующие факторы А и
В, препятствующие эффективному фагоцитозу, и стрессовый белок супероксиддис-
мутаза, защищающая бактерию от окислительного стресса.
Сравнительные данные анализа действия «Стафиловак» и внеклеточных бе-
локсодержащих антигенов при иммунизации мышей линии BALB/c на показатели
врожденного и адаптивного иммунитета приведены в табл. 2. Установлено, что СВ
после одно- и трехкратной иммунизации более существенно активирует CD16/32,
NKT, CD25, MHC II и TLR2 экспрессирующие клетки, также после третьей имму-
низации выявлена активность В-лимфоцитов (CD19) и T-regs; ЭБСП после первой
и второй иммунизации повышает количество клеток с маркерами CD19, MHC II и
TLR2, после первой иммунизации — только численность NKT, CD25 и TLR4.
При изучении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей
в ответ на однократное введение препаратов более высокая активность установле-
на при введении СВ. Так, при введении СВ отмечены наиболее высокие значения
фагоцитарного индекса (ФИ) как через 1сутки после иммунизации (84,3±4,2), так
и через 7суток (88,4±3,9) при 60,2±3,1 в контроле; фагоцитарное число (ФЧ) мак-
симально нарастало через 7 суток (7,2±0,7) при 5,1±0,4 — в контроле; индекс бак-
терицидности фагоцитов (ИБФ) повышался через 1 сутки -77,3±2,7 при 57,3±3,7 —
в контроле; при введении ЭБСП отмечено значимое увеличение только ФЧ через
7 суток после иммунизации — 6,8±0,4 при 5,3±0,6 в контроле.
Таким образом, наиболее длительная активация фагоцитоза отмечается под
действием СВ, в то время как ЭБСП показывает более кратковременное и позднее
стимулирующее действие на фагоцитоз.
Изучение протективной активности двух типов изучаемых препаратов — вак-
цины «Стафиловак», приготовленной по усовершенствованной технологии, и вне-
клеточных экспериментальных белоксодержащих препаратов в опытах активной
защиты показало их сравнимость (табл. 3). Останавливаясь на протективной актив-
ности вакцины «Стафиловак», которую изучали при шестикратной иммунизации (3
п/к и 3 в/бр) в разовой дозе 500 мкг следует отметить, что как у экспериментальной
серии СВ, при в/бр заражении беспородных мышей высоковирулентным штаммом
S. aureus № 6, так и у двух производственных серий при заражении мышей линии
BALB/c менее вирулентным штаммом S. aureus № 1986 отмечены высокие индексы
эффективности: соответственно, ИЭ 11,0 — 2,45 — 2,63.
Протективный эффект внеклеточных экспериментальных белоксодержащих
препаратов изучали при двукратной п/к иммунизации в дозе 1,2 мкг белка и зара-
жении мышей линии BALB/c высоковирулентным штаммом S. aureus № 6 в рет-
роорбитальный синус (этот путь заражения близок к внутривенному), что может
привести к развитию инфекционного процесса в течение как минимум 10 суток, а
не только к интоксикации на 3-5 сутки. Полученные результаты свидетельствуют о
высокой протективной активности ЭБСП: ИЭ у двух серий 4,28 и 4,25.
Следует отметить, что как СВ, так и ЭБСП: повышали уровень специфических
IgG в сыворотках иммунизированных животных, соответственно, в 2,6-3,0 и 2,2-2,5
раза; обладали протективной активностью, установленной также в опытах пассив-
ной защиты мышей: кроличьи и мышиные сыворотки от животных, иммунизиро-
ванных СВ, защищали, соответственно, 100 и 70% мышей, зараженных 109 м.к. S.
aureus 1986, а иммунизированных ЭБСП защищали до 70% мышей, зараженных
2,5х107 м.к. S. aureus 6; оба препарата снижали высеваемость S. aureus из крови, се-
лезенки и почек иммунизированных мышей, что было показано на разработанной
модели генерализованной стафилококковой инфекции [1].
Проведенные исследования подтвердили полученные ранее данные о том, что
если при выделении поверхностных антигенов клеточной стенки наиболее иммуно-
генным оказался менее вирулентный шт. S. aureus №1991, то поверхностные анти-
гены, выделенные из самого вирулентного из изученных шт. №6, были не способны
защитить от заражения даже гомологичным штаммом. В то же время, при выделе-
нии внеклеточных белоксодержащих антигенов именно этот вирулентный штамм S.
aureus №6 оказался наиболее перспективным.
При изучении влияния на показатели врожденного и адаптивного иммунитета ус-
тановлено, что оба препарата вызывали повышение численности TLR2 экспрессиру-
ющих клеток (что свидетельствует о наличии в антигенных препаратах патоген-ассо-
циированных молекулярных структур — РАМР) и клеток с молекулами антигенного
представления MHC II (поздний маркер активации клеток). При этом введение СВ
вызывало и после 1, и после 3 иммунизации повышение количества клеток с марке-
ром CD25, отражающим раннюю активацию иммунокомпетентных клеток, а имму-
низация ЭБСП приводила к более кратковременному повышению числа этих клеток.
С другой стороны, выявлялось более продолжительное нарастание количества В-лим-
фоцитов (CD19) при иммунизации ЭБСП. Также установлено, что наиболее длитель-
ная активация фагоцитоза отмечается под действием СВ, в то время как ЭБСП пока-
зывает более кратковременное и позднее стимулирующее действие на фагоцитоз.
Совокупность полученных результатов свидетельствует, что два типа антиген-
ных препаратов — вакцина «Стафиловак» на основе антигенов клеточной стенки
и внеклеточные экспериментальные белоксодержащие препараты сопоставимы по
иммунобиологическим свойствам и активируют эффекторы врожденного и адаптив-
ного иммунитета. Анализ данных показывает, что вакцина «Стафиловак» обладает
наиболее стимулирующим влиянием на дифференцировку лимфоцитов, чем ЭБСП.
Но при этом ЭБСП демонстрирует активирующее влияние на клетки более продол-
жительное время, в особенности на В-лимфоциты, по сравнению со «Стафиловак»,
являющиеся продуцентами антител. Это позволяет считать, что экспериментальные
белоксодержащие препараты более интенсивно действуют на адаптивный иммуни-
тет. «Стафиловак», напротив, является стимулятором врожденного иммунитета, так
как в большей мере индуцирует фагоцитарную активность макрофагов и нарастание
численности клеток-эффекторов, отвечающих за врожденные иммунные реакции.
Возможно, что суммирование действия этих антигенов стафилококка позволит по-
высить эффект лечебного и профилактического действия каждого антигена.
×
About the authors
I. M. Gruber
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
N. B. Egorova
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
E. A. Astashkina
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
N. K. Akhmatova
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
E. A. Kurbatova
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
L. S. Cherkasova
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
O. M. Kukina
Mechnikov Reseach Institute of Vaccines and Sera
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия
References
- Асташкина Е.А. Внеклеточные белоксодержащие антигены Staphylococcus aureus и их иммунобиологические свойства. Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2017.
- Грубер И.М., Доненко Ф.В., Асташкина Е.А, Игнатова О.М., Егорова Н.Б., Ванеева Н.П., Черкасова Л.С., Тарасова О.Е., Киселевский М.В. Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий. Патент РФ на изобретение № 2533815 от 20.11.2014.
- Грубер И.М., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А., Михайлова Н.А. Стратегия разработки противостафилококковых иммунопрофилактических и иммунотерапевтических препаратов. Эпидемиол. и инфекцион. болезни. Актуальные вопросы. 2013; 4: 31-38.
- Данилов А.И., Алексеева И.В., Аснер Т.В. и др. Этиология инфекционного эндокардита в России. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2015; 17(1): 4-10.
- Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Грубер И.М. Экспериментальная и клинико-иммунологическая оценка бесклеточной стафилококковой вакцины «Стафиловак». Журн. микробиол. 2008; 6: 102-108.
- Ефремова В.Н., Егорова Н.Б., Масюкова С.А. Бесклеточная антистафилококковая вакцина для лечения хронической стафилококковой инфекции. Патент РФ на изобретение № 2122862 от 10.12.1998.
- Корзая Л.И. Исследование иммунологических свойств комплекса водорастворимых антигенов, полученного из разных штаммов стафилококка. Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1982.
- Курбатова Е.А. Разработка поликомпонентной вакцины из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (экспериментальное и клинико-иммунологическое исследование). Дис. докт. мед. наук. М., 1997.
- Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. Норма и патология: Учебник. М., Медицина, 2010.
- Burlak C., Hammer C.H., Robinson M.A. et al. Global analysis of community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus exoproteins reveals molecules produced in vitro and during infection. Cell Microbiol. 2007; 9: 1172-1190.
- Daum R.S. Staphylococcus aureus vaccines. Руководство «Vaccines». S.A. Plotkin, W.A. Orenstein, P.A. Offit. Vaccines, Saunders Elsevier, 2008.
- Mohamed N., Wang M.Y. et al. Vaccine development to prevent Staphylococcus aureus surgical-site infections. British J. of Surgery. 2017; 104(2): e41-54.
- Otto M. Basis of virulence in community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Annu Rev. Microbiol. 2010, 64: 143-162.
- Sibbald M.J., Ziebandt A.K., Engelmann S. Mapping the pathways to staphylococcal pathogenesis by comparative secretomics. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. 70(3): 755-788.
Supplementary files
