ANTIFUNGAL ACTIVITY OF HUMAN AND SOME MAMMALS SERA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
Противомикробный гуморальный иммунитет сыворотки млекопитающих скла-
дывается из белков системы комплемента, иммуноглобулинов и антимикробных пеп-
тидов/полипептидов (АМП). Независимо от пути реализации системы комплемента —
классического или альтернативного, а также от механизма действия иммуноглобули-
нов и различных АМП (которых в сыворотке крови свыше 25), происходит, прежде
всего, повреждение клеточной мембраны патогенных микроорганизмов или их лизис
[15]. На этом свойстве сыворотки основаны все известные на сегодня методы оценки
ее микробицидности. Метод определения бактерицидных свойств крови, основанный
на классическом способе посевов, входит в «Номенклатуру клинических лабораторных
исследований» (п.6.3.2 — общие бактерицидные свойства сыворотки крови, секретов),
утвержденную Приказом Министерства здравоохранения РФ № 64 от 21.02.2000 г.
Однако в силу трудоемкости и длительности выполнения этот метод не нашел широ-
кого применения в клинической практике. Не менее сложны в выполнении и более
современные методы [4, 17]. Недавно нами предложен способ оценки активности
фракции антимикробных пептидов эпителиальных секретов, заключающийся в мик-
роскопировании окрашенных суспензий клеток дрожжей Candida albicans с целью
подсчета процента убитых клеток [2]. Данный метод с некоторыми модификациями
можно применить и к сывороткам крови, причем, как к цельным, так и к их низко-
молекулярным фракциям (2,8 — 80 кДа), в которые входят АМП, но не иммуноглобу-
лины и белки комплемента. Такая модификация была использована для определения
активности АМП-фракций мышиных сывороток [5]. Использование данного способа
дает возможность оценить микробицидную активность человеческих сывороток, обус-
ловленную разными их фракциями, и сравнить ее с таковой у других млекопитающих.
МАТ Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы
Человеческие сыворотки получены из венозной крови 6 здоровых доброволь-
цев женского и мужского пола в возрасте 22 — 24 года. Использована коммерческая
бычья сыворотка «Adult bovine serum» (PAA Laboratories GmbH, Австрия), хранив-
шаяся до использования в замороженном виде при -250С. Пуловую кроличью сы-
воротку получали от 6 здоровых кроликов-самок породы Шиншилла весом 1,5 кг,
питомник Филиал «Андреевка» ФГБУН «НЦБМТ» ФМБА России. Пуловая мы-
шиная сыворотка получена от 35 беспородных мышей-самок весом 18-20 г из того
же питомника. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с межго-
сударственным стандартом по содержанию и уходу за лабораторными животными
(ГОСТ 33217—2014).
Использованы штаммы дрожжей Candida albicans №927, Rhodotorula mucilaginosa
№132, Malassezia furfur №1451, Cryptococcus neoformans №3465, Geotrichum candidum
№1206, Trichosporon cutaneum №18 из коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова;
Saccharomyces cerevisiae Y-375 из ВКМ (Пущино, Россия). Суспензии клеток дрож-
жей готовили из экспоненциальных культур, выращенных на плотной среде Сабуро
(в случае M. furfur — на модифицированной среде Диксона) при 250С из расчета 1010
КОЕ/мл.
Для получения АМП-фракций образцы сыворотки фильтровали через моле-
кулярные фильтры «Amicon Ultra-4» (Millipore, Merсk) с диаметром пор100 кДа на
центрифуге в течение 45 мин при 7500 об/мин. Определение противогрибковой ак-
тивности проводили следующим образом: образцы сывороток или их АМП фракций
объемом 300 мкл (контрольная пробирка содержала физраствор) соединяли с 50 мкл
суспензии дрожжей, пробирки инкубировали 2 часа при 320С на шейкере, затем сме-
си центрифугировали в течение 5 мин при 10000 об/мин, супернатанты удаляли, а к
осадкам добавляли по 300 мкл раствора бромкрезолового пурпурного в фосфатном
буфере рН 4,6, суспендировали и инкубировали 45 мин при 320С на шейкере. После
этого суспензии вновь центрифугировали и по 50 мкл полученных супернатантов
добавляли в заранее подготовленные пробирки, содержащие по 2,5 мл фосфатного
буфера рН 4,6. Оптическую плотность полученных растворов измеряли на спектро-
фотометре при длине волны 440 нм в кюветах 1 см. Противогрибковую активность
выражали в процентах и рассчитывали по формуле: А = (ОПконтр. — ОПопыт. )*100 /
ОПконтр., где ОПконтр. — это оптическая плотность смеси из контрольной пробирки;
ОПопыт. — это оптическая плотность смеси из пробирки фракции I либо фракции II.
Осадки клеток микроскопировали с помощью микроскопа МБИ-6 («Ломо»,
СССР) при общем увеличении х1750. Статистическую обработку данных проводили
с помощью программы Excel. В качестве показателя наличия корреляционных взаи-
мосвязей использовали коэффициент Пирсона (r).
Р Е З У Л ЬТАТ Ы И О Б С У Ж Д Е Н И Е
Сравнение величин активности АМП-фракций сыворотки, рассчитанных с ис-
пользованием метода спектрофотометрии, и величин активности, рассчитанных с
помощью микроскопии (т.е. процент убитых клеток), показало наличие корреляции
высокой степени (r=0,836): соотношение этих показателей составляло в среднем
1,2±0,1. То есть, если активность АМП-фракции, полученная методом спектрофо-
тометрии, составляло 30%, то число клеток, убитых при их инкубации с данным
образцом сыворотки, равнялось примерно 36%. Необходимо отметить, что расчет
активности цельной сыворотки по методу микроскопии невозможен, так как в ре-
зультате действия этого ликвора клетки дрожжей частично разрушаются с образо-
ванием мелких везикул. Тем не менее, в данном случае использование метода спек-
трофотометрии правомерно, поскольку везикулы также наполняются красителем.
Важно отметить, что даже в этом случае остается значительная часть живых клеток.
Судя по данным микроскопии можно заключить, что в первую очередь разруши-
тельному воздействию подвергаются именно мертвые клетки.
Результаты оценки противогрибковой активности цельных человеческих, бы-
чьих, кроличьих и мышиных сывороток, а также их АМП-фракций представлены в
табл. Видно, что общая противогрибковая активность сывороток млекопитающих
примерно одинакова в отношении всех изученных видов дрожжей: она варьирует
в пределах 73 — 89%. Исключение составила лишь активность мышиной и бычьей
сыворПри этом имела место значимая корреляция активности человеческих цель-
ных сывороток разных видов дрожжей с таковой кроличьих (r=0,724), но не бычьих
(r =0,401и мышиных сывороток (r=0,207).
Активность АМП-фракций имела гораздо больший разброс, чем общая актив-
ность сывороток. Отрицательные значения в таблице означают, что оптическая плот-
ность опытных растворов была выше контрольной. Это можно объяснить отсутствием
противогрибкового действия данной фракции на данный вид дрожжей, в связи с чем,
по-видимому, за 2 часа инкубации клетки начинают расти на неактивной фракции,
используя ее как субстрат. Таким образом, отрицательные значения можно считать ну-
левыми в плане их противогрибковой активности. Значения активности АМП-фрак-
ций варьировали в диапазоне от 0 до 56,4%. Активность АМП-фракций человеческой
сыворотки значимо не коррелировала ни с одной из таковых у прочих млекопитающих
(r=0,459÷0,527). Однако имели место значимые корреляции между этими показателя-
ми между кроличьей и бычьей сыворотками (r=0,827), а также между кроличьей и мы-
шиной сыворотками (r=0,753). При исследовании вклада активности АМП-фракций
сывороток разных млекопитающих в общую противогрибковую активность сывороток
обращает на себя внимание тот факт, что наименьший вклад соответствует дрожжам
M. furfur и G. candidum, а наибольший — R. mucilaginosa и C. neoformans.
Человек и животные на протяжении жизни постоянно сталкиваются с различ-
ными видами дрожжевых грибов, причем некоторые из них относятся к условно
патогенным микроорганизмам. Так, для человека из более чем 200 видов известных
дрожжей около 40 считаются условными патогенами, несмотря на то, что эти виды в
норме заселяют различные локусы: Malassezia spp.— кожу, Candida spp., Rhodotorula
spp. — кишечник и половые органы, Geotrichum spp. и Saccharomyces spp. — кишеч-
ник [3]. Однако при нарушениях иммунитета, например, при атопическом дермати-
те, все указанные роды, а также Trichosporon spp. и Cryptococcus spp. могут являться
сильнейшими иммуногенами. Животные также подвержены дрожжевым инфекциям:
описаны маститы у коров, связанные с вышеперечисленными родами дрожжей [14],
а также криптококковый менингоэнцефалит [9]. Тот факт, что в ответ на взаимодейс-
твие с антигенами дрожжей образуются специфические иммуноглобулины (антитела),
не вызывает сомнений. Антитела не только помогают распознавать и обезвреживать
высокомолекулярные продукты жизнедеятельности дрожжей, но и обладают непос-
редственной противогрибковой активностью [8]. Поскольку общая микробицидная
активность сывороток состоит по большей части из активности комплемента и им-
муноглобулинов, то неудивительно, что этот показатель для человеческой сыворотки
варьирует примерно в одинаковых пределах в отношении всех изученных видов дрож-
жей — 77÷89%. Удивительно то, что такие разные млекопитающие, как человек, бык,
кролик и мышь, имеют сходные величины этой активности (табл.).
Иная ситуация наблюдается с активностью АМП-фракций: ее величины, ко-
нечно, значительно ниже активности цельных сывороток, но варьируют в широком
диапазоне, причем у всех представленных видов млекопитающих. На основании по-
лученных данных можно заключить, что имеет место специфичность АМП по отно-
шению к разным видам дрожжей. Это трудно себе представить, поскольку АМП не
имеют такой сложной и разветвленной структуры, как иммуноглобулины. Основной
мишенью АМП является мембрана микроорганизмов, при атаке которой происхо-
дит нарушение целостности мембраны, ведущее к гибели клетки. Несмотря на боль-
шое структурное разнообразие, большинство мембраноактивных пептидов образуют
амфифильные структуры в присутствии мембраны [6]. Селективное действие АМП
обусловлено липидным составом мембран и определяется, в основном, электроста-
тическими взаимодействиями. Так катионные АМП атакуют бактериальные клетки,
у которых во внешней мембране содержится большая доля отрицательно заряженных
липидов, в отличие от электрически нейтральных мембран клеток эукариот. Кроме
того, на антимикробную активность пептидов влияет упаковка и физические свойс-
тва липидного бислоя, например, наличие в составе мембраны специфических мо-
лекул-мишеней (стеринов, гликосфинголипидов) или липидов, влияющих на спон-
танную кривизну бислоя, таких как фосфатидилэтаноламин. Кроме того, некоторые
пептиды атакуют специфические внутриклеточные мишени [6].
В человеческой сыворотке присутствуют следующие АМП: гепцидин, гистатины,
дефензины, кателицидины, дермицидины, адреномедуллин, псориазин, секретор-
ный ингибитор лейкопротеазы, лизоцим, РНКазы, липокалины, азуроцидин, каль-
протектин, BPI (бактерицидный белок, повышающий проницаемость мембран —
bactericidal permeability-increasing protein) и лактоферрин. Многие из них выполня-
ют несколько функций помимо противомикробной.
Наиболее представленными в человеческой сыворотке в количественном от-
ношении являются лизоцим (2800±800 нг/мл) [7], РНКазы (2200±400 нг/мл) [10]
и дермцидины (2100±100 нг/мл) [11]. Их концентрации в данном ликворе вполне
соотносятся с их минимальными ингибирующими концентрациями в отношении
C. albicans, что дает основание считать именно эти АМП отвечающими за противо-
кандидозную активность сыворотки.
Лизоцим при взаимодействии с клетками C. albicans оказывает литическое
действие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану [13]. Человеческие
РНКазы легко связываются с мембраной клеток C. albicans, что приводит к депо-
ляризации и разрушению мембраны. Помимо дестабилизации мембраны РНКазы
атакуют клеточную РНК, что ведет к блокированию механизмов трансляции кле-
точного белка [12]. Дермицидины, в отличие от большинства АМП, являются от-
рицательно заряженными молекулами и действуют на клетки по так называемому
«ковровому» механизму, образуют гексамерные каналы даже при отсутствии липо-
фильных молекул (детергентов или липидов) [16].
Возможно, низкие значения активности АМП-фракции сывороток в отношении
клеток M. furfur обусловлены именно их необычным строением: помимо обычной
клеточной стенки они покрыты липидной «шубкой», которая помогает им выживать
в условиях повышенных концентраций солей и липидов на поверхности кожи [1].
АМП человека и мыши, очевидно, не способны преодолеть данный барьер, тогда
как АМП быка и кролика все же проявляют некоторую активность против клеток
M. furfur (табл.). Вероятно, высокая чувствительность клеток C. albicans, R. mucilaginosa
и C. neoformans к пептидам АМП-фракции обусловлена строением их мембран
и наличием соответствующих клеточных мишеней: скорее всего, какие-то из при-
сутствующих в сыворотке АМП функционируют именно при взаимодействии с клет-
ками этих дрожжей, но не M. furfur и G. candidum. Тот факт, что клетки наиболее
клинически значимых и изученных дрожжей — C. albicans и C. neoformans — являют-
ся высокочувствительными к сывороточным АМП, открывает перспективу создания
новых противогрибковых препаратов на основе фракций сывороточных пептидов.

About the authors

V. G. Arzumanyan

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Author for correspondence.
Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

T. A. Artemeva

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

A. M. Iksanova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Email: fake@neicon.ru
Moscow Россия

References

Supplementary files