Suppression of biofilm formation and survival of clinical isolates of uropathogens within epithelial cells under the effect of Fluorothiazinone in vitro

Full Text

Введение

Рецидивы инфекции мочевыводящих путей (ИМП) характеризуются повторным возникновением острой бактериальной инфекции, вызванной тем же возбудителем. Обычно рецидивирующие ИМП (рИМП) определяются как 2 и более случая неосложнённой ИМП за последние 6 мес или 3 случая и более за 12 мес [1–4]. Ежегодно от рИМП страдают 5–10% взрослых женщин [5], что влияет на затраты по лечению и снижает качество жизни, особенно с учётом того, что более чем у 60% женщин ИМП диагностируется хотя бы раз в жизни [6, 7]. Возбудителем большинства ИМП является уропатогенная Escherichia coli (UPEC) [8–10]. Однако на 2-е место среди этиологических агентов рИМП в последнее время выходит Klebsiella pneumoniae [11, 12]. Эта грамотрицательная бактерия стала распространённым патогеном, ответственным как за внебольничные, так и за внутрибольничные ИМП, особенно у лиц с факторами риска развития инфекции, ослабленным иммунитетом и хроническими сопутствующими заболеваниями [13–15].

Для возбудителей ИМП характерен достаточно сложный механизм развития инфекции в мочевом пузыре, когда бактерии после адгезии к рецепторам слизистой оболочки мочевого пузыря вызывают воспалительную реакцию и проникают в уротелий, образуя внутриклеточные бактериальные сообщества (ВБС) [16, 17]. Внутриклеточные UPEC проходят несколько стадий в своем развитии: инвазия, формирование ВБС, созревание ВБС и формирование покоящихся внутриклеточных резервуаров. ВБС представляет собой транзиторное бактериальное состояние, которое сохраняется до тех пор, пока бактерии не размножатся и не выйдут из клеток хозяина. Покоящиеся внутриклеточные резервуары формируются в более глубоких слоях уротелия. Бактерии, способные образовывать ВБС и покоящиеся внутриклеточные резервуары, могут уклоняться от фагоцитоза, выживать внутри клеток хозяина, защищённые от воздействия антибиотиков и иммунных факторов. Они образуют резервуары персистирующих патогенов в мочевыводящих путях и периодически вызывают рИМП.

Одним из значимых факторов при развитии рИМП является катетеризация мочевого пузыря. На долю катетер-ассоциированных инфекций приходится до 40% всех внутрибольничных инфекций [18]. Риск инфекции при кратковременной катетеризации (до 7 дней) составляет до 10% и возрастает на 3–7% каждый день продолжения катетеризации [19]. При длительной катетеризации (более 30 дней) бактериурия развивается почти у 100% пациентов [18]. У пациентов с катетер-ассоциированными ИМП образование биоплёнок на поверхностях катетеров, стентов, дренажей и т. п. является фактором развития уросепсиса и приводит к значительным осложнениям течения инфекции и неэффективности лечения [20].

рИМП во многом также связаны c ростом антибиотикорезистентности уропатогенов. Антибиотики остаются основой лечения и профилактики рИМП — около 25% рецептов на антибиотики выдаются при ИМП [21]. Более широкое использование антибиотиков во всём мире и длительное использование антибиотиков в профилактических целях или частое применение комбинаций различных антибиотиков у пациентов с рИМП могут способствовать развитию дальнейшей резистентности. Накопление устойчивых форм бактерий может развиться в течение нескольких недель. Так, E. coli, устойчивая по меньшей мере к 4 антибиотикам, была идентифицирована в фекальных изолятах более чем у 90% пациентов, получавших профилактическое лечение низкими дозами антибиотиков в течение 2 нед [22].

Выявление особенностей сложного взаимодействия уропатогенов с организмом хозяина необходимо как для более глубокого понимания патогенеза рИМП, так и для выбора новых подходов лечения этих широко распространённых бактериальных инфекций.

Цель работы — изучить действие инновационного отечественного антибактериального препарата Fluorothiazinone (ФТ; НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, РУ ЛП-№(005077)-(РГ-RU)) на вирулентные свойства изолятов, полученных из мочи пациентов с хроническими ИМП.

Материалы и методы

Бактериальные изоляты

Клинические изоляты K. pneumoniae 5811, 5672, Pseudomonas aeruginosa 5595, E. coli 5424/1 были выделены из мочи 4 взрослых пациентов обоего пола разных возрастных групп, госпитализированных в НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина — филиал НМИЦ радиологии Минздрава России с клиническими признаками ИМП. Изоляты из мочи были собраны в рамках проведения клинического исследования по Протоколу 07-ФТ-2024, РКИ № 513 от 30.10.2024 г.

Культивирование бактерий

Видовую принадлежность бактерий подтверждали с помощью высевов на плотные питательные среды: LB-агар («BD Difco»), цетримидный агар («HiМedia») с последующим анализом белкового профиля единичных колоний на приборе «Bruker MALDI Biotyper» («Beckman Coulter Diagnostics»).

Клинические уропатогенные изоляты выращивали в течение 18 ч при 37ºC в бульоне Лурия–Бертани (LB-бульоне) с непрерывной аэрацией на шейкере (240 об/мин) до концентрации 10⁹ микробных клеток/мл, что оценивали по стандарту МакФарланда на денситометре «Densi-La-Meter II» («ERBA Lachema»). Полученную бактериальную суспензию разводили до нужных концентраций в свежем LB-бульоне.

Исследуемый препарат

В работе использовали активную фармацевтическую субстанцию ФТ.

Для изучения действия ФТ на подвижность и формирование биоплёнок клиническими изолятами использовали исходный раствор с концентрацией 2 мг/мл в 0,3 М CH₃COONa буфере pH 7,0 ± 0,2. Раствор готовили следующим образом: к навеске субстанции ФТ массой 0,021 г добавляли раствор из 0,120 г гидроксида натрия в 10 мл дистиллированной воды. Далее смесь перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения кристаллов ФТ, подкисляли ледяной уксусной кислотой до pH 7–8. Образовавшийся раствор фильтровали через шприцевую насадку 0,22 мкм в стерильную пробирку. В тестах использовали препарат в конечной концентрации 100 мкг/мл.

Для изучения цитоксичности и внутриклеточного выживания бактерий использовали раствор ФТ в диметилсульфоксиде в концентрации 10 мг/мл, конечная концентрация ФТ в среде составила 20 мкг/мл.

Анализ цитотоксичности

Анализ цитотоксичности проводили согласно методике [23] с некоторыми изменениями. Суточный монослой клеток HeLa (cervical carcinoma cells, ATCC CCL-2^™), выращенный в культуральной среде IMDM («БиолоТ») с 10% эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone») без добавления антибиотиков, 1 × 10⁵ клеток на лунку инфицировали бактериальной культурой при множественности заражения (МОI) 10 и 50. ФТ в концентрации 20 мкг/мл добавляли сразу после внесения бактериальной культуры и инкубировали при 37°C и 5% СО₂ в течение 20 ч. Планшеты центрифугировали в течение 20 мин при 1500 об/мин.

В супернатантах определяли активность высвобождённой лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью набора для анализа нерадиоактивной цитотоксичности «CytoTox 96» («Promega»). ЛДГ — цитозольный фермент, присутствующий в ядерных клетках, высвобождается во внеклеточную среду после разрушения клеточной мембраны. Процент высвобождения ЛДГ рассчитывали относительно неинфицированного контроля (0% высвобождения ЛДГ) и клеток HeLa, лизированных Triton X-100 (100% высвобождения ЛДГ). ЛДГ в бактериальных культурах в среде без монослоя клеток не выявлялась.

Плавательная подвижность

Для оценки плавательной подвижности бактерий культуры выращивали в течение 18 ч при 37°C с аэрацией на шейкере (240 об/мин), разводили в 100 раз LB-бульоном и культивировали в течение 3 ч при условиях, указанных выше. Инокулировали 2 мкл в толщу 0,25% агара, содержащего 1% триптона и 0,5% NaCl, в чашках Петри диаметром 90 мм. Наблюдали в течение 48 ч. Подвижность бактерий оценивали по диаметру зоны миграции бактерий от центра чашки. Эти значения служили положительными контролями при оценке подвижности бактерий.

Для оценки действия ФТ на подвижность клинических изолятов использовали раствор ФТ в ацетатном буфере в концентрации 100 мкг/мл. Для этого в приготовленный 0,25% агар, охлаждённый до 45–50°C, вносили раствор ФТ, хорошо перемешивали и разливали по чашкам Петри. После застывания агара бактериальную культуру вносили в толщу агара в объёме 2 мкл. Образцы культивировали при 30°C во влажной камере в течение 48 ч. Действие ФТ оценивали по диаметру зоны движения бактерий. Изоляты с зоной подвижности менее 10 мм за 48 ч классифицировались как неподвижные, а с зоной более 10 мм — как подвижные. В контрольные чашки вносили ацетатный буфер без ФТ.

Биоплёнкообразование

Изучение способности изолятов к образованию биоплёнок проводили модифицированным методом G.A. O’Toole и соавт. [24]. Культивирование биоплёнки проводили в микротитрационных 96-луночных полистироловых планшетах с TC-обработкой («Corning 3599»). Бактериальные культуры выращивали в LB-бульоне при 37°С в течение ночи на шейкере при 240 об/мин. Ночные культуры разводили до ≈ 10⁷ КОЕ/мл стерильным LB-бульоном с добавлением раствора ФТ в ацетатном буфере в конечной концентрации 100 мкг/мл, вносили в лунки планшета по 200 мкл. В лунки, выбранные в качестве положительного контроля, препарат не добавляли. В качестве отрицательного контроля в лунки вносили стерильный LB-бульон.

Планшеты стационарно инкубировали при 37°C в течение 48 ч. После инкубации содержимое лунок отбирали и трижды промывали 200 мкл стерильного фосфатно-солевого буфера, высушивали на воздухе и фиксировали 96% этанолом в течение 15 мин, затем удаляли этанол, лунки промывали и просушивали.

Окрашивание проводили двумя методами: в течение 15 мин 0,1% кристаллическим фиолетовым («Merck») или в течение 30 мин 0,1% Конго красным («Merck»). По истечении указанного времени краситель отбирали из лунок, промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Для количественного анализа связавшиеся с биоплёнкой красители экстрагировали 200 мкл 96% этанола, экстракт переносили в лунки чистого планшета.

Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра «Multiskan EX» («Thermo Scienfic») при длине волны 540 нм для красителя кристаллический фиолетовый и 492 нм — для Конго красного. Для изучения структуры биоплёнки окрашивание проводили аналогично, лунки промывали и тщательно высушивали на воздухе, затем планшеты изучали под световым микроскопом («Nikon Eclipse 50i», «Nikon») при увеличении 200. Для каждого изолята были выполнены 3 параллельных эксперимента по 3 повтора.

Интернализация и выживаемость бактерий в клетках PC-3

В работе использовали клеточную линию PC-3 (клетки аденокарциномы простаты человека, ATCC CRL-1435). Клетки инкубировали в клеточной среде RPMI-1640 («БиолоТ»), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой («HyClone») без добавления антибиотиков, при 37°C с 5% CO₂ в течение 24 ч. Количество клеток определяли с помощью счётчика клеток «Scepter 2.0» («Millipore»).

Клинические изоляты выращивали в течение 18 ч при 37°C в LB-бульоне с непрерывной аэрацией на шейкере (240 об/мин) до концентрации 10⁹ микробных клеток/мл.

Суточный монослой клеток PC-3, выращенный в 24-луночном культуральном планшете со стерильными круглыми стёклами диаметром 12 мм, инфицировали бактериальной культурой. Дозы заражения для внутриклеточной модели отбирали на основании полученных результатов по цитотоксичности клинических изолятов.

Для оценки инвазии клетки с бактериями инкубировали 1 ч, после чего клетки трижды промывали средой для удаления неприкрепившихся бактерий и инкубировали в течение 1 ч при 37°C и 0,5% CO₂ в среде, содержащей гентамицин («Gibco»), для уничтожения внеклеточных бактерий. Концентрация гентамицина была определена по минимальной подавляющей концентрации (МПК) для каждого изолята. Клетки трижды промывали для удаления гентамицина. Для определения количества бактерий клетки PC-3, заражённые бактериальными культурами, лизировали 0,25% Triton X-100 («Sigma») в течение 10 мин при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля использовали незаражённые клетки PC-3. Далее производили высевы лизатов на цетримидный или LB-агар (в зависимости от вида исследуемого изолята) методом серийных разведений. Количество внутриклеточных бактерий выражали в КОЕ/мл. Рассчитывали среднее значение из бактериальной популяции 2 лунок в 3 экспериментах.

Для оценки начала внутриклеточного размножения монослой клеток культивировали 4 ч и проводили все процедуры удаления внеклеточных бактерий и высева аналогично описанным выше.

Внутриклеточное выживание бактерий в клетках PC-3 оценивали через 24 ч после заражения бактериальной культурой. При этом через 4 ч после заражения клетки инкубировали с гентамицином 1 ч для уничтожения внеклеточных бактерий. Далее планшет трижды промывали для удаления гентамицина и вносили свежую питательную среду с поддерживающей концентрацией гентамицина. Все процедуры удаления внеклеточных бактерий и высева проводили аналогично описанным выше.

Для изучения действия ФТ раствор ФТ в диметилсульфоксиде вносили в культуральную среду в концентрации 20 мкг/мл на разных сроках эксперимента: за 1 ч до заражения, в момент заражения клеток, через 2 и 5 ч после заражения и отмывки от гентамицина с дальнейшей инкубацией в присутствии ФТ в течение 24 ч от момента заражения.

Для проведения микроскопического анализа клетки фиксировали ацетоном и окрашивали мышиными поликлональными антителами (антитела были получены к каждому изоляту) в течение 30 мин при 37°C и 5% CO₂ и антимышиным конъюгатом IgG-FITC («Merck») в течение 30 мин при 37°C и 5% CO₂. Образцы анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа «Nikon Eclipse 50i» («Nikon») при увеличении 1000.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов анализа и визуализации при исследовании бактерий in vitro выполняли с помощью «GraphPadPrism v. 8.4.3» («GraphPad Software»). Данные опытных и контрольных групп сравнивали с использованием t-критерия Стьюдента. Критерием статистической достоверности различия получаемых данных считали величину ошибки р <0,05. Все эксперименты проводили в 3 повторах.

Результаты

Характеристика клинических изолятов

Анализ на чувствительность исследуемых клинических изолятов к антибиотикам выполнен в клинико-диагностической лаборатории НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина — филиала НМИЦ радиологии Минздрава России, результаты представлены в таблице.

 

Значения МПК АБП в отношении исследуемых клинических изолятов

Антибиотикограмма для выделенных микроорганизмов	E. coli 5424/1		P. aeruginosa 5595		K. pneumoniae 5811		K. pneumoniae 5672
	качественный результат	МПК, мг/л	качественный результат	МПК, мг/л	качественный результат	МПК, мг/л	качественный результат	МПК, мг/л
Амикацин	S	≤ 8	S		S	≤ 8	S	≤ 8
Амоксициллин/клавулановая кислота	R		R		R
Ампициллин	R	> 16	R		R	> 16	R	> 16
Ампициллин/сульбактам					R
Гентамицин	R	128	R	16	R	512	S	≤ 2
Имипенем	S	≤ 0,25	S		R	> 8	S	≤ 0,5
Колистин					R
Левофлоксацин			S		R	> 2	R	> 4
Меропенем	S	≤ 0,125	S		R	> 8	I	8
Нитрофурантоин			R
Пиперациллин/тезобактам	S	≤ 4/4	S		R		S	≤ 4/4
Тигециклин	S	≤ 1	R
Тобрамицин	S	≤ 2	S				S	≤ 2
Триметоприм/сульфаметоксазол	S	≤ 2/38			I		S	≤ 2/38
Фосфомицин с глюкозо-6-фосфатом	S	≤ 16					S	≤ 16
Цефазолин	R	> 32	R		R	> 32	R	> 32
Цефепим			S		R	> 8
Цефтазидим			R		R	> 8	R	> 16
Цефтриаксон	S	≤ 1	R		R	> 4	R	> 4
Цефуроксим					R	> 16
Ципрофлоксацин	S	≤ 0,25			R	> 1	R	> 1
Эртапенем	S	≤ 0,25	R		R	> 1	R	> 2

Примечание. S — чувствительный; R — резистентный, устойчивый; I — промежуточный.

 

ФТ не влияет на жизнеспособность клинических изолятов

Действие ФТ на жизнеспособность бактерий оценивали методом культивирования в питательном LB-бульоне в присутствии ФТ в концентрациях 60, 80 и 100 мкг/мл в течение 24 ч с непрерывной аэрацией на шейкере (240 об/мин) и определением КОЕ методом высева. В соответствии с механизмом действия и, как ранее было показано для бактерий разных видов, ФТ не влиял на жизнеспособность изучаемых клинических изолятов.

ФТ подавляет цитотоксичность клинических изолятов

Оба изолята K. pneumoniae характеризовались выраженной цитотоксичностью. Для изолята K. pneumoniae 5811 цитотоксичность при МОI 10 составила 65%, при МОI 50 — 78%. Для изолята K. pneumoniae 5672 цитотоксичность при МОI 10 была 70%, при МОI 50 — 76%.

Цитотоксичность изолятов P. aeruginosa 5595 и E. coli 5424/1 на клеточной линии Hela была менее выражена. При МОI 10 цитотоксичность изолята P. aeruginosa 5595 составила 50%, при МОI 50 — 61%. Для изолята E. coli 5424/1 — 38 и 60% при МОI 10 и МОI 50 соответственно.

В присутствии ФТ в концентрации 20 мкг/мл цитотоксичность через 20 ч культивирования достоверно снижалась при МОI 10 и МОI 50 для всех 4 клинических изолятов в 1,5–2,0 раза.

ФТ подавляет плавательную подвижность

В полужидкой среде бактериальные клетки способны к плавательной подвижности, перемещаясь за счёт жгутиков. K. pneumoniae относится к бактериям, которые не обладают плавательной подвижностью за счёт жгутиков. В связи с этим действие ФТ на плавательную активность оценивали для 2 уропатогенных изолятов: P. aeruginosa 5595 и E. coli 5424/1.

Установлено, что оба клинических изолята обладают плавательной подвижностью. В присутствии ФТ в концентрации 100 мкг/мл в среде культивирования наблюдалось выраженное подавление подвижности, связанной с активностью жгутика (рис. 1).

 

Рис. 1. Подавление плавательной подвижности изолятов через 48 ч инкубации в присутствии ФТ.

Репрезентативные изображения плавательной подвижности на чашках Петри и оценка изменения диаметра зоны подвижности P. aeruginosa 5595 (а) и E. coli 5424/1 (б) в присутствии ФТ в концентрации 100 мкг/мл. Планки погрешностей представляют собой SD 2 повторов.

 

Диаметр зоны распространения бактерий в полужидком агаре для P. aeruginosa 5595 за 48 ч составил 65–67 мм, в присутствии ФТ — 25–27 мм. Для изолята E. coli 5424/1 диаметр зоны подвижности за 48 ч составил 35–37 мм, в присутствии ФТ зона уменьшилась до 12–14 мм. В контрольных чашках с ацетатным буфером без добавления ФТ подвижность не ингибировалась. Тем самым для ФТ было показано подавление подвижности, связанной с работой жгутика.

ФТ подавляет образование биоплёнок

Способность к формированию биоплёнок и влияние ФТ на этот процесс оценивали для 4 изолятов. Количественную оценку плотности биоплёнки проводили при окрашивании бактерий кристаллическим фиолетовым. Через 48 ч изолят P. aeruginosa 5595 формировал интенсивную многоуровневую зрелую биоплёнку, изоляты K. pneumoniae 5672 и E. coli 5424/1 формировали плотный монослой с участками многоуровневой структуры, изолят K. pneumoniae 5811 демонстрировал наименьшую скорость образования биоплёнки: к 48 ч наблюдали образование монослоя с формированием микроколоний.

Добавление ФТ одновременно с внесением бактериальной культуры приводило к достоверному снижению плотности биоплёнки и нарушению её структуры. Все изоляты под действием ФТ формировали на абиотической поверхности разреженный монослой с ячеистой структурой, однако не происходило формирования микроколоний и созревания биоплёнки (рис. 2).

 

Рис. 2. ФТ изменяет структуру и биомассу биоплёнки изолятов K. pneumoniae 5811 (а), K. pneumoniae 5672 (б), P. aeruginosa 5595 (в) и E. coli 5424/1 (г).

Представлены микрофотографии фрагментов сформированной биоплёнки контрольных и опытных образцов с добавлением ФТ в концентрации 100 мкг/мл через 48 ч инкубации. Накопление биомассы биоплёнки оценивали по степени окрашивания кристаллическим фиолетовым при оптической плотности 540 нм.

 

При количественной оценке бактериальной плотности биоплёнки под действием ФТ установлено достоверное снижение количества бактерий в составе биоплёнки: максимальное подавление (на 85%) — для K. pneumoniae 5672, 79% — для E. coli 5424/1, 75% — для P. aeruginosa 5595, 71% — для K. pneumoniae 5811 (рис. 2).

Оценку формирования экзополисахаридного матрикса (ЭПМ) биоплёнки проводили при окрашивании Конго красным. Выявлено, что все изученные изоляты способны формировать ЭПМ, однако биоплёнка K. pneumoniae 5811 характеризовалась наименьшей интенсивностью ЭПМ. Под действием ФТ все изоляты утрачивали способность к биосинтезу ЭПМ (рис. 3).

 

Рис. 3. ФТ ингибирует продукцию ЭПМ биоплёнки изолятов K. pneumoniae 5811 (а), K. pneumoniae 5672 (б), P. aeruginosa 5595 (в) и E. coli 5424/1 (г).

Представлены микрофотографии фрагментов ЭПМ биоплёнки контрольных и опытных образцов с добавлением ФТ в концентрации 100 мкг/мл через 48 ч инкубации. Продукцию ЭПМ биоплёнкой оценивали по степени окрашивания матрикса Конго красным при оптической плотности 492 нм.

 

При количественной оценке показано достоверное снижение формирования ЭПМ для всех изолятов: K. pneumoniae 5811 — на 76%, K. pneumoniae 5672 — на 74%, P. aeruginosa 5595 — на 70%, E. coli 5424/1 — на 67% (рис. 3). Растворитель без содержания ФТ не оказывал влияния на формирование биоплёнки.

Таким образом, все исследованные изоляты способны формировать биоплёнку на абиотической поверхности, а ФТ подавлял формирование зрелой биоплёнки.

ФТ подавляет инвазию и внутриклеточное размножение уропатогенов

Возможность формирования ВБС изучаемыми уропатогенными изолятами оценивали на модели клеточной линии РС-3 (клетки аденокарциномы простаты человека) при заражении изолятами и наблюдении на этапе инвазии и внутриклеточного размножения через 4 и 24 ч. Для оценки действия ФТ на эти процессы препарат вносили за 1 ч до заражения, одновременно с заражением, а также после смены среды (через 2 и 5 ч).

Количество жизнеспособных внутриклеточных бактерий оценивали путём высева разведений лизата клеток после удаления внеклеточных бактерий обработкой гентамицином в течение 1 ч. Параллельно анализировали монослой клеток микроскопированием после окрашивания специфическими антибактериальными антителами.

Для изолята E. coli 5424/1 при заражении использовали дозу 1,5 × 10⁶ КОЕ/мл, что составило MOI 55. Через 1 ч инвазия составила 0,47%, а при действии ФТ — 0,053%. Через 4 ч количество внутриклеточных бактерий в контроле составило 2,1 × 10⁵ КОЕ/мл, а в присутствии ФТ на порядок меньше — 1,1 × 10⁴ КОЕ/мл. Через 24 ч наблюдали увеличение количества E. coli 5424/1 до 2,4 × 10⁶ КОЕ/мл в контрольных образцах при значительном снижении размножения бактерий в присутствии ФТ до 7,5 × 10² КОЕ/мл.

На микрофотографиях монослоя заражённых клеток в контрольных образцах уже через 4 ч выявлялись внутриклеточные конгломераты клеток, которые к 24 ч формировали типичные ВБС. В присутствии ФТ ВБС практически не выявлялись (рис. 4).

 

Рис. 4. Действие ФТ на инвазию и внутриклеточное размножение E. coli 5424/1 в клетках PC-3 в течение 24 ч.

а — микрофотографии клеток PC, инфицированных E. coli 5424/1, через 1, 4 и 24 ч; б — микрофотографии клеток PC-3, инфицированных E. coli 5424/1, через 1, 4 и 24 ч под воздействием ФТ. Фильтр TRITC/Cy3/TagRFP/Alexa Fluor 546. в — количество внутриклеточных бактерий E. coli 5424/1 в клетках PC-3. Данные представлены как М ± SEM 3 независимых экспериментов (p < 0,05).

 

Для изолята K. pneumoniae 5811 также наблюдали формирование ВБС и подавление их образования в присутствии ФТ. Этот изолят показал более низкие значения инвазивности, которая составила для контроля 0,005%, при этом при действии ФТ наблюдали практически близкие показатели инвазивности. Для этого изолята установлено эффективное внутриклеточное размножение: через 4 ч количество внутриклеточных бактерий составило 5,0 × 10⁵ КОЕ/мл, через 24 ч — 2,0 × 10⁶ КОЕ/мл. При действии ФТ наблюдали подавление размножения бактерий — 5,9 × 10² КОЕ/мл через 24 ч. Ингибирование формирования ВБС в присутствии ФТ наглядно продемонстрировано на микрофотографиях (рис. 5).

 

Рис. 5. Действие ФТ на инвазию и внутриклеточное размножение K. pneumoniae 5811 в клетках PC-3 в течение 24 ч.

а — микрофотографии клеток PC-3, инфицированных K. pneumoniae 5811, через 1, 4 и 24 ч; б — микрофотографии клеток PC-3, инфицированных K. pneumoniae 5811, через 1, 4 и 24 ч под воздействием ФТ. Фильтр TRITC/Cy3/TagRFP/Alexa Fluor 546. в — количество внутриклеточных бактерий K. pneumoniae 5811 в клетках PC-3. Данные представлены как М ± SEM 3 независимых экспериментов (p < 0,05).

 

Обсуждение

Установление диагноза ИМП, под которым могут маскироваться и инфекционно-воспалительные заболевания, и бессимптомная бактериурия, иногда трудно распознать, особенно при рецидивирующем течении, из-за сложного механизма взаимодействия уропатогенов с тканями мочевыводящих путей и иммунной системой организма. Международными руководствами рекомендовано ориентироваться только на клинические симптомы заболевания [1]. Несмотря на то что ИМП вызывают патогены различных таксономических групп, и в большей степени эти бактерии являются внеклеточными, тем не менее они используют общую стратегию развития инфекционного процесса: эффективную адгезию, инвазию в эпителиальные клетки и формирование резервуаров патогенов в виде ВБС, покоящихся внутриклеточных резервуаров или поверхностных (на катетерах, инородных телах) биоплёнок. Такая стратегия позволяет уходить от действия антибактериальных препаратов и факторов иммунитета хозяина, что и определяет клиническую и эпидемиологическую актуальность рецидивирующих ИМП.

Новые подходы к лечению таких хронических инфекций должны основываться на понимании механизмов патогенеза и специфическом блокировании звеньев этого механизма. В нашей работе мы оценивали действие активной фармацевтической субстанции антибактериального препарата ФТ на проявление вирулентных свойств клинических изолятов 3 различных видов: K. pneumoniaе, P. aeruginosa и E. coli в условиях in vitro.

ФТ — оригинальный отечественный антибактериальный препарат, отличающийся от антибиотиков по механизму действия, т. к. он не убивает бактерии, а подавляет их вирулентность. Для ФТ показано специфическое блокирование системы секреции III типа (ССТТ), которая ответственна за продукцию токсинов, разрушающих иммунные клетки и способствующих внутриклеточному выживанию бактерий. ФТ ингибирует также жгутиковую подвижность бактерий и образование биоплёнок. Подавление вирулентности приводило к блокированию инфекционного процесса в организме хозяина, что было показано в экспериментах на животных [25–27]. ФТ эффективен в отношении устойчивых к разным классам антибиотиков бактерий, т. к. мишень действия присутствует вне зависимости от наличия детерминант резистентности [28].

В клинических исследованиях на пациентах с острой ИМП установлено, что ФТ в 10 раз снижал развитие рецидивов через 2 и 3 мес после окончания терапии по сравнению с цефепимом, что можно объяснить эффективной эрадикацией уропатогенов в их резервуарах, в том числе внутриклеточных [29].

Известно, что P. aeruginosa и E. coli секретируют цитотоксины прямо в эукариотические клетки посредством ССТТ. В связи с этим мы оценивали действие ФТ на цитотоксичность этих изолятов. Для K. pneumoniaе не показано наличие ССТТ, но описан цитотоксический эффект, связанный с наличием капсульного полисахарида [30].

Для всех проанализированных изолятов, которые характеризовались значительной токсичностью в отношении эпителиальных клеток, показано достоверное подавление гибели клеток в присутствии ФТ.

Наряду с ССТТ мишенью ФТ является жгутик, имеющий близкую структуру в базальной части органеллы. Для подвижных изолятов P. aeruginosa и E. coli наблюдали практически полное блокирование работы жгутика, которое выражалось в отсутствии зоны распространения в полужидком агаре. При этом нужно отметить, что рост бактерий в присутствии ФТ не подавлялся, что было показано в предварительных экспериментах.

Наличие у уропатогенов поверхностных структур, таких как пили, фимбрии и жгутики, способствует адгезии к рецепторам уротелия как первому этапу колонизации мочевого пузыря и, таким образом, являющихся важной мишенью для подавления развития инфекции. Одним из примеров подтверждения эффективности такого подхода, связанного с блокированием адгезии, является применение D-маннозы в клиническом исследовании, которое показало достоверное снижение вероятности развития рецидива при ИМП [31].

Таким образом, показанное при действии ФТ подавление подвижности бактерий, связанное с работой жгутиков, направлено на блокирование первого этапа развития инфекции — этапа колонизации уротелия.

Ключевым звеном развития хронического инфекционного процесса, имеющего рецидивирующее течение и обусловленного длительной персистенцией патогенов, является способность бактерий к активной инвазии в клетки уротелия и образованию внутриклеточных биоплёнкоподобных сообществ.

Мы оценивали действие ФТ на 24-часовой цикл развития изолятов K. pneumoniaе и E. coli в клетках аденокарциномы простаты человека. Ранее установлено, что по своим фармакологическим свойствам ФТ имеет высокую тканевую доступность, проникает внутриклеточно и сохраняет активность в эукариотических клетках [32]. Внесение ФТ в среду культивирования достоверно снижало количество бактерий, формирующих внутриклеточные бактериальные сообщества, что было показано при определении жизнеспособных микроорганизмов и выявлении внутриклеточных структур при микроскопировании через 24 ч контакта патогенов с клетками.

В настоящее время мы изучаем механизмы, благодаря которым ФТ подавляет внутриклеточную репликацию бактерий. С учётом того, что ФТ не оказывает прямого антибактериального действия, предполагаемый механизм заключается в блокировании тех факторов вирулентности бактерий, которые отвечают за взаимодействие с клеткой хозяина при сосуществовании и персистенции бактерий.

Возможность подавления биоплёнок ФТ была показана ранее для различных патогенов, в том числе карбапенемрезистентных возбудителей внутрибольничных инфекций. Изучение динамики формирования биоплёнок in vitro и влияния ФТ на этот процесс показало, что препарат блокирует биоплёнкообразование на этапе объединения микроколоний и образования многослойной структуры. Культивирование в присутствии ФТ оказывает ингибирующее действие на способность изолятов к формированию биоплёнки и, как следствие, снижение продукции экзополисахаридов [26, 27]. Полученные результаты имеют важное практическое значение, поскольку ЭПМ является ключевым фактором в устойчивости биоплёнки к антибактериальным препаратам и защите от иммунного ответа.

Заключение

В проведённых экспериментах по изучению влияния ингибитора ССТТ и жгутика — ФТ на вирулентные свойства клинических изолятов представителей трех видов уропатогенов в условиях in vitro было показано, что ФТ подавляет ключевые этапы установления персистенции бактерий при хронических инфекциях, такие как инвазию в эпителиальные клетки и формирование резервуаров патогенов в виде внутриклеточных бактериальных сообществ и поверхностных биоплёнок. Такие свойства ФТ, как подавление биоплёнок и ингибирование внутриклеточной репликации, являются значительным преимуществом разработанного оригинального отечественного препарата перед используемыми в настоящее время антибиотиками.

About the authors

Lydiya N. Kapotina

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: lidiya.kapotina57@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0159-5053

Cand. Sci. (Technics), senior researcher, Chlamydia department

Russian Federation, Moscow

Elena Yu. Morgunova

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: lena.morgunova.1968@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3142-0983

researcher, Chlamydia department

Russian Federation, Moscow

Stanislava A. Nelyubina

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: 19ctasy94@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5157-1415

junior researcher, Chlamydia department

Russian Federation, Moscow

Elena D. Fedina

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: e.fedina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7205-4310

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Chlamydia department

Russian Federation, Moscow

Ekaterina A. Koroleva

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: korolevakate@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9702-2940

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Chlamydia department

Russian Federation, Moscow

Nataliya Е. Bondareva

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Email: nataliia.d@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5244-2965

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Chlamydia department

Russian Federation, Moscow

Tamara S. Perepanova

National Medical Research Radiological Center

Email: perepanova2003@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2877-0029

Dr. Sci. (Med.), Professor, Head, Infectious and inflammatory diseases and clinical pharmacology group, N. Lopatkin Scientific Research Institute of Urology and Interventional Radiology

Russian Federation, Moscow

Naylia A. Zigangirova

National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya

Author for correspondence.
Email: zigangirova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3188-1608

Dr. Sci. (Biol.), Professor, RAS Corresponding member, Head, Department of medical microbiology

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files