Improvement of the MLVA typing scheme for  Burkholderia mallei  strains

Margarita L. Ledenyova; Леденева Маргарита Леонтьевна; Olga S. Bondareva; Бондарева Ольга Сергеевна; Galina A. Tkachenko; Ткаченко Галина Александровна; Dimitriy V. Ustinov; Устинов Димитрий Владимирович; Irina B. Zakharova; Захарова Ирина Борисовна

doi:10.36233/0372-9311-720

Improvement of the MLVA typing scheme for Burkholderia mallei strains

Authors: Ledenyova M.L.¹, Bondareva O.S.¹, Tkachenko G.A.¹, Ustinov D.V.¹, Zakharova I.B.¹
Affiliations:
1. Volgograd Plague Control Research Institute
Issue: Vol 102, No 5 (2025)
Pages: 615-625
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18873
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-720
EDN: https://elibrary.ru/LXJQDU
ID: 18873

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. The registration of sporadic cases of glanders in horses in Russia, caused by Burkholderia mallei, highlights the importance of developing genotyping algorithms for this pathogen. The MLVA method (multilocus-variable tandem repeat analysis), based on a comparative analysis of the number of variable tandem repeats (VNTRs), remains a promising genotyping tool. As the number of whole-genome sequences in international databases increases, the informative value of VNTR loci changes, necessitating a revisiting of existing typing schemes.

The aim of this study was to assess the feasibility of including the VNTR locus BPSS1974^#I in the MLVA-6 scheme for intraspecies differentiation of B. mallei.

Materials and methods. The study of 64 strains of B. mallei was conducted in silico and in vitro using MLVA, differentiating region amplification, whole-genome sequencing, and bioinformatic analysis.

Results. Genotyping B. mallei using the MLVA-6 scheme failed to determine in silico VNTR profiles of 13 strains from the GenBank NCBI database for one or more loci due to low read coverage of the corresponding genomic regions or their complete absence (null alleles). The effective number of alleles (ne) and the polymorphic information content (PIC) index for the MLVA-6 scheme loci ranged from 3.842–8.103 and 0.740–0.877, respectively. The potential for including the VNTR locus BPSS1974^#I in this scheme was determined based on the molecular stability of the motif within it and a high values for ne and PIC, which were 4.299 and 0.767, respectively. VNTR profiles of the collection strains at locus BPSS1974^#I were identical to the corresponding strains in the GenBank database. The results of the cluster analysis using a combined MLVA-6 scheme and the BPSS1974^#I locus were consistent with the phylogenetic reconstructions obtained using other molecular genetic methods.

Conclusion. The VNTR locus BPSS1974^#I can be considered a marker, the inclusion of which in the MLVA-6 scheme will improve the accuracy of genotyping and the determination of the regions of origin of newly isolated B. mallei strains.

Keywords

Burkholderia mallei, glanders, genotyping, MLVA, tandem repeats

Full Text

Введение

Грамотрицательная бактерия Burkholderia mallei является возбудителем сапа — потенциально смертельного антропозооноза, поражающего в основном непарнокопытных животных: лошадей, мулов и ослов [1, 2]. Заболевание людей связано с их профессиональной деятельностью и возникает при тесном контакте с инфицированными животными, например, у зоотехнических и ветеринарных работников [3]. Известны случаи заражения сотрудников бактериологических лабораторий, проводящих работы с культурами B. mallei [4, 5]. В России возбудитель сапа относят к микроорганизмам II группы патогенности, а за рубежом — к потенциальным агентам биотерроризма группы B, что обусловлено возможностью возникновения чрезвычайной ситуации в области общественного здравоохранения при использовании B. mallei в качестве биологического оружия [6–8].

В настоящее время вспышки или случаи сапа происходят спорадически в ряде регионов Азии и Ближнего Востока, Северной Африки, а также Центральной и Южной Америки [9, 10]. Регистрация завозных случаев сапа у животных в странах, свободных от этого заболевания, создаёт угрозу заражения местного поголовья cкота, людей и возможность реинтродукции инфекции [11, 12].

Случаи сапа регистрируют в сопредельных с Россией странах, что требует настороженности ветеринарных служб в отношении данного заболевания, особенно в регионах Сибири и Дальнего Востока. Вспышка сапа в 2023 г. среди лошадей на территории Читинской государственной заводской конюшни с ипподромом им. Хосаена Хакимова, зарегистрированная Всемирной организацией здравоохранения животных¹, свидетельствует о важности эпидемиологического мониторинга сапа на территории России.

Современные методы внутривидового типирования позволяют получать подробную генетическую характеристику возбудителя для решения таких задач, как расследование случаев заболевания людей или животных, определение эволюционных и филогенетических связей штаммов микроорганизма [13–15]. Однако в случае сапа поиск эффективных ДНК-мишеней осложняется высокой консервативностью генома B. mallei. Высокая плотность микро- и мини-сателлитных повторов (Variable Number Tandem Repeats, VNTRs) в геноме возбудителя сапа определяет перспективность применения схем дифференциации штаммов на основе мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов (Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeat Analysis, MLVA). В зарубежных источниках с этой целью наиболее часто используют схему из 23 VNTR-локусов, первоначально предложенную для возбудителя мелиоидоза — B. pseudomallei, клоном которого, как предполагается, является возбудитель сапа [16]. Однако эта схема не оптимизирована для возбудителя сапа. Большое количество локусов типирования повышает общую стоимость анализа.

Для снижения трудоёмкости и себестоимости метода MLVA актуальной является разработка сокращённых схем, позволяющих при использовании меньшего числа локусов сохранять дискриминирующую силу и достоверность молекулярно-эпидемиологических расследований. Подобранная нами ранее комбинация из 6 VNTR-локусов позволяла дифференцировать штаммы B. mallei с высокой дискриминирующей силой [17]. Вместе с тем информативная ценность VNTR-локусов изменяется по мере увеличения количества новых полногеномных последовательностей в международных базах данных, что требует пересмотра существующих схем типирования.

В недавней работе нами была показана перспективность применения схемы из 5 VNTR- и 4 SNP-локусов для установления географических регионов происхождения штаммов B. pseudomallei и определения клональности изолятов при выявлении случаев мелиоидоза [18]. Предложенный в этом исследовании новый VNTR-локус BPSS1974^#I, расположенный в участке гена BPS_RS29560, характеризовался стабильностью амплификации и наличием ампликонов у всех исследуемых штаммов возбудителя мелиоидоза. Последовательность тандемного повтора (мотива) состояла из 9 пар нуклеотидов и имела вырожденную структуру, которая находилась под действием стабилизирующего отбора. Присутствие в геноме возбудителя сапа ортологичного гена определяет возможность использования локуса BPSS1974^#I для совершенствования 6-локусной схемы MLVA-типирования B. mallei.

Цель исследования — оценить перспективность включения VNTR-локуса BPSS1974^#I в схему MLVA-6 для генетического типирования штаммов B. mallei.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись полногеномные последовательности 56 штаммов возбудителя сапа из базы данных GenBank NCBI². Сформированная нами выборка включала нуклеотидные последовательности штаммов B. mallei, изолированных в эндемичных странах (Индия, Пакистан, Бразилия), некоторых частях Азии и Ближнего Востока, где вспышки или случаи происходят спорадически (Турция, Китай, Мьянма, Бахрейн), а также в США и ряде европейских стран (Венгрия, Югославия).

Для оценки стабильности ДНК-локусов в составе генотипирующих систем использовали 7 штаммов B. mallei из коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора. Коллекционным штаммам P-1, Muksuwar-11, В-120, Ц-4 и Ц-5 соответствовали дубликаты штаммов, депонированные в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур под номерами SCPM-O-B-4688, SCPM-O-B-7093, SCPM-O-B-7146, SCPM-O-B-4682 и SCPM-O-B-4683. В свою очередь коллекционным штаммам Muksuwar-11, Bogor-37 и Zagreb соответствовали штаммы, нуклеотидные последовательности которых депонированы в GenBank NCBI под номерами GCA_033870375.1, GCA_033870395.1 и GCA_033870355.1. Также в исследование включён коллекционный штамм B. mallei 16050, изолированный от лошади в 2023 г. в период вспышки сапа на государственной конюшне в Чите. Нуклеотидные последовательности геномов коллекционных штаммов депонированы в Российскую платформу агрегации информации о геномах возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний «VGARus» (Virus Genome Aggregator of Russia). Всего в исследовании проанализировано 64 штамма возбудителя сапа.

Для постановки полимеразных цепных реакций (ПЦР) при проведении MLVA-типирования и амплификации дифференцирующих регионов генома (Different Region Analysis, DFR) ДНК выделяли с помощью набора реагентов «РИБО-преп» (ЦНИИ Эпидемиологии). Полногеномную ДНК для проведения секвенирования выделяли с помощью набора «Биолабмикс-DU-250» («Биолабмикс») согласно инструкции производителя.

Праймеры и параметры амплификации при типировании с использованием схемы MLVA-6 и локуса BPSS1974^#I описаны нами ранее [17, 18]. VNTR-профиль штаммов определяли как совокупность аллельных вариантов по каждому локусу и представляли в виде числового паттерна количества повторов в схеме «L933k/L3145k/L3652k/L20k/L1217k/S2862k/BPSS1974^#I».

DFR-генотипы определяли методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени по 9 фрагментам: BmVAT1, BmVAT2, BmVAT3, BmVAT4, BmVAT5, BmVAT6, BmVAT7, BmVAT8, BmVAT9, используя последовательности олигонуклеотидов и схему генотипирования, описанные О.С. Бондаревой и соавт. [19]. Результаты DFR-типирования конвертировали в двоичную матрицу, в которой наличие ампликона обозначалось «1», а его отсутствие — «0».

Приготовление библиотек для полногеномного секвенирования осуществляли с помощью набора реагентов «Nextera XT library prep kit», секвенирование проводили на платформе «MiSeq» с использованием набора «MiSeq Reagent Kit v3» (все — «Illumina Inc.»). Исходные нуклеотидные прочтения (риды) обработаны с помощью утилиты Trimmomatic со стандартными параметрами для «Illumina». Обработанные риды собирали с помощью SPAdes v3.15.4 с использованием опции «--isolate» и стандартными параметрами командной строки [20].

Кластерный анализ и построение дендрограмм проводили с использованием программ FAMD v. 1.31 [21] и Mega v. 11.0.11 [22] при помощи алгоритма объединения ближайших соседей и коэффициента генетической дистанции Жаккарда. Для оценки дискриминирующей способности схем типирования использовали индекс Хантера–Гастона (Hunter Gaston discriminatory index, HGDI) [23]. При анализе информативности мини-сателлитных локусов определяли количество аллелей, эффективное число аллелей (ne) и индекс полиморфного информационного содержания (PIC).

Результаты

Анализ in silico показал, что в геноме референтного штамма B. mallei ATCC 23344 (GCA_033956065.1) весь ампликон локуса BPSS1974^#I размером 692 пары нуклеотидов (п. н.) в положении 1627686–1628377 приходился на ген BMA_RS16575 длиной 1755 п. н., расположенный на второй хромосоме. Как и в геноме B. pseudomallei, ген BMA_RS16575 аннотирован в базе данных GenBank NCBI как коллагеноподобный белок, содержащий повтор тройной спирали (WPJ46631.1, 584 п. н.). Сайт для прямого праймера занимал положения 1627686–1627707 в геноме B. mallei ATCC 23344 и 28–49 в последовательности гена BMA_RS16575, для обратного праймера — положения 1628359–1628377 и 701–719 соответственно. Как и в геноме возбудителя мелиоидоза, 3-, 6- и 9-я позиции мотива в составе локуса BPSS1974^#I находились под действием стабилизирующего отбора.

При типировании in silico 56 штаммов B. mallei из базы данных GenBank NCBI с использованием праймеров к локусу BPSS1974^#I выявлены 10 аллельных вариантов, наиболее распространёнными из которых являлись повторы с копийностью 56 и 54 — на их долю приходилось по 17 штаммов. По 55 и 53 повтора имели 9 и 5 штаммов соответственно, для 2 штаммов количество повторов составило 58, остальные 5 вариантов были уникальными. У B. mallei SCPM-O-B-4686 места посадки праймеров отсутствовали (нуль-аллель).

С использованием схемы MLVA-6 нуль-аллели выявлены по локусу L1217k у 14 штаммов из базы данных GenBank NCBI. Анализ молекулярной природы нуль-аллелей показал, что отсутствие продуктов амплификации по локусам BPSS1974^#I и L1217k обусловлено делецией соответствующих фрагментов генома. Нуль-аллели по локусу L1217k, выявленные в 4 полных геномах штаммов B. mallei 6, 34, BMQ и 23344, учтены в дальнейшей работе как одни из аллельных вариантов. Однако геномы штаммов B. mallei BM-1, BM-5, BM-6, Turkey5, NCTC 3709, SCPM-O-B-4682, SCPM-O-B-4683, SCPM-O-B-4684, SCPM-O-B-4688 и SCPM-O-B-4686 представлены набором контигов разной длины, что не исключает отсутствие ПЦР-продукта при анализе in silico по причине неполной нуклеотидной последовательности. Поэтому в дальнейшем эти штаммы были исключены из анализа.

Применение схемы MLVA-6 не позволило определить in silico генотипы штаммов B. mallei BM-1, BM-3, BM-6 и BM-9 по локусу L20k и B. mallei 3076 по локусу L3652k, поскольку целевая VNTR-область оказалась локализованной на разных контигах. В связи с этим данные штаммы также были удалены из исследования.

Исключение 13 штаммов из выборки привело к потере 3 уникальных аллельных вариантов по локусу BPSS1974^#I и одного — по локусу L20k. В табл. 1 представлены штаммы B. mallei, которые в дальнейшем были использованы при проведении кластерного анализа.

Таблица 1. Результаты MLVA- и DFR-типирования штаммов B. mallei

Название штамма B. mallei (номер в GenBank или VGARus)	Место; год выделения	MLVA-профиль*	Номер MLVA-профиля/ кластера**	DFR-тип***
6 (GCA_000755845.1)	Турция; 1950	14/7/8/4,86/–/7/50	1/A	17
Ц-4 (vnip002737)****	Монголия; 1967	11/7/6/17/–/8/54	2/A	06
Ц-5 (vnip002738)****	Монголия; 1967	11/7/6/17/–/8/54	2/A	06
BMQ (GCA_000755885.1)	Индия; 1932	2/4/7/9/–/5/54	1/B	12
23344 (GCA_000755865.1)	Мьянма; 1944	2/4/7/29/–/5/54	2/B	12
NCTC 3708 (GCA_003590195.1)	Индия; 1932	2/6/10/5/7,9/10/55	1/C	24
16050 (vnip002404)****	Россия, Чита; 2023	5/6/11/17/5/10/54	2/C	06
mongolia_1	Монголия; 2022	9/5/16/17/5/6/55	3/C	06
В-120 (vnip002736)****	Россия, Улан-Удэ; 1985	10/6/8/17/5/6/55	4/C	06
SCPM-O-B-7146 (GCA_003627695.1)	Россия, Улан-Удэ; 1985	10/6/8/17/5/6/55	4/C	06
BM-2 (GCA_028621615.1)	Китай, Хэбэй; нет данных	6/8/10/19/4,9/6/55	1/D	16
2002721277 (GCA_003590185.1)	США; 1956	10/8/7/17/4,9/12/55	2/D	16
China5 (GCA_000757315.2)	Китай; 1956	10/8/8/16/4,9/10,4/55	3/D	16
2000031063 (GCA_000756025.2)	Венгрия; нет данных	10/8/8/16/4,9/12/55	4/D	16
P-1 (vnip002735)****	Югославия; нет данных	6/5/11/7/-/6/55	1/E	09
SAVP1 (GCA_000015465.1)	Индия; нет данных	4/5/9/7/9,9/11/55	2/E	04
2000031066 (GCA_003590125.1)	Индия; нет данных	4/5/7/7/13,9/12/54	3/E	21
NCTC 10247 (GCA_000762285.1)	Турция, Анкара; 1960	5/9/12/7/4,9/7/54	1/F	03
34 (GCA_939576165.1)	Нет данных; 1972	10/9/16/7/–/6/54	2/F	20
Bahrain1 (GCA_001729545.1)	Бахрейн; 2011	2/10/14/15/5,9/6/54	1/G1	22
BM-4 (GCA_028621665.1)	Китай, Хэбэй; нет данных	6/10/10/18/8/13/54	1/G2	23
11 (GCA_000959405.1)	Турция; 1949	8/10/10/8/4,9/3/54	2/G2	19
NCTC 10229 (GCA_000015605.1)	Венгрия, Будапешт; 1961	10/10/14/9/4,9/8/54	1/G3	02
2002734299 (GCA_000959165.1)	Венгрия; 1961	10/11/14/9/4,9/8/54	2/G3	02
Ivan (GCA_000986905.1)	Венгрия; 1961	10/10/13/9/4,9/8/54	3/G3	02
BM_campo 2.1 (GCA_905359435.1)	Бразилия; 2016	10/10/13/9/4,9/8/54	3/G3	02
UFAL2 (GCA_905359425.1)	Бразилия; 2017	8/4/9/14/4,9/4/27	1/H	06
PRL-20 (GCA_000169875.1)	Пакистан, Лахор; 2005	5/4/6/6/3,9/7/58	1/I	25
India86-567-2 (GCA_000959465.1)	Индия; нет данных	6/4/8/6/8,9/11/58	2/I	01
Turkey1 (GCA_002345985.1)	Турция; нет данных	7/4/11/6/6,9/7/56	1/J	15
Turkey2 (GCA_002346025.1)	Турция; нет данных	7/4/10/6/6,9/7/56	2/J	15
Turkey3 (GCA_002346065.1)	Турция; нет данных	7/4/7/6/6,9/6/56	3/J	15
Turkey4 (GCA_002346085.1)	Турция; 1960	7/4/11/6/6,9/6/56	4/J	15
Turkey6 (GCA_002346125.1)	Турция; нет данных	7/4/11/6/6,9/6/56	4/J	15
Turkey7 (GCA_002346145.1)	Турция; нет данных	7/4/11/6/6,9/7/56	1/J	15
Turkey8 (GCA_002346165.1)	Турция; нет данных	7/4/11/6/6,9/7/56	1/J	15
Turkey9 (GCA_002346185.1)	Турция; нет данных	7/4/12/6/6,9/7/56	5/J	15
Turkey10 (GCA_002346005.1)	Турция; нет данных	7/4/11/6/6,9/7/56	1/J	15
Muksuwar-11 (vnip002733)****	Индия; 1979	5/4/8/17/6,9/12/53	1/K	11
SCPM-O-B-7093 (GCA_003627585.1)	Индия; 1979	5/4/8/17/6,9/11/53	2/K	07
Mukteswar (GCA_033870375.1)	Индия; 1996	5/4/8/17/6,9/11/53	2/K	11
Zagreb (vnip002734)****	Югославия; нет данных	5/4/8/15/6,9/6/53	3/K	07
Bogor-37 (vnip002732)****	Индонезия; 1979	5/4/8/15/6,9/11/53	4/K	07
Zagreb (GCA_033870355.1)	Югославия; 1996	5/4/8/15/6,9/11/53	4/K	07
Bogor (GCA_033870395.1)	Индонезия; 1995	5/4/8/15/6,9/11/53	4/K	07
Kweiyang#4 (GCA_001608335.1)	Китай; 1942	9/7/4/24,71/6,9/15/56	1/L	22
2002721274 (GCA_002522985.1)	США; 1956	9/7/4/19/6,9/16/56	2/L	01
ATCC 23344 (GCA_033956065.1)	Мьянма; 1942	8/7/4/31/6,9/15/56	3/L	01
JHU (GCA_002346205.1)	США, Мэриленд; 2000	8/7/4/27/6,9/15/56	4/L	01
FMH 23344 (GCA_000755785.1)	Мьянма; 1944	8/7/4/27/6,9/15/56	4/L	01
FMH (GCA_002346045.1)	США, Мэриленд; 2000	8/7/4/27/6,9/15/56	4/L	01

Примечание. *MLVA-профиль штаммов записан в виде числового паттерна количества повторов в схеме «L933k/L3145k/L3652k/L20k/L1217k/S2862k/BPSS1974^#I».

**Каждому MLVA-профилю присвоен порядковый номер внутри соответствующего кластера, сформированного при построении дендрограммы.

***Номера DFR-типам присвоены в соответствии с ранее опубликованными данными [19].

****Штаммы из коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора.

В результате амплификации VNTR-локусов у коллекционных штаммов B. mallei получены ПЦР-продукты, представляющие на электрофореграмме единичные полосы. При этом продукт амплификации по локусу L1217k отсутствовал у 3 штаммов из коллекции (B. mallei P-1, Ц-4 и Ц-5). Последующее секвенирование ампликонов позволило установить соответствующее число повторов для каждого локуса. В дальнейшем при расчёте показателей полиморфизма VNTR-локусов проводили совместный учёт MLVA-профилей штаммов из GenBank NCBI и коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (табл. 1).

При расчёте эффективного числа аллелей (ne) и индекса полиморфного информационного содержания (PIC) для локуса BPSS1974^#I установлены значения 4,299 и 0,767 соответственно. В скорректированной выборке штаммов количество аллелей по локусам схемы MLVA-6 было распределено следующим образом: минимальное число в локусах L3145k (ne = 4,257; PIC = 0,765) и L933k (ne = 7,087; PIC = 0,859) — 8 и 10 аллелей соответственно, в локусах L3652k (ne = 7,368; PIC = 0,864) и L1217k (ne = 3,842; PIC = 0,74) — по 11 аллелей, в локусе S2862k (ne = 7,628; PIC = 0,869) — 13 аллелей, максимальное число в локусе L20k (ne = 8,103; PIC = 0,877) — 16 аллелей. HGDI при добавлении локуса BPSS1974^#I к схеме MLVA-6 не изменился и составил 0,981.

Для анализа генетического полиморфизма штаммов, VNTR-профили которых были достоверно определены, дополнительно использовали метод амплификации дифференцирующих регионов генома. В результате 51 штамм возбудителя сапа был распределён по 19 DFR-типам, из которых 6 выявлены впервые (DFR20 — 001110011, DFR21 — 000111110, DFR22 — 111110110, DFR23 — 110110111, DFR24 — 010111010, DFR25 — 111101100).

При сравнении дендрограмм, построенных на основании результатов типирования с использованием схемы MLVA-6 (рисунок, а), и при включении в эту схему локуса BPSS1974^#I (рисунок, б) наблюдали отличия во взаиморасположении прикорневых кластеров и отдельных штаммов. Так, при сочетанном использовании схемы MLVA-6 и локуса BPSS1974^#I сформирован новый кластер, обозначенный нами как G и состоящий из подкластеров G1, G2 и G3. Подкластер G1 сформировал штамм B. mallei Bahrain1. Подкластер G2 включал штаммы BM-4 и B. mallei 11, а подкластер G3 — штаммы B. mallei NCTC 10229, 2002734299 и Ivan, выделенные сотрудниками Печского института в Венгрии в 1961 г., и B. mallei BM_campo 2.1. Для штаммов подкластера G3 установлен общий DFR-тип (DFR02), а их MLVA-профили отличались на 1 повтор по локусам L3145k и L3652k, при этом VNTR-генотипы штаммов BM_campo 2.1 и Ivan полностью идентичны.

Сравнительный анализ результатов типирования 51 штамма B. mallei с помощью схемы MLVA-6 (а) и сочетанного использования схемы MLVA-6 и локуса BPSS1974^#I (б).

Одним цветом отмечены идентичные прикорневые кластеры. а: пунктирной линией отмечены штаммы, расположение которых изменилось при включении локуса BPSS1974^#I. Рамкой выделены штаммы из коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

На соседних ветвях дендрограммы расположены штаммы из кластеров F и E. Для штаммов из кластера F — B. mallei 34 неизвестного происхождения и NCTC 10247 — определено одинаковое число повторов по VNTR-локусам L3145k, L20k и BPSS1974^#I, а их DFR-профили были уникальны и отличались по локусам BmVAT1 и BmVAT6. В кластер E вошли штаммы из Индии (2000031066 и SAVP1) с идентичным MLVA-профилем по локусам L933k, L3145k и L20k, при этом их DFR-типы также являлись уникальными и отличались отсутствием локуса BmVAT6 у B. mallei SAVP1. Отдельную ветвь в составе кластера E сформировал штамм B. mallei P-1 из Югославии.

Включение локуса BPSS1974^#I в схему типирования позволило расположить штамм B. mallei BM-2 в виде отдельной ветви в составе кластера D, состоящего из штаммов B. mallei 2002721277, China5 и 2000031063. У всех штаммов этого кластера установлено одинаковое число повторов по локусам L3145k, L1217k и BPSS1974^#I, а также идентичный DFR-профиль (DFR16).

Генотип по локусу BPSS1974^#I, соответствующий 58 повторам, был выявлен только у индийского штамма B. mallei India86-567-2 и PRL-20, что позволило выделить эти штаммы в отдельный кластер I. Штамм India86-567-2 принадлежал к типу DFR01, а PRL-20 — к впервые выявленному нами типу DFR25, который отличался от DFR01 отсутствием локусов BmVAT5 и BmVAT8.

Особенно интересно положение выделенного и идентифицированного нами штамма B. mallei 16050, сформировавшего общий кластер с B. mallei mongolia_1 и генетически идентичными по MLVA-профилю B. mallei B-120 и его дубликатом SCPM-O-B-7146. У всех 4 штаммов выявлены идентичные DFR-профиль (DFR06) и VNTR-профили по локусам L20k и L1217k. При этом у B. mallei mongolia_1 и B-120 также определено одинаковое число повторов по локусам S2862k и BPSS1974^#I, а по локусам L933k и L3145k они отличались на 1 повтор, что позволило выделить эти штаммы в отдельную ветвь внутри кластера С. Для B. mallei 16050 более тесная связь установлена со штаммом B. mallei B-120, поскольку их MLVA-профили содержали по 6 повторов в локусе L3145k.

Отдельную кластерную группу сформировал штамм UFAL2 (Бразилия, 2017 г.) с уникальным количеством повторов по локусам L20k (n = 14), S2862k (n = 4) и BPSS1974^#I (n = 27). При этом B. mallei UFAL2 наряду со штаммами из России и Монголии принадлежал к типу DFR06.

MLVA-профили дубликатов штаммов из различных коллекций были идентичны или отличались только по 1 из локусов, что позволяло им сохранять принадлежность к одному кластеру. Так, по локусу L933k выявлены различия на 3 повтора у B. mallei Ц-4 и SCPM-O-B-4682 и на 1 повтор у B. mallei Ц-5 и SCPM-O-B-4683. Штамм Muksuwar-11 отличался от штаммов SCPM-O-B-7093 и Mukteswar (GCA_033870375.1) на 1 повтор по локусу S2862. Штамм Zagreb из коллекции нашего института отличался от Zagreb (GCA_033870355.1) на 5 повторов по локусу S2862 (табл. 2).

Таблица 2. MLVA-профили дубликатов штаммов B. mallei из различных коллекций

Название штамма B. mallei (номер в GenBank)	Количество повторов в локусах
Название штамма B. mallei (номер в GenBank)	L933k	L3145k	L3652k	L20k	L1217k	S2862k	BPSS1974^#I
P-1*	6	5	11	7	–	6	55
SCPM-O-B-4688 (GCA_003627635.1)**	6	5	11	7	–	6	55
Muksuwar-11*	5	4	8	17	6,9	12	53
SCPM-O-B-7093 (GCA_003627585.1)**	5	4	8	17	6,9	11	53
Mukteswar(GCA_033870375.1)***	5	4	8	17	6,9	11	53
В-120*	10	6	8	17	5	6	55
SCPM-O-B-7146 (GCA_003627695.1)**	10	6	8	17	5	6	55
Ц-4*	11	7	6	17	–	8	54
SCPM-O-B-4682 (GCA_003627705.1)**	14	7	6	17	–	8	54
Ц-5*	11	7	6	17	–	8	54
SCPM-O-B-4683 (GCA_003627655.1)**	10	7	6	17	–	8	54
Bogor-37*	5	4	8	15	6,9	11	53
Bogor (GCA_033870395.1)***	5	4	8	15	6,9	11	53
Zagreb*	5	4	8	15	6,9	6	53
Zagreb(GCA_033870355.1)***	5	4	8	15	6,9	11	53

Примечание. *Штаммы B. mallei из коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

**Штаммы B. mallei, депонированные в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур.

***Штаммы B. mallei из Института Фридриха Леффлера Федерального научно-исследовательского института здоровья животных Германии.

В результате дополнение локусом BPSS1974^#I схемы MLVA-6 позволило выявить более тесную генетическую связь ряда штаммов и сформировать новые кластеры, коррелирующие с их DFR-профилями.

Обсуждение

Эффективность внутривидового типирования возбудителей инфекционных заболеваний в значительной степени определяется доступностью нуклеотидных последовательностей их геномов. Проведение полногеномного секвенирования и последующая сборка генома возбудителя сапа осложнены большим количеством повторяющихся последовательностей и высоким содержанием GC. В результате из депонированных в GenBank NCBI на май 2025 г. 113 геномов B. mallei только 33 являлись полными, а большинство остальных геномов представлены десятками или сотнями контигов. При этом часть штаммов возбудителя сапа не были уникальными.

У ряда штаммов из сформированной нами выборки in silico установить VNTR-генотип по отдельным локусам было невозможно. Низкое покрытие ридами областей генома, соответствующих локусам L20k и L3652k, не позволило локализовать целевую VNTR-область в пределах одного контига у 5 штаммов. Недостаточное покрытие при секвенировании может быть обусловлено GC-составом этих регионов, составившее более 70% у референтного штамма B. mallei ATCC 23344.

Другая проблема при поиске целевых VNTR-локусов в неполных геномах — отсутствие соответствующих этим локусам участков генома (нуль-аллели). В этом случае не существует надёжного способа определения причины возникновения нуль-аллелей: это может быть следствием как естественных эволюционных изменений, так и ошибок при сборке геномов. Нами были обнаружены нуль-аллели по локусу L1217k у 14 штаммов из выборки, 10 из которых были представлены неполными геномами, что привело к их исключению из дальнейшего исследования. При проведении ПЦР с ДНК коллекционных штаммов продукт амплификации по локусу L1217k отсутствовал у 3 штаммов. Вместе с тем нуль-аллели в полных геномах увеличивают риск ложной гомоплазии, поэтому во многих популяционных исследованиях такие локусы исключают из анализа. Однако вероятность регистрации нуль-аллеля на каждый локус возрастает при увеличении самой выборки, что может привести к исключению большого числа локусов, а это в свою очередь отрицательно повлияет на качество исследований.

В результате из первоначальной выборки были исключены 13 штаммов, а оставшийся 51 штамм B. mallei с помощью 6-локусной схемы VNTR-типирования был распределён по 39 MLVA-типам (HGDI = 0,981). Перспективность включения в эту схему локуса BPSS1974^#I определялась структурой мотива в его составе, вырожденность которого снижает вероятность ошибок ДНК-полимеразы в ходе репликации и секвенирования. При этом последовательность самого мотива находится под действием стабилизирующего отбора, что способствует его сохранению в геноме.

В проведённом нами исследовании установлено, что все VNTR-локусы имели PIC > 0,5, что указывало на их высокую дискриминационную силу, при этом эффективное число аллелей варьировало от 3,842 до 8,103 на локус и в среднем составило 6,381. По этим показателям локус BPSS1974^#I занимал промежуточное положение между VNTR-локусами L3145k и L933k, представленными совершенными и вырожденными мини-сателлитными повторами соответственно.

Успешная амплификация локуса BPSS1974^#I при проведении ПЦР с ДНК штамма B. mallei 16050, выделенного от больной лошади в 2023 г., свидетельствовала о стабильности областей, фланкирующих VNTR-регион. В свою очередь полноразмерная нуклеотидная последовательность локуса BPSS1974^#I, выявленная при анализе данных полногеномного секвенирования штамма B. mallei 16050, показала его перспективность при проведении in silico MLVA-типирования.

Полученные нами результаты кластерного анализа штаммов B. mallei на основе определения количества повторов в 7 VNTR-локусах были сопоставлены с данными мультилокусного сиквенстипирования коровой области генома (core genome multilocus sequence typing, cgMLST), проведённого S. Appelt и соавт. [13]. Сравнение показало, что состав и взаимное расположение кластеров имели много общих черт. Так, по данным cgMLST, штаммы из Китая были сгруппированы в два основных кластера, соответствующие на построенной нами дендрограмме MLVA-кластерам D и L. В состав этих кластеров входили штаммы, у которых в GenBank географическим регионом происхождения указаны США: кластер L включал штаммы B. mallei 2002721274, JHU и FMH, а кластер D — B. mallei 2002721277. Установленная нами кластеризация согласовывалась с результатами cgMLST и свидетельствовала о вероятном китайском происхождении этих штаммов. Внутри кластера D подтверждена тесная связь между штаммами 2000031063 (Венгрия) и China5 (Китай), MLVA-профили которых отличались только по локусу S2862k. Наряду с данными cgMLST генетическая близость штаммов внутри MLVA-кластеров D и L подтвердилась и по результатам проведённого нами DFR-типирования. Так, за исключением B. mallei Kweiyang^#4, у которого отсутствовал продукт амплификации по локусу BmVAT6, для всех штаммов каждого кластера определён общий DFR-профиль.

Исследованные в ходе работы штаммы из Турции вошли в состав 3 разных кластеров. Дополненная локусом BPSS1974^#I схема MLVA-6 позволила распределить штаммы из этих кластеров в соответствии с их положением на минимальном остовном дереве, построенном на основании данных cgMLST [13]. Так, по результатам типирования только с использованием схемы MLVA-6 в один кластер со штаммами из Турции был включён штамм B. mallei PRL-20. Определение количества повторов по локусу BPSS1974^#I позволило выделить на дендрограмме B. mallei PRL-20 в отдельную ветвь со штаммом B. mallei India86-567-2 из Индии, а штаммы из Турции сформировали отдельный самый многочисленный кластер J. Два других штамма из Турции (B. mallei 11 и NCTC 10247) вошли соответственно в состав подкластера G2 и кластера F.

Включение локуса BPSS1974^#I в схему MLVA-6 позволило наряду со штаммом B. mallei India86-567-2 уточнить положение другого индийского штамма — B. mallei 3708, который сформировал отдельную ветвь в составе кластера C. Установленная с помощью разработанной схемы MLVA-7 кластеризация индийских штаммов согласовывалась с данными, полученными в исследовании H. Singha и соавт. [24]. В представленной работе на основании MLVA-типирования по 23 локусам выявлена принадлежность штаммов B. mallei India86-567-2, Mukteswar, SAVP1, BMQ и NCTC 3708 к разным кластерам, что соответствовало полученным в ходе нашего исследования результатам.

Установленные нами MLVA- и DFR-профили бразильских штаммов подтвердили ранее выдвинутое предположение о разных актах интродукции возбудителя сапа в Бразилию [25]. Так, выявленная нами тесная генетическая связь внутри подкластера G3 между штаммами европейского происхождения и BM_campo 2.1 свидетельствовала о возможном завозе сапа в Бразилию из Европы, вероятно, при колонизации или торговле.

Включение в схему MLVA-6 локуса BPSS1974^#I позволило локализовать штамм B. mallei 11 в соседнем подкластере G2, что соответствовало данным M.V.D. Falcão и соавт. [25]. Авторы проводили типирование штаммов по 15 филогенетически информативным однонуклеотидным полиморфизмам методом ПЦР с последующим анализом плавления высокого разрешения, в результате которого была идентифицирована ветвь L3B3sB3, включающая штаммы из сформированных в нашей работе MLVA-кластеров G2 и G3. При анализе однонуклеотидных полиморфизмов [25] также показана принадлежность штамма B. mallei UFAL2 к ветви L3B2, включающей штаммы, выделенные на территории Бразилии. Из-за отсутствия в Genbank нуклеотидных последовательностей других бразильских штаммов нам не удалось определить MLVA- и DFR-профили штаммов линии L3B2. Вместе с тем уникальный VNTR-профиль штамма B. mallei UFAL2 позволил выделить его в отдельный MLVA-кластер H, что соответствует разделению бразильских штаммов по разным филогенетическим линиям.

По результатам MLVA- и DFR-анализа установлено тесное генетическое родство между штаммами B. mallei B-120 и 16050, выделенными с разницей в 18 лет от больных животных на территории Восточной Сибири, и штаммом B. mallei mongolia_1, изолированным от больной лошади в Монголии в 2022 г. Принадлежность к одному DFR-типу (DFR06) и общий уникальный VNTR-профиль по локусам L20k и L1217k, наряду с географической близостью территорий этих стран, где были зарегистрированы вспышки сапа, позволяют предположить общий источник происхождения этих штаммов. Вместе с тем B. mallei Ц-4 и Ц-5, выделенные в Монголии в 1967 г., сформировали отдельный MLVA-кластер. DFR-тип (DFR06) был также идентифицирован у бразильского штамма B. mallei UFAL2. Общие DFR-профили для штаммов из разных MLVA-кластеров были выявлены и в ряде других случаев, что может свидетельствовать о снижении специфичности выбранных DFR-локусов по мере увеличения числа нуклеотидных последовательностей геномов B. mallei в генетических базах данных.

Выявленные изменения в VNTR-профилях дубликатов штаммов B. mallei из разных коллекций могут быть связаны с условиями хранения, в частности с методами поддержания бактериальных культур. В работе J.M. U’Ren и соавт. [26] при исследовании стабильности 32 VNTR-локусов, предложенных для типирования штаммов возбудителя мелиоидоза, с помощью метода серийных пассажей на чашках установлены изменения в 12 локусах. При этом мутации были выявлены в локусах L933k, L3145k и S2862k, которые вошли в разработанную нами схему типирования штаммов возбудителя сапа. Установленная в нашей работе вариабельность локусов L933k и S2862k в геномах дубликатов штаммов B. mallei свидетельствовала о сходном характере изменчивости этих VNTR-локусов у патогенных буркхольдерий. Для локуса BPSS1974^#I определена стабильность его молекулярной структуры у штаммов в условиях разных коллекций, что важно при проведении эпидемиологических расследований и эволюционного анализа.

Заключение

VNTR-локус BPSS1974^#I можно расценивать как маркер, включение которого в схему MLVA-6 позволит повысить точность генотипирования и установления регионов происхождения вновь выделенных штаммов возбудителя сапа. Наряду с совершенствованием схем дифференциации штаммов возбудителя сапа для более эффективного внутривидового типирования необходимо увеличение количества доступных для анализа нуклеотидных последовательностей геномов B. mallei в сочетании с дополнением метаданных о точном географическом происхождении.

¹ Russia — Burkholderia mallei (Inf. with) (Glanders) — Follow up report 1 [FINAL]. URL: https://wahis.woah.org/#/in-review/4915

² URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome