Investigation of the pathogenic potential and the possibility of cross-species transmission of H5 avian influenza viruses detected on the territory of the Russian Federation in 2018–2022

Nikolay G. Zinyakov; Зиняков Николай Геннадьевич; Alena D. Grekhneva; Грехнева Алена Дмитриевна; Artem V. Andriyasov; Андриясов Артём Валерьевич; Evgeniya V. Ovchinnikova; Овчинникова Евгения Валерьевна; Nelli A. Guseva; Гусева Нелли Андреевна; Anton A. Kozlov; Козлов Антон Александрович; Zoya B. Nikonova; Никонова Зоя Борисовна; Pavel D. Zhestkov; Жестков Павел Дмитриевич; Dmitry B. Andreychuk; Андрейчук Дмитрий Борисович; Ilya A. Chvala; Чвала Илья Александрович

doi:10.36233/0372-9311-646

Investigation of the pathogenic potential and the possibility of cross-species transmission of H5 avian influenza viruses detected on the territory of the Russian Federation in 2018–2022

Authors: Zinyakov N.G.¹, Grekhneva A.D.¹, Andriyasov A.V.¹, Ovchinnikova E.V.¹, Guseva N.A.¹, Kozlov A.A.¹, Nikonova Z.B.¹, Zhestkov P.D.¹, Andreychuk D.B.¹, Chvala I.A.¹
Affiliations:
1. Federal Centre for Animal Health
Issue: Vol 102, No 3 (2025)
Pages: 350-361
Section: ORIGINAL RESEARCHES
URL: https://microbiol.crie.ru/jour/article/view/18760
DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-646
EDN: https://elibrary.ru/RWAMOM
ID: 18760

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Introduction. The rapid evolution of highly pathogenic avian influenza (HPAI) viruses through antigenic drift and reassortment can lead to enhanced replication efficiency and cross-species transmission to mammals, as evidenced by recent outbreaks in various animal populations. Identifying mammalian pathogenicity markers in circulating HPAI viruses is crucial for evaluating their pathogenic potential and ability to cross species barriers.

The aim. This study analyzed genomic sequences of highly pathogenic H5 avian influenza virus (AIV) isolates collected in the Russian Federation between 2018 and 2022.

Materials and methods. We utilized original complete genome sequencing data alongside with nucleotide sequences of H5 AIV isolates and strains available in public databases.

Results. Analysis revealed a predominance of viruses with replication complexes adapted to avian cells. Examination of viral hemagglutinin amino acid sequences showed that most strains maintained receptor-binding sites of avian origin, with enhanced affinity for SAα-2,3-Gal receptors present in avian epithelial cells. However, we identified several mammalian virulence factors that have emerged and spread within the avian influenza virus population, including full-length active PB1-F2 protein, a 5-amino-acid insertion in the NS1 protein, and specific amino acid substitutions in the M1 protein.

Conclusion. The presence of mammalian pathogenicity factors in the avian influenza virus population may facilitate successful cross-species transmission through suppression of specific immune responses, followed by adaptation of viral hemagglutinin to mammalian cell receptors through antigenic drift and natural selection. The observed elimination of certain adaptive mutations from the avian influenza virus population validates the effectiveness of stamping-out policies and vaccination restrictions in industrial poultry farming as important measures to mitigate the zoonotic potential of avian influenza.

Keywords

avian influenza, genetic analysis, amino acid substitutions, adaptive mutations, cross-species transmission of the virus

Full Text

Введение

Вирус гриппа птиц (ВГП) является возбудителем опасной высококонтагиозной болезни домашних и диких птиц, характеризующейся преимущественно поражением органов дыхания и пищеварительного тракта. В случае инфицирования вирусами высокопатогенного гриппа птиц (ВПГП) подтипов Н5 или Н7 гибель птиц достигает 100%. В 1996 г. в Китае был обнаружен вирус гриппа подтипа H5N1 A/goose/Guangdong/1/1996, который впоследствии был признан основоположником генетической линии ВПГП Gs/Gd/96. Со временем изоляты вирусов этой генетической линии получили широкое распространение не только в странах Азии, но и по всему миру. Так, с 2005 по 2007 г. вспышки болезни, вызванные этим подтипом вируса, нанесли значительный ущерб птицеводству России. С 2014 г. на территории России выявляли в том числе вирус ВПГП подтипа H5N8, с 2016 г. — подтипа H5N5, с 2018 г. — подтипа H5N6. В 2018–2019 гг. вспышки ВПГП (подтипы H5N1, H5N6 и H5N8) регистрировали среди дикой и домашней птицы в странах Азии и Африки, на территории России — в Центральном, Южном, Приволжском и Дальневосточном федеральных округах, в том числе у сельскохозяйственных птиц на птицефабриках (подтип H5N8). В 2020 г. ВПГП H5N8 широко распространился в странах Европы и Ближнего Востока, на территории России и Казахстана [1, 2]. Кроме того, в Омской, Ростовской, Астраханской областях выявляли ВПГП подтипа H5N5. В конце 2020 г. вирус H5N8 был выявлен у людей, контактировавших с больной птицей на птицефабрике Астраханской области [3, 4].

В 2021–2022 гг. широкое распространение получил ВПГП подтипа H5N1 — вспышки болезни регистрировали в странах Европы, Азии, Африки и Северной Америки [4]. Большую озабоченность вызвали вспышки гриппа среди млекопитающих, таких как норки, лисицы, морские котики [5–9]. У выделенного вируса были обнаружены замены, которые указывают на адаптацию к размножению в организме млекопитающих. На настоящий момент ВПГП на территории России представлен подтипом Н5N1. В августе 2023 г. на территории острова Сахалин был обнаружен мертвый морской котик^¹, а исследование патологического материала от животного показало наличие ВГП подтипа H5N1.

Весной 2024 г. в США впервые выявили вирус ВПГП Н5N1 у коров на молочной ферме. Из клинических признаков наблюдались мастит, летаргия, снижение потребления корма, диарея и выделения из носа. С тех пор вирус был выявлен на молочных фермах не менее чем в 13 штатах США, также подтверждено выделение вируса в окружающую среду с молоком. Выявленный вирус отнесли к генетической кладе 2.3.4.4b и генотипу B3.13, циркулирующему у диких и домашних птиц на территории стран Северной Америки с 2021 г. [10, 11]. Через некоторое время вирус ВПГП Н5N1 был выявлен у больных и погибших кошек [12] и человека — работника молочной фермы. Вирус, идентифицированный в пробах от человека, имел аминокислотную замену в белке PB2 (E627K), которая связана с вирусной адаптацией к хозяевам-млекопитающим и ранее обнаружена у людей и других млекопитающих, инфицированных вирусами ВПГП Н5N1 и другими подтипами ВГП типа A, включая H7N9 и H9N2 [13]. Передача вируса ВПГП от птиц к млекопитающим и затем доказанный межвидовой переход от коров к кошкам и человеку указывают на существенную угрозу общественному здоровью.

Наличие у вируса гриппа типа А полиосновного сайта протеолитического расщепления белка гемагглютинина обеспечивает возможность обширного инфекционного процесса, затрагивающего различные органы и ткани, у разных видов животных. Возможность же репликации вируса и противодействие иммунному ответу организма хозяина обеспечивается другими вирусными белками. Ранее различными группами учёных были выявлены специфичные аминокислотные замены, которые обеспечивают возможность репликации в организме млекопитающих, противодействие иммунному ответу и более тяжёлое протекание инфекционного процесса [14–54].

Целью данной работы был анализ генома ВГП, выявленных на территории России, на наличие маркеров патогенности, потенциально способствующих преодолению вирусом межвидового барьера от птиц к млекопитающим и оценке патогенного потенциала циркулирующих вирусов как возбудителей зооантропонозного заболевания.

Материалы и методы

Биоматериал

В работе исследовали изоляты ВГП подтипа Н5, выделенные из биоматериала от птиц в ВНИИЗЖ в 2018–2022 гг. В качестве материала использовали вируссодержащую аллантоисную жидкость эмбрионов кур, свободных от патогенов, или, в случае невозможности выделения вирусов на эмбрионах кур, патологический материал от птиц (клоакальные и трахеальные смывы, 10–20% суспензии органов, приготовленные на основе 0,9% NaCl).

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23.07.2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом Федерального центра охраны здоровья животных (протокол № 17 от 24.04.2023).

Выделение РНК

Выделение суммарной РНК осуществляли с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).

Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция

Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) проводили в одну стадию с помощью реагентов для амплификации («Синтол») и систем праймеров и зондов для амплификации фрагментов генов MP и HA.

Реакцию ОТ проводили в две стадии (отжиг праймеров и непосредственно ОТ) с использованием набора реактивов «Maxima H Minus Reverse Transcriptase» (включает RT-буфер и ревертазу Maxima H; «Thermo Fisher Scientific»), ингибитора РНКаз «RiboLock RNase Inhibitor» («Thermo Fisher Scientific»), раствора dNTPs («Синтол»), бидистиллированной воды, свободной от РНКаз, и раствора прямых специфичных сегмент-универсальных праймеров для амплификации всех сегментов ВГП типа А. Классическую ПЦР проводили с использованием реагентов для амплификации («Синтол») и системы специфичных сегмент-универсальных праймеров для амплификации всех сегментов ВГП типа А. Очистку продуктов ПЦР из ПЦР-смеси осуществляли с помощью набора «Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System» («Promega»).

Секвенирование

Полногеномное секвенирование проводили с помощью генетического анализатора «MiSeq» («Illumina») в соответствии с инструкцией к прибору. Для приготовления библиотек использовали коммерческие наборы «Nextera XT» и «Nextera XT Index Kit» («Illumina»).

Нуклеотидные последовательности

В работе использованы результаты собственного полногеномного секвенирования и нуклеотидные последовательности изолятов и штаммов ВГП подтипа Н5 из России, опубликованные в базе данных GenBank электронного ресурса NCBI^² и на платформе EpiFlu^³ (см. Приложение на сайте журнала https://microbiol.crie.ru/jour).

Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы «BioEdit v. 7.0.5.3». Последовательности выравнивали с помощью программы множественного выравнивания «ClustalW». Филогенетическое дерево строили по алгоритму NJ в реализации пакета «MEGA v. 7.06».

Результаты

В результате исследований, проведённых в 2018–2022 гг. и охвативших все федеральные округа РФ, специалистами ВНИИЗЖ были выявлены 1082 пробы, содержавшие генетический материал ВГП подтипа Н5 (табл. 1).

Таблица 1. Результаты исследования проб на наличие генома ВГП подтипа H5 на территории России с 2018 по 2022 г.

Год	Количество исследованных проб	Количество проб, содержавших ВГП/H5
Год	Количество исследованных проб	от домашних птиц	от диких птиц
2018	2749	208	0
2019	5558	2	0
2020	6288	222	27
2021	6418	297	56
2022	6087	250	20
Сумма	27 100	979	103

ВГП подтипа H5 на протяжении всего срока исследования выявляли преимущественно в пробах от домашних птиц (табл. 1). Часть вирусов (45) была подвергнута полногеномному секвенированию с целью изучения эволюции вирусов и характеристики их биологических свойств, выборка составлена на основе географического распространения и различий в подтипах вируса по нейраминидазе. Для расширения исследуемой выборки были импортированы доступные в открытых базах данных полногеномные последовательности ВГП подтипа H5, выявленные на территории России с 2018 по 2022 г. (134 изолята). Необходимо сделать акцент на том, что в отношении ВГП , который в течение одного сезона миграции дикой птицы способен распространяться на огромные территории, использование терминов «популяция», «циркуляция вируса» не является корректным. В данном случае под термином «популяция вируса гриппа птиц» будет пониматься набор из 179 вирусов, выявленных на территории России в 2018–2022 гг., для которых были получены полногеномные последовательности. Термин «популяция ВГП» не подразумевает заявления о наличии на территории России очагов стойкого неблагополучия и длительной циркуляции ВПГП.

На основании анализа предсказанной аминокислотной последовательности был определён сайт расщепления вирусного гемагглютинина сравниваемых изолятов. Для всех вирусов он имел сходную структуру, содержащую 6 основных аминокислот с вариацией по позиции 342 — RE(K/R)RRKR. Исключение составил вирус A/dalmatian pelican/Astrakhan/417-1/2021 (H5N5), сайт нарезания которого содержал 7 основных аминокислот RKKRRKR. В рецептор-связывающей части вирусного белка у всех вирусов обнаружен аминокислотный мотив G₂₂₅QRG₂₂₈ (по нумерации подтипа H3).

Вирусы ВПГП подтипа Н5 способны инфицировать млекопитающих, в том числе человека, несмотря на то что их гемагглютинин преимущественно взаимодействует с клеточными рецепторами SAα-2,3-Gal. Однако в случае успешной репродукции ВГП в клетках млекопитающих исследователями были выявлены мутации в других вирусных генах, которые рассматриваются как маркеры адаптации ВГП для размножения в организме млекопитающих. По фенотипическому проявлению маркерные замены можно разделить на две основные группы: мутации, связанные с повышением активности вирусного полимеразного комплекса в культуре клеток (КК) млекопитающих; мутации, усиливающие вирулентные свойства вируса при экспериментальном заражении лабораторных мышей и вызывающие изменение метаболизма на уровне организма, связанное с модификацией иммунного ответа в организме хозяина. В анализ были включены аминокислотные замены, для которых экспериментально было показано изменение биологических свойств вируса и установлена связь между мутацией и её фенотипическим проявлением. В табл. 2 указаны позиции замен аминокислот белков ВГП, способствующие репродукции ВГП в организме млекопитающих.

Таблица 2. Маркерные аминокислотные замены, связанные с адаптацией к размножению ВГП в КК млекопитающих

Белок	Номер позиции аминокислоты и изоляты ВГП, содержащие мутации	Фенотипическое проявление мутации
PB1	622G — все исследованные вирусы	Повышение активности полимеразы [39]
PB1	678S — все исследованные вирусы, за исключением: 678N — A/turkey/Rostov-on-Don/332-ХХ/2021, 678G — A/dabchick/Tyva/767-58/2021	678N — повышение активности полимеразы [19]
PB2	89V, 309D, 339K, 477G — все исследованные вирусы, 495V/I/A, 676T/I/M/A	Совокупность мутаций: 89V, 309D, 339K, 477G, 495V, 676T — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих [15]
	292I/T, 588A — все исследованные вирусы, за исключением: 292V — H5N8 2018–2020 (кроме кур из Новосибирска в 2020 г.), A/chicken/Kostroma/1761-1 (H5N8), A/chicken/Tomsk/1797-7/20 (H5N8), A/duck/KChR/1590-14/20 (H5N8), A/crow/Khabarovsk/2712-1/2022 (H5N1), A/dabchick/Tyva/767-58/2021 (H5), 588V, A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6)	292V, 588V — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих, повышенная вирулентность для мышей [40]
	389R, 598T — все исследованные вирусы	389R, 598T — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих при низких температурах [41]
	482K — все исследованные вирусы, за исключением: 482R, A/chicken/Kostroma/304-XX/2020 (H5N8), A/chicken/Kostroma/ 1761-1 (H5N8), A/crow/Khabarovsk/776-56/22 (H5N1), A/duck/Magadan/2272-8/2022 (H5N1), A/goose/Magadan/2272-5/22 (H5N1), A/poultry/Magadan/1560-1/2022 (H5N1)	482R — повышение активности полимеразы в КК млекопитающих [42]
PA	37A, 100V — все исследованные вирусы, за исключением: 37S, A/turkey/Stavropol/165-5/2022	37A, 100V — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих, повышенная вирулентность для мышей [18]
	97T — все исследованные вирусы, за исключением: 97I, A/Chicken/Ryazan/1093-1/2022 (H5N1), A/Poultry/Samara/1659-1/2022 (H5N1), A/Poultry/Samara/1643-1/2022 (H5N1), A/Chicken/Kursk/1281-1/2022 (H5N1), A/Goose/Saratov/1965-1/2022 (H5N1), A/Goose/Belgorod/1498-1/2022 (H5N1), A/Duck/Ivanovo/1462-3/2022 (H5N1), A/Duck/Belgorod/1482-10/2022 (H5N1), A/Chicken/Orel/1484-5/2022 (H5N1), A/Chicken/Kaluga/1424-2/2022 (H5N1), A/Chicken/Rostov/1724-2/2022 (H5N1)	97I — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих, увеличение вирулентности для мышей [43]
	127V, 44V, 241C, 343A, 573I — все исследованные вирусы, за исключением: 127A — все вирусы H5N8/2018 343A, 347D — все исследованные вирусы, за исключением: 343T — A/Crow/Khabarovsk/2712-1/2022 (H5N1), 343S — вирусы H5N5 и H5N8, циркулировавшие в 2020–2021 гг.	127A, 44I, 241Y, 343T, 573V — повышенная репликация в КК млекопитающих, увеличение вирулентности для мышей [16] 343S, 347E — повышенная репликация в КК млекопитающих, увеличение вирулентности для мышей [44]
	142K, 147I, 171I, 182M — все исследованные вирусы, 142R, A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6), 182L, A/waterfowl/Russia/1526-4/2021 (H5N5), A/shelduck/Kalmykia/1814-1/2021 (H5N5)	142R, 147V, 171V, 182L — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих [45]
	224S/A — все исследованные вирусы, 383D — все исследованные вирусы	224P, 383D — повышение активности полимеразы и репликации в КК млекопитающих [17]
NP	41I — все исследованные вирусы, за исключением: 41V — A/common teal/Chelyabinsk/1379-1/2021 (H5N1)	41V — повышение активности полимеразы в КК млекопитающих при низкой температуре [46]
NS1	3P/S, 41K, 74D — все исследованные вирусы, за исключением: 41R — A/chicken/Tomsk/1797-7/20 (H5N8)	3S, 41K, 74N — усиленная репликация в КК млекопитающих и патогенность для мышей [47]
NS1	55E, 66E, 138F — все исследованные вирусы, за исключением: 66K — вирусы H5N8 2020–2021 138L A/goose/Omsk/3003/2020 (H5N8) A/goose/Omsk/3008/2020 (H5N8)	55E, 66E, 138F — усиленная репликация в КК млекопитающих, снижение реакции на интерферон [48]

Анализ предсказанной аминокислотной последовательности белков полимеразного комплекса выявил единичные маркерные замены, способные усиливать работу репликативного комплекса вируса в клетках млекопитающих, которые закрепились в популяции ВГП. Так, в белке РВ1 закрепилась лишь 1 замена в положении 622G. Две другие мутации (678N и 105S) имели единичное распространение.

В белке РВ2 естественным отбором произошло закрепление мутаций 389R и 598T. Данные мутации среди ВГП регистрировались и ранее, но в настоящее время стали доминирующими. Отмечено широкое распространение в 2018–2020 гг. мутации 292V, появление в популяции единичных мутаций 482R. Анализ набора «адаптационных мутаций» 89V, 309D, 339K, 477G, 495V, 676T свидетельствует о закреплении естественным отбором этого набора аминокислотных замен. Экспериментальные исследования показали, что совокупность данных замен способна компенсировать отсутствие лизина в позиции 627 белка РВ2 для успешного размножения ВГП в клетках млекопитающих [15].

Анализ предсказанной аминокислотной последовательности гена РА показал, что в популяции произошло закрепление мутации 383D. Выявлено широкое распространение мутаций 37А, 61I, 63V, 100V, 343S, 383D и единичные случаи мутаций 224P, 343T, 142R. Несмотря на то что в нуклеотидных последовательностях гена РА обнаружено наибольшее число «адаптационных мутаций», это не представляется критичным, поскольку они случайным образом распределены среди вирусов. Кроме того, ряд выполненных исследований показал необходимость синергического эффекта для фенотипического проявления у млекопитающих «адаптационных мутаций» в гене РА [16–18].

Анализ маркерных аминокислотных замен, связанных с вирулентными свойствами ВГП, показал, что в популяции ВГП закрепилась мутация 42S в белке NS1 (табл. 3). Данная замена является маркером вирулентных свойств для мышей и способна противодействовать индукции интерферона в клетке-хозяине, а также предотвратить активацию пути NF-κB при иммунном ответе [19]. Кроме этого, у всех изолятов были выявлены аминокислотные замены 30D и 215A в белке M1, признанные детерминантами патогенности для мышей [20].

Таблица 3. Маркерные аминокислотные замены, связанные с повышенной вирулентностью ВГП

Белок	Номер позиции аминокислоты и изоляты ВГП, содержащие мутации	Фенотипическое проявление мутации
PB1	105S — A/chicken/Penza/300/2018	Увеличение вирулентности у мышей [43]
PB1-F2	66N — все исследованные вирусы, за исключением: 66S — изоляты ВГП 2019–2022 подтипов H5N5, H5N1	66S — вирулентность и усиление иммунного ответа для мышей [34, 54]
NP	319N — все исследованные вирусы, за исключением: 319K A/Crow/Khabarovsk/776-56/22 (H5N1) A/Duck/Magadan/2272-8/2022 (H5N1) A/Goose/Magadan/2272-5/22 (H5N1) A/Poultry/Magadan/1560-1/2022 (H5N1) A/Chicken/Ryazan/1093-1/2022 (H5N1)	319K — нарушение внутриядерного транспорта в клетках млекопитающих [23]
M1	30D, 215A — все исследованные вирусы 43M — все исследованные вирусы	30D, 215A — увеличение вирулентности у мышей Увеличение вирулентности у мышей [49]
NS1	42S — все исследованные вирусы	Повышенная вирулентность и снижение противовирусного ответа для мышей [50]
	92D — все исследованные вирусы, за исключением: 92E, A/common gull/Saratov/1676/2018 (H5N6)	92D — повышенная вирулентность для свиней и мышей [51]
	103F/Y, 106M — все исследованные вирусы	103F, 106M — повышенная вирулентность для мышей [52, 53]

При изучении факторов патогенности отмечено закрепление в популяции ВГП гена NS1, кодирующего соответствующий белок с дополнительной вставкой из 5 аминокислот в позиции 80–84. Экспериментальные исследования показали, что гибридные вирусы, имеющие данную вставку, могут вызывать в организме гипериммунный ответ — так называемый «цитокиновый шторм» [21]. Проведённый анализ показал, что среди вирусов гриппа данная мутация стала закрепляться после 2017 г.

Обсуждение

В результате проведённой работы установлено закрепление эволюционным отбором ряда аминокислотных замен, способствующих успешному размножению ВГП в организме млекопитающих. При этом остаются вопросы о механизме функционирования вирусного рецептора, который позволяет вирусу осуществлять межвидовой переход. Согласно ранее проведённым исследованиям, аминокислотный мотив G₂₂₅QRG₂₂₈ характерен для вирусов гриппа, выделенных от птиц, и обладает высокой аффинностью к рецепторам группы SAα-2,3-Gal [14, 22]. Однако интерпретация аффинных свойств вирусного гемагглютинина к рецепторам группы SAα-2,3-Gal или к рецепторам группы SAα-2,6-Gal по первичной аминокислотной последовательности затруднительна. Установлено, что изменение тропных свойств вирусов гриппа возможно в результате возникновения как единичных мутаций, так и целого набора мутаций в аминокислотной последовательности. В наших неопубликованных исследованиях и данных литературы по сравнительному анализу предсказанной аминокислотной последовательности гена HA вирусов, выделенных от птиц и млекопитающих, не выявлено аминокислотных замен, которые были бы характерны только для ВГП или только для вирусов, выделенных от млекопитающих. По всей видимости, гемагглютинин вируса гриппа генетической клады 2.3.4.4 в результате единичных мутаций способен менять свои аффинные свойства в отношении остатков сиаловых кислот и, сохраняя функциональность, может преодолевать межвидовой барьер, сочетаясь с различными типами вирусной нейраминидазы.

У ВГП, выделенных в промышленном хозяйстве в Ростовской области, — A/turkey/Rostov-on-Don/332-ХХ/2021 в белке PB1 обнаружена мутация 678N; на территории Республики Тыва выявлен вирус A/dabchick/Tyva/767-58/2021 с мутацией 678G. Согласно экспериментальным данным, сочетание аминокислот 13P и 678N вызывает резкое увеличение полимеразной активности ВГП при размножении в клетках млекопитающих [19]. У изолята A/chicken/Penza/300/2018 выявлена мутация 105S, усиливающая проявление вирулентных свойств в отношении мышей. Для проверки происхождения данных мутаций был выполнен филогенетический анализ, который показал, что вирусы A/turkey/Rostov-on-Don/332-08/2021, A/dabchick/Tyva/767-58/2021 и A/chicken/Penza/300/2018 находятся в группах, включающих вирусы, распространившиеся на территории России в период с 2018 по 2022 г. и не имевшие подобных мутаций (рисунок). Филогенетический анализ подтверждает, что появление мутаций 105S, 678N, 678G в белке РВ1 среди ВГП, выявленных на территории России, является результатом антигенного дрейфа, а не антигенного шифта.

Филогенетическое дерево, построенное методом NJ на основе нуклеотидной последовательности фрагмента гена PB1 (1–2275 п.н. ОРС) ВГП подтипа H5.

Треугольниками отмечены ВГП с адаптационными мутациями.

Анализ возникновения замен в репликативных белках ВГП (на примере мутаций 678N и 105S белка РВ1) показал, что возникновение единичных мутаций в результате антигенного дрейфа происходит крайне редко даже в условиях частых эпизоотий. Единичное и незначительное распространение в популяции ВГП мутаций, способствующих развитию болезни у млекопитающих в случае межвидового перехода, демонстрирует целесообразность и эффективность стратегии стемпинг-аут в борьбе с гриппом птиц как болезни с зооантропонозным потенциалом. Применение стратегии стемпинг-аут, подразумевающей тотальное уничтожение всех инфицированных животных, рекомендовано Всемирной организацией здоровья животных для ряда эмерджентных болезней, обладающих панзоотическим потенциалом и способных сохраняться в популяциях диких животных. При надлежащем надзоре за поголовьем сельскохозяйственной птицы с использованием методов молекулярной биологии можно своевременно выявлять ВГП и проводить ликвидацию очага, не допуская возможности межвидового перехода к млекопитающим. Эффективность стратегии стемпинг-аут подтверждает исчезновение из вирусной популяции таких мутаций, как 127А в белке РА и 292V в белке PB2. Эти мутации были выявлены у вирусов в период эпизоотии ВГП подтипа H5N8 2018 г. Мутация 292V в белке РВ2 в единичных случаях была зарегистрирована и после 2018 г., однако своевременное уничтожение инфицированного поголовья не позволило ВГП проникнуть в популяцию млекопитающих. Из популяции ВГП эти мутации были отсеяны естественным отбором, поскольку имели негативный эффект для размножения вируса в организме птиц. По всей видимости, в популяциях ВГП существует динамическое равновесие, поддерживаемое естественным отбором, благодаря чему адаптационные мутации к млекопитающим исчезают из популяции. Это можно наблюдать на примере разброса подобных мутаций по различным генам среди ВГП — они встречаются у различных вирусов с разной частотой, но не было обнаружено вирусов, которые бы содержали в своем геноме полный спектр адаптационных мутаций к млекопитающим. Кроме этого, у изученных нами вирусов выявлены новые замены в позициях, изменения в которых влияют на репликацию в клетках млекопитающих (табл. 3).

Влияние новых мутаций на репликацию и вирулентные свойства ВГП в отношении млекопитающих экспериментально не изучено. Несмотря на отсутствие экспериментальных данных, указывающих на усиление репликации вируса от новых замен, это внушает опасение, поскольку ранние работы по эволюции ВГП показали, что, преодолевая видовой барьер, он проходит фазу, позволяющую постепенно приобретать адаптивные мутации, не теряя приспособленности к старому хозяину [23, 24]. Ранее проведённые исследования по изучению трансмиссивности ВГП, выполненные другими исследователями, указывают на сложный и зачастую комплексный характер изменений в геноме ВГП при межвидовом переходе и закреплении вируса в популяции нового вида [25–28]. Исследования, выполненные в НИЦ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, также показали возможность адаптации и приобретения ВГП патогенных свойств для лабораторных мышей в течение 7–10 циклов экспериментального заражения [29].

В нашем анализе, кроме единичных замен, отмечено, что в популяции ВГП после 2020 г. на территории России закрепились вирусы, способные транслировать полноразмерный белок PB1-F2. Трансляция стала возможна благодаря нуклеотидной мутации A129C (нумерация от начала открытой рамки считывания гена PB1), ликвидировавшей стоп-кодон. Ген PB1-F2 находится внутри рамки считывания гена PB1 и кодирует белок, влияющий на тяжесть воспалительного процесса. В настоящее время однозначного описания влияния данного белка на вирулентные свойства вируса нет. Достоверно известно, что фенотипическое проявление одной и той же формы гена PB1-F2 различается у птиц и млекопитающих. Уже было показано, что экспрессия PB1-F2 снижает вирулентность для птиц [30–32]. По результатам экспериментального заражения установлено, что в то время как при заражении птиц не было замечено усиления вирулентности, заражение мышей выявило явное участие белка PB1-F2 вируса H7N1 в воспалительной реакции организма хозяина, как ранее было показано для штаммов ВГП подтипов H1N1 и H5N1 [32]. Результаты экспериментального заражения у хорьков при заражении ВГП с экспрессией PB1-F2 отличались от течения инфекционного процесса при использовании вируса без экспрессии PB1-F2. Заражение вирусом, экспрессирующим PB1-F2, коррелировало со значительным нарушением регуляции числа лейкоцитов на 3-й и 7-й дни после заражения; экспрессия PB1-F2 была связана как с лимфопенией, так и с повышенным количеством нейтрофилов. Лимфопения у всех хорьков была проходящей, и уровни лейкоцитов возвращались к исходному значению на 19-й день после заражения [33]. Все вирусы с активной формой гена PB1-F2 имеют аминокислотную мутацию 66S. В ряде исследований показано, что вирусы с данной мутацией вызывали более тяжёлый инфекционный процесс среди инфицированных лабораторных мышей [34]. Данная мутация была у ВГП, выделенных от норок в Испании в 2022 г. [5]. Кроме этого, данная мутация была одной из тех, что отличали смертоносный вирус A/Brevig Mission/18, так называемый «испанский грипп», полыхавший в начале ХХ столетия по всему миру [34]. Помимо непосредственного воздействия белка PB1-F2 на протекание инфекционного процесса, получены данные, которые указывают на возможность более тяжёлого инфекционного процесса при взаимной экспрессии полноразмерных белков PB1-F2 и РА-Х [35]. Проведённый анализ показал, что все исследованные в данной работе ВГП способны экспрессировать полноразмерный белок РА-Х.

Отдельно стоит обратить внимание на вариабельность С-концевой последовательности белка NS1. Ранее проведённые работы показали, что единичные замены в 4 последних аминокислотах влияют на возможность эффективного межвидового перехода от свиней к мышам, сопровождающегося проявлением патогенных свойств в отношении нового хозяина [36]. Так, ВГП подтипа H1N1, имевшие в своем составе белок NS1, где последние 4 аминокислоты были PEQK и RSEV, не могли инфицировать мышей, тогда как тот же вирус, чей белок NS1 заканчивался аминокислотным мотивом GSEI и EPEV, успешно индуцировал инфекционный процесс у мышей, достигая титра 2300 БОЕ/г [37]. Среди ВГП, выявленных на территории России за 2018–2022 гг., концевой мотив белка NS1 имел вариации GSEV, LPPK, FPPK, ESEV, ESEI. Подобное разнообразие концевого мотива белка NS1 может обеспечивать широкое распространение ВГП среди различных видов птиц [38].

Полученные в результате анализа наличия маркерных замен у ВГП/H5 данные указывают на активный эволюционный процесс, происходящий в настоящее время в популяции ВГП. Наличие в популяции ВГП факторов патогенности для млекопитающих может способствовать успешному межвидовому переходу вируса за счёт подавления отдельных элементов иммунной защиты. После межвидового перехода вирус может оказаться в русле «накопительной» изменчивости, когда в процессе естественного отбора закрепляются единичные мутации, усиливающие фенотипическое проявление или функциональные свойства отдельных белков и предоставляющие конкурентные преимущества относительно других вирусов.

Подобный сценарий межвидового перехода подчёркивает необходимость использования стратегии стемпинг-аут и запрета на вакцинацию против ВПГП в промышленном птицеводстве в качестве сдерживающего фактора для ВГП как возбудителя зооантропонозного заболевания. Своевременное и полное уничтожение инфицированного поголовья птицы позволяет избежать межвидового перехода ВГП к млекопитающим через бродячих собак, кошек или мелких грызунов. В случае бесконтрольной вакцинации против ВПГП может происходить скрытая циркуляция ВГП среди восприимчивого поголовья без проявления клинических признаков, результатом которой будет увеличение генетического разнообразия популяции ВГП и активное появление новых мутаций, в числе которых могут оказаться и «полезные» для вируса, способствующие межвидовому переходу.

Заключение

В результате проведённых исследований установлено, что среди ВГП подтипа H5, выявленных на территории России в 2018–2022 гг., преобладали вирусы с ферментативным комплексом, адаптированным к репликации в клетках птиц. Адаптационные мутации к репликации в клетках млекопитающих единичны и хаотично распределены в популяции вируса. Вирусный гемагглютинин обладает аффинностью преимущественно к клеточным рецепторам птиц. Показано появление и распространение в популяции ВГП факторов вирулентности для млекопитающих. Наличие таких факторов может способствовать успешному межвидовому переходу вируса с последующей адаптацией вирусного гемагглютинина к клеточным рецепторам млекопитающих в результате антигенного дрейфа и закрепления новых мутаций в ходе естественного отбора.

Полученные результаты указывают на эффективность стратегии стемпинг-аут и запрета на вакцинацию против ВПГП в промышленном птицеводстве в качестве сдерживающего фактора для ВГП как возбудителя зооантропонозного заболевания. Своевременное и полное уничтожение поголовья птицы, инфицированной ВПГП, способным в процессе размножения продуцировать факторы патогенности для млекопитающих и обладающим отдельными адаптационными мутациями в репликативных белках, позволяет избежать или значительно снизить вероятность межвидового перехода ВГП от птиц к млекопитающим через бродячих животных или мелких грызунов.

¹ World Organisation for Animal Health. Event 5191. https://wahis.woah.org/#/in-event/5191/dashboard

² URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/

³ URL: https://www.gisaid.org/