Polymorphism of spore germination receptor genes in Bacillus anthracis strains of major genetic lineages

Full Text

Введение

Глобальная генетическая структура Bacillus anthracis представлена 3 основными генетическими линиями: A, B и С. Линия A, присутствующая повсеместно, охватывает около 90% всей популяции; линия B, встречающаяся преимущественно в некоторых регионах, составляет примерно 10%. К линии C относятся 3 штамма (< 1%), выделенные в США [1–3]. Из 363 геномов штаммов, депонированных в GenBank к настоящему времени, 5 (2002013094, 2000031021, 2000031052, A1055, A3783) могут быть отнесены к линии C. Отдельной генетической линией являются штаммы B. cereus biovar anthracis, способные вызывать сибирскую язву у диких животных в лесах Западной Африки [4, 5]. Причины такого неравномерного количественного, а также географического распределения разных линий B. anthracis неизвестны. Предполагается, что за этим стоит разная способность к адаптации, определяемая как степенью патогенности, так и эффективностью споруляции и прорастания спор. В нашей предыдущей работе показаны многократное превышение числа полиморфизмов в геномах, включая гены факторов патогенности, у штаммов линий B и C по сравнению с линией A, определены значимые замены в хромосомных и плазмидных генах, потенциально влияющие на вирулентность [6].

B. anthracis является возбудителем сибирской язвы — особо опасной зоонозной инфекции с глобальным распространением, а также агентом биологического оружия и биотерроризма в силу высокой патогенности и способности образовывать в окружающей среде стойкие споры. Циклическая смена спорообразования, прорастания покоящихся спор, вегетативного роста и нового спорообразования присуща всем представителям рода Bacillus. У сапрофитных почвенных бацилл все эти процессы проходят в почве, но патогенному сибиреязвенному микробу для поддержания жизненного цикла необходимо прорастание спор при попадании в организм чувствительного хозяина, вегетативное размножение в процессе патогенеза с выделением вегетативных бацилл в окружающую среду, где происходят споруляция и сохранение покоящихся спор в почве неопределённо долго, вплоть до нового инфицирования чувствительных животных [3]. Очевидно, что споруляция и прорастание спор — фундаментальные процессы, необходимые для поддержания существования B. anthracis как вида, наряду с его патогенными свойствами.

Образование спор делает возможным выживание B. anthracis в окружающей среде годами, до того момента, когда они вступают в контакт с подходящим млекопитающим хозяином, прорастают и вызывают сибиреязвенную инфекцию. Хотя состояние покоя может продолжаться в течение длительного периода, прорастание спор — очень быстрый процесс, позволяющий B. anthracis быстро размножаться и распространяться. Начало прорастания, или герминация спор, зависит от соответствующего взаимодействия герминанта с герминантным рецептором [7].

Для B. anthracis питательными веществами — герминантами являются в первую очередь аминокислоты и пуриновые нуклеозиды, которые взаимодействуют с их специфичными рецепторами, расположенными на внутренней мембране спор [8–10]. Аланин или инозин обычно служат первичными герминантами с отдельными аминокислотами (L-гистидин, L-пролин, L-триптофан и L-тирозин), функционирующими как когерминанты. Аланин способен вызывать прорастание спор сам по себе, хотя и в очень высоких концентрациях [8, 11]. Инозин может сочетаться с разнообразием L-аминокислот, включая L-гистидин, L-цистин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-валин, L-триптофан, L-тирозин, как и с первичным герминантом аланином. Инозин, однако, сам по себе недостаточен для прорастания спор B. anthracis [9].

Прежде чем может начаться прорастание, герминанты должны каким-то образом пройти через внешние слои споры, чтобы достичь своих рецепторов, расположенных во внутренней мембране.

После распознавания рецепторами их специфичных герминантов инициируется каскад событий. Запасы дипиколиной кислоты и ассоциированного с ними иона кальция освобождаются из ядра споры, позволяя воде поступать в спору и начинать регидратацию [12]. Активация литических ферментов, гидролизующих пептидогликан в кортексе споры, приводит к дальнейшей регидратации споры [13]. Затем возобновляется синтез РНК, белка и ДНК с превращением в вегетативную бациллу. В оптимальных условиях весь процесс очень быстрый, происходящий в течение минут.

Пять рецепторов герминантов B. anthracis кодируются трицистронными оперонами, gerH, gerK, gerL и gerS локализуются на хромосоме, а gerX — на плазмиде вирулентности pXO1 [14, 15] Существуют два дополнительных рецептороподобных оперона — gerA и gerY, но они содержат мутации со сдвигом рамки считывания и не играют роль в прорастании [10]. Оперон gerP, включающий 6 генов, может быть вовлечён в процесс доставки герминантов к их рецепторам во внутренней мембране споры [16].

Данных относительно существования различий в генах и ферментах герминации спор у штаммов разных основных генетических линий B. anthracis в доступной литературе нет.

Актуальность проведённой работы определяется отсутствием данных, которые значимы для развития представлений о различиях в генетическом аппарате герминации спор у штаммов разных основных генетических линий, связанных с их адаптационными возможностями, потенциально определяющими неравномерность их распределения.

Цель данной работы — характеристика генов и белков герминации спор у штаммов B. anthracis разных генетических линий.

Материалы и методы

Исследовали полные геномы 46 штаммов из базы данных GenBank NCBI, относящихся к основным генетическим линиям A (30 изолятов), B (11), C (5), геном штамма CI B. cereus biovar anthracis. Данная выборка репрезентативна, в ней представлены все известные 14 canSNP-групп, отражающих глобальную филогенетическую структуру B. anthracis.

Идентификаторы NCBI RefSeq для геномов¹:

GCF_000008445.1, GCF_009831565.1, GCF_000167335.1, GCF_003063965.1, GCF_003064045.1, GCF_003860145.1, GCF_000793525.1, GCF_000832965.1, GCF_000310045.1, GCF_000167235.1, GCF_000534935.2, GCF_000258885.1, GCF_000278385.1, GCF_000832465.1, GCF_001273005.1, GCF_001273085.1, GCF_000167295.1, GCF_002896575.1, GCF_014249775.1, GCF_003227955.1, GCF_000831505.1, GCF_000832745.1, GCF_003064005.1, GCF_000008165.1, GCF_000583105.1, GCF_000833275.1, GCF_022221345.1, GCF_000743805.1, GCF_900014355.1, GCF_002356575.1, GCF_000143605.1, GCF_000181675.2, GCF_001277955.1, GCF_000167315.1, GCF_000832785.1, GCF_002980615.3,GCF_000833125.1, GCF_022221285.1, GCF_006088855.1, GCF_000725325.1,GCF_001936375.1, GCF_022221085.1, GCF_021390035.1, GCF_000742655.1 GCF_000782995.1, GCF_000167255.1, GCF_022221185.1.

Последовательности генов и белков выравнивали в программе «MEGA X» с референс-штаммом Ames Ancestor canSNP-группы A.Br.Ames.

Анализ геномов проводили in silico, используя геном штамма B. anthracis Ames Ancestor (GenBank: NC_007530.2; NC_007322.2; NC_007323.3; NCBI RefSeq: GCF_000008445.1) в качестве референсного. Идентификацию полиморфизмов осуществляли в программах BLASTn, BLASTp, MEGA X, MAUVE, Tandem Repeat Finder и на ресурсе NCBI Protein Database.

Результаты

Большинство генов рецепторов герминации спор организованы в полицистронные опероны.

Данные о полиморфизмах генов рецепторов герминации приведены в таблице.

 

Структурные и функциональные особенности белков и генов герминации спор у штаммов B. anthracis разных генетических линий

Structural and functional features of proteins and genes for spore germination in B. anthracis strains of different genetic lineages

Ген Gene	Основные генетические линии | Major Lineages																Всего Total
	A				B				C				B. cereus biovar anthracis
	SNP	INDEL	псевдогены pseudogenes	варианты белков protein variants	SNP	INDEL	псевдогены pseudogenes	варианты белков protein variants	SNP	INDEL	псевдогены pseudogenes	варианты белков protein variants	SNP	INDEL	псевдогены pseudogenes	варианты белков protein variants
gerHA	0	2	0	3	24	9	0	4	0	2	0	1	47	1	0	1	94
gerHB	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	73	2	0	1	79
gerHC	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	65	2	0	1	71
gerKA	1	0	0	1	1	0	1	2	0	0	0	1	0	0	1	1	9
gerKB	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	8	0	0	1	12
gerKC	0	2	2	1	0	0	0	1	0	0	0	1	13	0	0	1	21
gerLA	1	2	0	3	0	0	0	1	0	0	0	1	4	0	0	1	13
gerLB	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	35	0	0	1	39
gerLC	0	0	0	1	0	1	1	1	0	0	0	1	11	0	0	1	17
gerM	0	0	0	1	12	0	0	1	12	0	0	1	12	0	0	1	41
gerPA	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	4
gerPB	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	4
gerPC	1	0	0	2	0	0	0	1	0	0	0	1	2	0	0	1	4
gerPD	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	4
gerPE	1	0	0	2	1	0	0	1	1	0	0	1	7	0	0	1	4
gerPF	0	0	0	2	0	0	0	2	0	0	0	2	0	0	0	2	8
gerSA	0	0	0	1	2	0	0	2	1	0	0	2	67	0	0	1	76
gerSB	0	0	0	1	1	0	0	2	0	0	0	1	10	0	0	1	16
gerSC	0	0	0	1	1	0	0	2	1	0	0	1	10	0	0	1	17
gerXA	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	0	0	0	1	4
gerXB	0	0	0	1	1	0	0	2	1	0	0	1	1	0	0	1	8
gerXC	1	0	0	2	3	0	0	2	1	2	1	1	1	2	1	1	18
gerYA	0	0	0	1	2	0	0	1	2	0	0	1	53	0	0	1	71
gerYB	0	1	1	1	0	1	1	1	1	0	0	1	34	0	0	1	42
gerYC	0	1	0	2	0	0	0	1	0	0	0	1	30	0	0	2	37
Всего | Total	5	8	3	34	48	11	3	35	20	4	1	28	483	7	2	27	728
На 1 геном Per 1 genome	0,17	0,27	0,1		4,36	1	0,27		4	0,8	0,2		483	7	2

Примечание. Жирным курсивом выделены гены, дифференцирующие линию A от линий B и С.

Note. Genes that differentiate line A from lines B and C are highlighted in bold italics.

 

Основная генетическая линия A

Мутации в виде индел встречались чаще других полиморфизмов, с меньшей частотой отмечены однонуклеотидные замены (SNP), часть из которых приводила к замене аминокислот (а.к.), реже всего регистрировались псевдогены.

Трицистронный оперон gerH. Ген gerHA — 3 варианта, 2 с отличающимися размерами от референсного ввиду делеций. Вариант 1 — референсный, 2244 п.н., 747 а.к.; вариант 2 — 2166 п.н., 721 а.к.; вариант 3 — 2088 п.н., 695 а.к.

Трицистронный оперон gerK. Белок GerKA — 1 вариант. Белок GerKB — 1 вариант, как у референсного штамма, у гена gerKB стартовый кодон GTG. Белок GerKC — 1 вариант.

Трицистронный оперон gerL. Ген gerLA — 3 варианта, отличающиеся размерами (1479, 1437 и 1470 п.н.). Один из вариантов имеет 2 стартовых кодона: GTG и ATG. Два других гена оперона gerL — gerLB и gerLC имеют по 1 варианту, у gerLB стартовый кодон TTG.

Ген gerM имеет 1 вариант.

Оперон gerP включает 6 генов: A, B, C, D, E, F. Гены gerPA, gerPB и gerPD представлены только в 1 варианте. Ген gerPB имеет стартовый кодон TTG. Ген gerPC — 2 варианта, отличающиеся одним несинонимичным SNP. Ген gerPE — 2 варианта, также отличающиеся 1 несинонимичным SNP. Кроме гена gerPF в опероне gerP, есть ортолог вне оперона.

Трицистронный оперон gerS — вcе 3 гена (gerSA, gerSB, gerSC) имеют только по 1 варианту, идентичному референс-штамму. У гена gerSB стартовый кодон GTG.

Трицистронный оперон gerX — из генов оперона 2 (gerXA и gerXB) имеют по 1 варианту, идентичному референс-штамму. Ген gerXС представлен в 2 вариантах, различающихся 1 несинонимичным SNP.

Трицистронный оперон gerY — из 3 генов оперона 1 ген — gerYA имеет такой же вариант, как у референс-штамма. Ген gerYB имеет мутации со сдвигом рамки считывания, превращающие его в псевдоген. Ген gerYC имеет 2 варианта разных размеров. Гены обоих вариантов имеют редко встречающиеся стартовые кодоны ATT.

Частота встречаемости SNP составила 0,17, для инделов — 0,27, для псевдогенов — 0,1 на 1 геном. Таким образом, инделы встречались чаще, чем SNP.

В целом для 25 генов было 34 варианта белков.

Основная генетическая линия B

Из 25 генов 12 представлены только 1 вариантом, соответствующим референсному штамму.

Трицистронный оперон gerH. Из 3 генов (gerHA, gerHB, gerHC) только gerHA был вариабельным и представлен 4 вариантами разных размеров: вариант 1 размером 2385 п.н., вариант 2 — 2322 п.н., вариант 3 — 2190 п.н., вариант 4 — 2166 п.н.

Трицистронный оперон gerK. Гены gerKB и gerKC не вариабельны, идентичны референсному штамму. Ген gerKB имеет стартовый кодон GTG. Ген gerKA — два варианта одного размера. Вариант 2 содержит 1 несинонимичный SNP.

Трицистронный оперон gerL — 2 гена оперона, A и B не вариабельны и соответствуют референсному штамму. Ген gerLA начинается с триплета GTG, ген gerLB — c триплета TTG. Ген gerLC — 2 варианта, второй выглядит как псевдоген.

Ген gerM — один вариант, отличающийся от референсного 12 SNP, один из которых несинонимичный.

Оперон gerP — из 6 генов вариабельны 2: gerPE и gerPF. Ген gerPB имеет стартовый кодон TTG. Второй вариант gerPE отличается от референсного 1 несинонимичным SNP. Ген gerPF — как и у штаммов линии A, кроме гена оперона gerP, есть второй ген с таким обозначением вне оперона. Оба не отличаются от референсного штамма.

Трицистронный оперон gerS. Гены gerSA и gerSB — по 2 варианта одного размера, у gerSA один отличается от референсного 1 несинонимичным SNP, второй — 2 несинонимичным SNP. У гена gerSB — один соответствует референсному, второй отличается несинонимичным SNP, оба имеют стартовый кодон GTG.

Трицистронный оперон gerX. Гены gerXB и gerXC имеют по 2 варианта. Вариант 1 gerXB соответствует референсному. Вариант 2 имеет 1 несинонимичный SNP. gerXC имеет 2 варианта. Вариант 1 имеет 1 несинонимичный SNP. Вариант 2 имеет 2 несинонимичных SNP. gerXA имеет 1 вариант, соответствующий референсному.

Трицистронный оперон gerY. Ген gerYA — 1 вариант с 2 несинонимичными SNP. Ген gerYB — 1 вариант с делецией, дающей сдвиг рамки считывания в гене (псевдоген). Ген ger YC — 1 вариант, соответствующий референсному, со стартовым кодоном ATT.

В целом для линии B идентифицированы 35 вариантов 25 белков. Частота встречаемости была 4,36 для SNP, 1 — для инделов, 0,27 — для псевдогенов. Чаще всего встречались SNP, частоты всех полиморфизмов были существенно выше, чем у линии A.

Основная генетическая линия C

Трицистронный оперон gerH. Ген gerHA — 3 варианта. У штаммов A1055 и A3783 ген имел размер 2244 п.н., соответствующий референсному, у штамма 2002013094 — 2166 п.н., как у варианта 4 линии B, с 1 делецией 78 п.н., отличающей его от референсной последовательности. У штаммов 2000031021 и 2000031052 размер гена был 2088 п.н, с делецией 156 п.н. Остальные 2 гена оперона gerH не были вариабельными.

Трицистронный оперон gerK. Все 3 гена оперона gerK не отличались от референсного, у гена gerKB был стартовый кодон GTG. Гены оперона gerL не вариабельны, как у штаммов линии B, у gerLB стартовый кодон TTG.

Ген gerM — у единственного варианта было 11 синонимичных и 1 несинонимичный SNP в сравнении с референсным, как и у гена линии B.

Оперон gerP — из 6 генов вариабельны 2. Ген gerPE имеет 1 вариант с 1 несинонимичным SNP по сравнению с референсным геном. Ген gerPF — как и у штаммов линии A и B, кроме гена оперона gerP, есть второй ген с таким обозначением вне оперона. Оба не отличаются от референсного штамма. Ген gerPB имеет стартовый кодон TTG.

Оперон gerS — из 3 генов вариабельны 2. gerSA имеет 2 варианта, 1-й соответствует референсному, 2-й отличается одним несинонимичным SNP. gerSC в 1 варианте, отличается одним синонимичным SNP. У гена gerSB стартовый кодон GTG.

Оперон gerX — из 3 генов вариабельны 2. Ген gerXB в одном варианте с 1 несинонимичной нуклеотидной заменой. Ген gerXC 1 вариант, ген бóльших размеров, чем референсный, с 2 инделами и 1 несинонимичным SNP, со сдвигом рамки считывания и образованием псевдогена.

Оперон gerY — 3 гена. Ген gerYA с 1 вариантом, отличающимся 2 несинонимичными SNP. Ген gerYB с 1 вариантом, имеющим 1 несинонимичный SNP. Ген gerYC имеет 1 вариант, как у референсного штамма, со стартовым кодоном ATT.

В целом 25 белков герминации спор линии C имели 28 вариантов. Частота встречаемости SNP составляла 4,0, инделов — 0,8, псевдогенов — 0,2 и также была значительно выше, чем у штаммов линии A.

B. cereus biovar anthracis

Из 25 генов 4 не отличались от референсных. Это были гены оперона gerP A, B, D и F. Ген gerPC имел 1 синонимичный и 1 несинонимичный SNP. Ген gerPE отличался 7 SNP, 1 из которых несинонимичный. Гены gerKB и gerSB имели стартовый кодон GTG, gerLB и gerPB — TTG.

Оперон gerX устроен так же, как у штамма 2002013094 линии C. Ген gerXC представлен в форме псевдогена. Можно отметить, что gerXA идентичен у всех 3 линий B. anthracis и B. cereus biovar anthracis.

В опероне gerK ген gerKA является псевдогеном из-за присутствия в рамке считывания стоп- кодона.

Остальные гены герминации спор B. cereus biovar anthracis имели множество отличий от таковых у B. anthracis. Больше всего было SNP (483), из них113 приводящих к аминокислотным заменам, 7 инделов и 2 псевдогена. В целом 25 белков герминации имели 27 вариантов.

Таким образом, анализ показал, что количество полиморфизмов в генах и белках герминации спор у штаммов B. anthracis линии B было в 2,7–25,6 раза, линии C — в 2,0–23,5 раза, а у штамма B. cereus biovar anthracis — в 20–2841 раз больше, чем у штаммов линии A. Значимые замены в генах, приводящие к изменению аминокислотного состава белков, также значительно чаще встречались у штаммов линий B, С и штамма B. cereus biovar anthracis.

Обсуждение

По результатам анализа in silico в геномах штаммов B. anthracis и штамма B. cereus biovar anthracis str CI определяются 7 полицистронных оперонов рецепторов герминантов: gerH, gerK, gerL, gerP, gerS, ger X и gerY, а также отдельные гены прорастания спор gerM и spoVAF. Последний описан как ген белка MULTISPECIES: spore germination protein SpoVAF, но он входит в один оперон с генами белков стадии V споруляции spoVAE, spoVAD, spoVAC, spoVAB и spoVAA. Дистальная часть оперона spoVA Bacillus subtilis содержит открытую рамку считывания гена spoVAF, кодирующую белок (SpoVAF), очень схожий с белками прорастания спор, кодируемых генами gerAA и gerBA. Рамка считывания фактически перекрывает ген spoVAE примерно на 30 остатков, поэтому не ясно, является ли этот ген частью оперона spoVA или регулируется отдельно. У штаммов B. anthracis рамка считывания гена spoVAF перекрывает примерно на 13 остатков ген spoVAE. Отметим, что у B. anthracis и B. cereus biovar anthracis в опероне spoVA имеются 2 гена spoVAE, расположенных один за другим, не перекрываясь.

Трицистронный оперон gerH у B. anthracis важен для прорастания эндоспор, запускаемого 2 различными путями реакции прорастания, называемыми инозин-гистидиновым и пурин-аланиновым. Вместе эти 2 пути позволяют эндоспорам B. anthracis более широко распознавать пурины и аминокислоты, которые могут быть существенны для опосредованного средой прорастания в организме хозяина [9]. Получены данные, которые предполагают, что gerH необходим не только для инозинзависимой герминации, но он также способен вызвать полную герминацию в отсутствие всех других рецепторов [7].

Общее количество всех полиморфизмов у гена gerHA всех 3 линий B. anthracis было наивысшим (112) среди всех генов рецепторов герминации. Нами показано, что gerHA имеет несколько вариантов размера: 2088, 2166, 2190, 2244, 2322 и 2385 п.н., отличающихся, кроме SNP, инделами, часть из которых определялась наличием ранее не идентифицированных VNTR. Три варианта gerHA отличались размерами ввиду наличия VNTR c единицей повтора размером 78 п.н. в области 392–703 п.н. с числом повторов 3 для штаммов линии A Ames Ancestor (canSNP группа A.Br.Ames), Tsiankovskii-1 и Larissa (canSNP группа A.Br.008/011), 1144 (canSNP группа A.Br. 011/009), Australia 94 (canSNP группа A.Br.Aust94), Western North America (canSNP группа A.Br.WNA), H9401 (canSNP группа A.Br.005/007), A1055 и A3783 линии C.Br.A1055. 2 повтора были у штамма 2002013094 canSNP группы C.Br.A1055. У штаммов Vollum (canSNP группа A.Br.Vollum), V770-NP-R (canSNP группа A.Br.003/004), CZC5(canSNP группа A.Br.005/006), 2000031021 и 2000031052 (линия С) имелась 1 единица этого повтора. Четыре повтора были у штаммов CNEVA-9066 (canSNP группа B.Br.CNEVA) и HYU01(canSNP группа B.Br.001/002). Соответствующие белки имели 2, 3 и 4 единицы повтора DSDQGQQQHSKQDESSQEQQHSKQD (рис. 1, а). У штамма Kruger B, кроме 3 повторов, были также делеции 719–764 и 768–775 п.н.

 

Рис. 1. Области гена gerHA с вариабельным числом тандемных повторов (транслированные последовательности).

Fig. 1. Regions of the gerHA gene with a variable number of tandem repeats (translated sequences).

 

VNTR с единицей повтора размером 117 п.н. отмечен у штамма HYU01 (canSNP группа B.Br.001/002) в области 275–508 п.н. (2 повтора), у штаммов Kruger B (canSNP группа B.Br.Kruger B) и Ames Ancestor — одна единица такого размера. Соответствующие белки GerHA имели 2 повтора и 1 единицу повтора DSDQGQQQHSKQGNSDQGQQQHSKQGDSQGQQNHSKQN (рис. 1, б).

Штамм B. cereus biovar anthracis CI имел размер gerHA 1917 п.н. за счёт делеции, включающей 2 повтора 117 п.н., а также 2 делеции 246–342 и 488–697, 47 SNP, из которых 10 были несинонимичными.

Таким образом, области повторов размером 117 и 78 п.н. частично перекрывались на протяжении 392–508 п.н. В целом у штаммов линии A было 3 варианта gerHA, но минимальный вариант — 2088 п.н. — не отмечен у наиболее распространённых canSNP групп A.Br.008/011, A.Br.011/009, а также у штаммов линии B, среди которых встречались 4 варианта генов и белков. Для штамма 2002013094 линии C характерен 1 вариант размером 2166 п.н., который отмечен и у штаммов линий A и B. У этого штамма порядок субъединиц в опероне gerH обратный — C-B-A, в отличие от штаммов других линий.

Ранее нами установлено, что у штаммов основной генетической линии B отсутствие амплификации VNTR-локуса Bams34 при MLVA связано с делецией или заменами оснований в области отжига обратного праймера и что эта область приходится на ген прорастания спор gerHA штамма B. anthracis Ames Ancestor. Кроме того, что данная особенность служит надёжным генетическим маркером и может использоваться для молекулярного субтипирования и дифференциации линий A и C от B, изучение различий генов и влияние их на функцию белков прорастания спор возбудителя сибирской язвы важно, поскольку процесс прорастания спор является критическим в жизненном цикле этого патогена и становлении инфекции [17].

Трицистронный оперон gerS у B. anthracis опосредует прорастание эндоспор герминантами, содержащими ароматические кольцевые структуры [8]. Все 3 гена gerS у штаммов линии A не вариабельны. Ген gerSA линии B имеет 2 варианта: вариант 1 для штаммов HYU01 (canSNP группа B.Br.001/002), Kruger B, Zimbabwe 89 и SVA11 (группа B.Br.Kruger B) имеет 1 несинонимичный SNP. Вариант 2 у штамма CNEVA-9066 (группа B.Br.CNEVA) имеет 2 несинонимичных SNP.

Ген gerSB у штаммов линии B представлен двумя вариантами: вариант 1 для штаммов Kruger B, SVA11, Zimbabwe 89 (группы B.Br.Kruger B), с 1 SNP в гене имеет 1 замену аминокислот; вариант 2 для штаммов CNEVA-9066 и HYU01 соответствует референсному. Ген gerSC имеет 2 варианта: вариант 1 для штаммов Kruger B, SVA11, Zimbabwe 89 (группы B.Br.Kruger B) имеет 1 SNP в гене и 1 замену аминокислот; вариант 2 для штаммов CNEVA-9066 и HYU01 соответствует референсному.

У линии C 2 варианта — для штаммов 2002013094, 2000031021, A1055 и A3783, как у референсного штамма, и для штамма 2000031052 с несинонимичным SNP 1442G→ A(R488H).

Оперон gerP, включающий 6 генов, может быть вовлечён в процесс доставки герминантов к их рецепторам во внутренней мембране споры и играет роль в проницаемости споровой оболочки [16]. Гены gerPA, gerPB и gerPD представлены только в 1 варианте. Ген gerPC имеет 2 варианта, отличающиеся 1 несинонимичным SNP в гене, ген gerPE — 2 варианта, также отличающиеся 1 несинонимичным SNP. Вариант 1 встречается только у штаммов группы A.Br.Ames, вариант 2 — у всех групп линий A, B, C B. anthracis и B. cereus biovar anthracis CI.

Кроме гена gerPF, в составе оперона gerP есть ортолог с таким обозначением и такого же размера, но другого нуклеотидного состава вне оперона. Оба не отличаются от референсного штамма и имеются у штаммов B. anthracis всех линий и у B. cereus biovar anthracis CI.

В совокупности профили прорастания отдельных мутантов с делетированным одним из генов оперона gerP (ΔgerP) и тройного мутантного штамма с выключенными генами gerPF, gerPF 2 и gerPF 3 оперона gerP (ΔgerPFnull) позволяют предположить, что каждый белок GerP играет решающую роль в содействии правильному и быстрому прорастанию. Эта роль может включать в себя попадание питательных веществ в споры, выход дипиколината кальция из спор или и то, и другое [16].

По нашим данным, ген gerKA штамма STI1 линии A (canSNP группа A.Br.008/011) содержит синонимичный SNP 1392A→G, штаммы линии B Tyrol 4675, BF1 и BF5 (группа B.Br.CNEVA) — несинонимичный SNP 211T→G (L71V). У штаммов линии B CNEVA-9066 и RA3 (группа B.Br.CNEVA), группы B.Br.001/002 и штамма Zimbabwe 89 группы B.Br.Kruger B, а также у штамма линии С ген соответствует референсному. Штамм Kruger B (группа B.Br.Kruger B) имеет мутацию со сдвигом рамки считывания, а B. cereus biovar anthracis CI — стоп-кодон и нефункциональные белки GerKA у обоих штаммов. gerKB у штаммов всех 3 линий B. anthracis не вариабелен, а B. cereus biovar anthracis CI содержит 6 синонимичных SNP, а также 2 несинонимичных SNP 181C→A(L61I) и 427G→T (V143L). gerKC у штаммов линий B и C не вариабелен, у штаммов линии A Vollum (canSNP группа A.Br.Vollum), H9401(canSNP группа A.Br.005/007) и K3 (canSNP группа A.Br.005/006) ген представлен псевдогеном из-за делеций со сдвигом рамки считывания и нарушения функции белка GerKC.

Ген gerLA у штаммов линий B и С не вариабелен, у штаммов линии A отмечены 3 варианта, при этом 2 варианта есть у референс-штамма Ames Ancestor, отличающиеся вставкой 1–42 GTGGGGGATTTGTTAGAGCTAAAAGGTAACTTATTTGAAGTT (VGDLLELKGNLFEV) у наиболее распространённого варианта 2. У варианта 2 стартовый редкий триплет GTG. У варианта 1 обычный стартовый триплет ATG, который имеется и у варианта 2 в положении 43–45). Тот же вариант, что и вариант 1 штамма Ames Ancestor, есть у штамма JB25 (canSNP группа A.Br.Aust94). Еще один вариант gerLA, имеющий делецию 1–9 и несинонимичный SNP 79G→T (D27Y), принадлежит штамму JB10 (canSNP группа A.Br.Aust94) с инициирующим триплетом TTG, у которого в положении 43–45, как и у варианта 1 штамма Ames Ancestor, есть обычный кодон ATG (рис. 2). Эти различия могут быть следствием особенностей трансляции последовательностей белков в разных сборках геномов штаммов, которые в базе данных Protein database NCBI обозначены как разные варианты GerLA. Нельзя исключить также, что в разных условиях трансляция с разной эффективностью может начинаться с разных стартовых кодонов.

 

Рис. 2. Варианты gerLA штаммов B. anthracis.

Fig. 2. gerLA variants of B. anthracis strains.

 

Показано, что GerK и GerL демонстрируют частично перекрывающиеся герминантные специфичности, в том смысле, что они оба участвуют в аланиновом ответе, сохраняя при этом уникальные способности к распознаванию аминокислот. Анализ in vitro выявил индивидуальный вклад каждого рецептора герминации в известные фенотипы прорастания эндоспор B. anthracis. Кроме того, рецепторы герминации способны распознавать несколько соединений в определённом классе питательных веществ и, таким образом, могут рассматриваться как рецепторы молекулярного паттерна. Каждый известный путь прорастания требует по крайней мере 2 различных рецепторов. Вполне вероятно, что в совокупности эти требования к прорастанию способствуют высокой точности, с которой B. anthracis должен отличать почвенную среду от животного-хозяина в течение своего сложного жизненного цикла [10].

Несмотря на то что ветви А и В хорошо известны, весьма необычные изоляты ветвей С были описаны совсем недавно. Открытие ветви С позволяет предположить, что в природе могут существовать более разнообразные генотипы B. anthracis, но они редко встречаются во время вспышек сибирской язвы. В противоположность этому, наиболее успешное распространение и адаптация к новым условиям окружающей среды ветви А, возможно, произошли из-за случайного глобального рассеивания или неизвестного адаптивного преимущества. Подходящий генотип может быть успешным либо из-за стохастических процессов, либо из-за фенотипических характеристик, которые создают репродуктивное преимущество. Таких биологических различий между этими группами не установлено, поскольку адаптивные фенотипы трудно различимы, но именно поэтому их нельзя исключать в качестве объяснения успеха группы. С другой стороны, считается, что темп эволюции каждой ветви может отражать адаптивные различия, такие как скорость прорастания спор, таким образом уравновешивая отбор для долгосрочного выживания и эффективное размножение [18]. Линия С — самая древняя, длительность и скорость её эволюции способствовали накоплению мутаций, подверженных контрселекции. Она не обнаружена нигде, кроме США, штаммы датируются 1956 г. и после этого не выделялись. Условий для передачи возбудителя между дикими животными, которые были в изобилии в древности, было гораздо больше, чем при передаче в случае сельскохозяйственных животных в современных условиях и меньшей восприимчивости в результате вакцинации. В настоящее время в GenBank можно найти 5 геномов штаммов линии C, из которых 3 лишены плазмиды pXO1, кодирующей белки основных факторов патогенности — токсинов, что ограничивает возможности распространения этой линии. Ветвь B1 распространена в Южной Африке, где и сейчас есть большие стада восприимчивых диких копытных хозяев. Напротив, ветвь B2 встречается на юге Франции, Италии, Швейцарии, Германии, в пределах трансальпийского пояса, где хозяевами могут быть в основном одомашненные животные, исторически традиционно разводимая порода коров, с гораздо меньшими возможностями для заражения [19]. Доступность или плотность популяции хозяина могут быть движущей экологической силой, определяющей частоту передачи и, следовательно, скорость эволюции, которая для линий C и B прежде была высокой, но сейчас замедлилась. Эволюция линии A, лишенной мутаций, элиминированных в ходе селективного отбора, которая широко распространилась благодаря активности человека и вытеснила линии B и C, продолжается, способствуя успешной адаптации. Интересно отметить, что штаммы линии B, прежде встречавшиеся на Кавказе, после 1963 г. не выделялись, но сейчас вызывают вспышки сибирской язвы в азиатской части России. В частности, изоляты из вспышки 2016 г. на Ямале относились к линии B и, как считают, активизировались из старых почвенных очагов в результате таяния вечной мерзлоты и являются древними [20, 21]

Поиск различий в генах и белках герминации спор штаммов B. anthracis основных генетических линий направлен на установление адаптивных фенотипов.

Таким образом, в результате проведённых исследований получены ранее не описанные в научных публикациях новые данные. Их анализ показал, что количество полиморфизмов, в том числе несинонимичных SNP в генах герминации спор, приводящих к изменению аминокислотного состава белков, у штаммов B. anthracis линий B, C и штамма B. cereus biovar anthracis было существенно больше, чем у штаммов линии A. Подобная закономерность отмечена нами также при анализе белков и генов факторов патогенности B. anthracis и B. cereus biovar anthracis [6].

Впервые установлено, что в пределах гена gerHA имеются 2 области с вариабельным числом тандемных повторов. В зависимости от числа повторов возможно дифференцирование как штаммов основных линий A, B и С, так и внутри линий, с привязкой к каноническим SNP-группам и некоторым конкретным штаммам. Наличие 12 SNP, включая 1 несинонимичный, в гене gerM штаммов линий B и C позволяет отличать их от штаммов линии A. Впервые показано, что редкие стартовые кодоны TTG, GTG, TGT и ATT встречаются у 6 генов штаммов 3 линий B. anthracis: gerKB, gerLA, gerLB, gerPB, gerSB и gerYC. Ген gerLA у штаммов линии A имеет 3 варианта, при этом у 2 из них определяется по 2 стартовых кодона, 1 из которых относится к редким TTG или GTG.

Заключение

Анализ генов и белков рецепторов герминации спор B. anthracis и B. cereus biovar anthracis показывает, что существует их значительная вариабельность как в пределах основных генетических линий, так и, особенно, между линиями. Вариабельность выражалась в наличии SNP, инделов, псевдогенов и определяемых ими вариантов 25 генов и белков. Меньше всего полиморфизмов у штаммов наиболее распространённой линии A. Гораздо больше их у штаммов линий B и C. Максимум полиморфизмов отмечен для B. cereus biovar anthracis, что вполне объясняется его в определённом смысле двойственной природой — хромосомными генами, свойственными B. cereus, и плазмидными, гомологичными B. anthracis. Учитывая, что только один оперон рецепторов прорастания gerX локализуется на плазмиде pXO1 и её варианте pCI-XO1 B. cereus biovar anthracis str CI, не удивительны фундаментальные отличия большинства генов прорастания спор у этого вида. Кроме того, ген gerXC, считающийся также геном вирулентности, у B. cereus biovar anthracis и штаммов B. anthracis линии С является псевдогеном, что может влиять на функции как прорастания спор, так и вирулентности.

Значимых замен в генах рецепторов герминации спор, приводящих к изменению аминокислотного состава белков, также значительно больше у штаммов B. anthracis основных генетических линий B, С и B. cereus biovar anthracis. Подобная закономерность, отмеченная нами также при анализе белков и генов факторов патогенности B. anthracis и B. cereus biovar anthracis, может дополнительно свидетельствовать об ограниченных адаптационных возможностях линий B и C и быть одним из объяснений их меньшей распространённости по сравнению с линией A.

Идентифицированы неописанные VNTR в пределах гена gerHA с единицей повтора 78 и 117 п.н. и SNP в гене gerM, варьирующие между и внутри изолятов разных генетических линий. Найдены различия в генах gerHA и gerM, не описанные ранее в научных публикациях, позволяющие дифференцировать основные генетические линии B и C от линии A. Показано, что 6 генов рецепторов герминации имеют редкие стартовые кодоны TTG, GTG, TGT и ATT.

Полученные в результате работы данные дополняют сведения о реализации первого этапа жизненного цикла — прорастания спор, расширяя представление об эволюции этого патогена. Они могут быть использованы для определения происхождения штаммов, вызвавших вспышки сибирской язвы, в ходе эпидемиологического расследования. Продолжением данных исследований может быть изучение вариабельности генов споруляции, ещё одной важной стадии жизненного цикла возбудителя сибирской язвы.

 

¹ NCBI. Genomes & Maps.

URL: https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/833/275

About the authors

Evgeny I. Eremenko

Stavropol Plague Control Research Institute

Author for correspondence.
Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1117-1185

D. Sci. (Med.), Prof., chief scientist, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Alla G. Ryazanova

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5196-784X

Cand. Sci. (Med.), Head, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Grigorii A. Pechkovskii

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7033-9972

junior researcher, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Sergey V. Pisarenko

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6458-6790

Cand. Sci. (Chem.), leading researcher, Laboratory of biochemistry

Россия, Stavropol

Dmitry A. Kovalev

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9366-5647

Cand. Sci. (Chem.), Head, Laboratory of biochemistry

Россия, Stavropol

Lyudmila Yu. Aksenova

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7744-3112

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Olga V. Semenova

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0274-898X

Cand. Sci. (Biol.), researcher, Anthrax laboratory

Россия, Stavropol

Alexander N. Kulichenko

Stavropol Plague Control Research Institute

Email: ejer@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9362-3949

D. Sci. (Med.), Prof., Academician of RAS, Director

Россия, Stavropol

References

Supplementary files