MICROBIOTA OF LOWER URINE TRACT AND GENITAL ORGANS OF HEALTHY MEN AND IN INFERTILITY

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Изучение микробиома нижних мочевых путей и половых органов здоровых мужчин в норме находится в контексте фундаментального изучения микробиома человеческого организма (Нumаn Microbiome Project), который во многих позициях поколебал длительно существовавшие и существующие парадигмы о «стерильности» различных биотопов и расширил представления о микробном спектре желудочно-кишечного, урогенитального трактов, кожи и других локусов макроорганизма [15, 25]. Это стало возможным при использовании современных методов детекции микроорганизмов, в частности, изучении 16S pРНК различных видов бактерий. В настоящее время метод полнообъемного секвенирования генов, к сожалению, недоступен большинству микробиологических лабораторий, но и обычное бактериологическое исследование, которое по праву считалось и считается «золотым стандартом» диагностики, имеет большие и нереализованные возможности. Ранее нами были опубликованы работы о микробном спектре мочи молодых здоровых женщин, живущих половой жизнью, и девственниц [1, 13] с широким спектром идентифицированных микроорганизмов (ФАБ - 10 представителей, НАБ - 8 представителей) с использованием обычного бактериологического метода, но различных методик культивирования (в аэробных и анаэробных условиях) и расширенного набора питательных сред для ФАБ и НАБ. Изучение микробиоты мочи, эякулята у мужчин является актуальным для получения полнообъемной информации о понятии «норма» и для интерпретации результатов бактериологического и генетического методов исследования при инфекционных заболеваниях репродуктивного тракта мужчин. В эякуляте обнаруживают широкий спектр условно патогенных микроорганизмов: Peptoniphilis spp., Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium sрp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Gardnerella spp., Prevotella spp., Еscherichiа соБ, Finegoldia [5, 20, 23, 24]. Изучение микрофлоры эякулята при бесплодии имеет важное значение, так как инфекция с последующим воспалением репродуктивного тракта мужчин может привести к нарушению сперматогенеза [20, 21]. Доказана связь между бесплодием и наличием патогенных микроорганизмов в репродуктивном тракте [7, 9, 18]. Некоторые виды облигатно и условно патогенных бактерий нарушают подвижность сперматозоидов, влияют на митохондрии и ДНК (Е.соИ, Enterococcus faecalis, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrhoeae, Coxiella trachomatis, Treponema vaginalis, Candida albicans) [7, 9, 11, 12, 14, 18]. Цель - изучить микробиоту мочи, эякулята соскоба уретры в норме и эякулята при инфертильности. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование проводили на базе РостГМУ. Обследованы 28 (I группа - контрольная) здоровых сексуально активных мужчин в возрасте 20 - 25 лет. Критериями включения явились: возраст до 25 лет, отсутствие в анамнезе и на момент исследования урологических заболеваний и инфекций, передающихся половым путем; II группу составили 26 мужчин с бесплодием в возрасте 25 - 35 лет, у которых был выявлен асимптоматический простатит и инфертильность. У обследуемых обеих групп отсутствовали генетические, системные, аутоиммунные заболевания, факторы риска (радиоактивное излучение и т.д.). Никто не принимал лекарственные препараты, в том числе антибиотики, кортикостероиды последние 2 месяца. Из исследования исключались мужчины с ранее диагностированным крипторхизмом или орхитом. У обследуемых I группы на исследование забирали среднюю порцию утренней мочи, эякулят, соскоб уретры. У пациентов II группы - эякулят. Образцы эякулята забирали после 3 - 7 дней воздержания в соответствии с МУ 4.2.2039-05 (2006 г.). Бактериологическое исследование мочи проводили по [2], но с использованием расширенного набора питательных сред для ФАБ (Эндо, Hi Crom Candida Differential Agar, Hi Crom Enterococci Agar, Hi Crom Aureus Agar Base, желточносолевой агар, кровяной агар, приготовленный на основе Muller Hinton Agar с добавлением бараньих эритроцитов) и НАБ (Блаурокка, Shaedler Agar и бульон, Bacteroides ВПе Esculinum Agar) фирмы HiMedia (Индия). Затем посевы инкубировали в аэробных и анаэробных условиях культивирования в присутствии газовой смеси (10% СO2, 10% Н2, 80% N2). Идентификацию выделенных бактерий проводили по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим признакам с помощью энтеро-, стафило-, неферм-, анаэростестов (Lachema, Чехия). У обследуемых 1 группы эякулят делили на две аликвоты для бактериологического и ПЦР исследований с обязательной маркировкой стерильных пластиковых контейнеров. Перед проведением бактериологического исследования проводили десятикратные разведения эякулята в тиогликолевом буфере с высевом на соответствующие питательные среды [3]. ПЦР исследование соскоба уретры для идентификации ФАБ и НАБ проводили с использованием наборов реагентов «Фемофлор-16» (НПО ДНК-Техноло-гия, Москва). Учет и интерпретацию результатов осуществляли с помощью программного обеспечения, поставляемого с амплификатором детектирующим ДТ-96 (НПО ДНК-Технология). У пациентов II группы бактериологическое исследование эякулята проводили по аналогии с обследуемыми I группы. РЕЗУЛЬТАТЫ При бактериологическом и ПЦР исследовании соскобы уретры, эякулята и мочи обследуемых I группы получены данные, представленные в табл. 1. У условно здоровых молодых мужчин в соскобе уретры и эякуляте при использовании ПЦР обнаружен широкий спектр ФАБ (7 представителей) и НАБ (13 представителей). В группе ФАБ определены доминирующие кластеры. Кластер I - Corynebacterium spp. (67,9%), кластер II - коагулазоотрицательные стафилококки (КОС) (67,9%). В группе НАБ доминирующим кластером III явились Eubacterium spp. (67,9% и 60,7% соответственно). Mobiluncus spp., Peptostrepto-coccus spp., Megasphaera elsdenii, Veillonella spp., Porphyromonas spp., Dialister, Gardnerella vaginalis достоверно чаще (p<0,05) регистрировали в соскобе уретры. Среди НАБ можно выделить кластер IV с невысоким, но равнозначным обнаружением микроорганизмов как в соскобе уретры, так и в эякуляте, к которому отнесены Bacteroides spp., Fusobacteriumspp., Sneathia, Leptotrichia. Atobium vaginale регистрировали только в соскобе уретры. При бактериологическом исследовании эякулята I группы обследуемых среди ФАБ доминировали те же кластеры I и II Corynebac-terium spp. (78,6%) и обширная группа ко-агулазоотрицательных стафилококков (КОС) (89,3%). Паттерн КОС был представлен S.haemo-lyticus (50,0%), S.epider-midis (35,7%), S.warneri (28,6%), S.lentus (7,1%). Средний уровень обсе-мененности эякулята был достоверно выше (p<0,05) для Corynebacterium spp. (lg 2,9 КОЕ/мл), чем для КОС (lg 1,6 КОЕ/мл). В группе НАБ, обнаруженных в эякуляте, Corynebacterium spp. 67,9 КОС 67,9 Enterococcus spp. 39,3 Gardnerella vaginalis 39,3* Klebsiella spp. 10,7 Ureaplasma spp. 28,6* Staphylococcus aureus 0 Eubacterium spp. 67,9 Mobiluncus spp. 60,7* Peptostreptococcus 60,7* spp. Megasphaera elsdenii 50,0* Bacteroides spp. 21,4 Prevotella spp. 28,6 Peptococcus spp. 10,7 Fusobacterium spp. 10,7 Veillonella spp. 39,3* Porphyromonas spp. 28,6* Sneathia 10,7 Leptotrichia 10,7 Dialister 28,6* Atobium vaginale 21,4 Propionibacterium spp. 0 Bifidobacterium spp. 0 Примечание. * р<0,05 Таблица 1. Сравнительный анализ микробиоты мочи, уретры и семенной жидкости у молодых здоровых мужчин ПЦР (частота обн., %) Бактериальное исследование Микроорганизмы соскоб эякулят Частота обн., % Ср. кол-во, lg КОЕ/ мл уретры моча эякулят моча эякулят 67,9 78,6 89,3* 1,6 2,9* 60,7 89,3* 78,6 1,3 1,6 39,3 50,0 50,0 1,2 2,2 21,4 0 0 0 0 10,7 10,7 10,7 1,0 1,0 10,7 0 0 0 0 0 10,7 10,7 1,0 1,0 60,7 78,6* 60,7 2,6 3,2 39,3 10,7 28,6* 1,0 1,7 28,6 50,0 50,0 1,4 2,8* 28,6 21,4* 10,7 2,0* 1,0 21,4 21,4* 0 2,5* 0 21,4 0 10,7 0 2,0* 10,7 21,4* 10,7 1,0 1,0 10,7 10,7 21,4* 1,0 3,0* 10,7 10,7 21,4* 1,0 2,0* 10,7 0 0 0 0 10,7 0 0 0 0 10,7 0 0 0 0 10,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10,7 10,7 2,0 2,0 0 0 10,7 0 2,0 также как и в соскобе уретры, доминировал Таблица 2. Анализ микробиоты семенной кластер III (Eubacterium spp., 60,7%). Обра- жвдк^та у шшвдьк мужчин с инфертильностью Микроорганизмы Частота обнаружения (%) Среднее количество (lg КОЕ/мл) КОС 100 1,7 S.haemolyticus 53,8 1,8 S.warneri 30,8 1,2 S.lentus 30,8 2,0 S.epidermidis 23,1 2,3 S.coagulans 15,4 1,0 Corynebacterium spp. 92,3 2,3 Enterococcus spp. 84,6 2,2 S.aureus 23,1 1,3 Micrococcus spp. 23,1 1,3 Klebsiella spp. 15,4 1,5 Enterobacter spp. 7,7 1,0 Candida spp. 7,7 1,0 Propionibacterium spp. 53,8 3,1 Peptococcus spp. 53,8 2,3 Peptostreptococcus spp. 53,8 2,8 Veillonella spp. 38,5 1,8 Fusobacterium spp. 30,8 3,5 Eubacterium spp. 30,8 3,0 Bacteroides spp. 15,4 3,0 Megasphaera elsdenii 15,4 1,5 Mobiluncus spp. 7,7 2,0 щает на себя внимание идентичность полученных результатов для данных бактерий как при проведении ПЦР (60,7%), так и при использовании бактериологического метода (60,7%) с достаточно высоким средним уровнем обсемененности (lg 3,2 КОЕ/мл) эякулята. Анализируя количественные показатели обсемененности эякулята, необходимо отметить, что Fusobacterium spp. обнаружены в 21,4% случаев, и средний уровень обсеменен-ности ими эякулята здоровых мужчин был lg 3,0 КОЕ/мл. При анализе результатов бактериологического исследования мочи молодых здоровых мужчин сохраняется описанная выше тенденция доминирования соответствующих кластеров I, II, III с незначительным уровнем обсемененности. У пациентов II группы (табл. 2) с инфер-тильностью при бактериологическом исследовании эякулята выделен широкий спектр ФАБ (8 представителей) и НАБ (9 представителей). В группе ФАБ доминировали те же кластеры I (Corynebacterium spp.) и II (КОС), как и у здоровых мужчин практически с идентичным I группе уровнем обсемененности эякулята. В отличие от I группы обследованных, у пациентов II группы достоверно чаще (p<0,05) в эякуляте обнаруживали Enterococcus spp. (84,6%, lg 2,2 КОЕ/мл). Паттерн КОС был представлен теми же видами, что и у здоровых мужчин: S. haemolyticus (53,8%), S.warneri и S.lentus (по 30,8%), S.epidermidis (23,8%), S.co-agulans (23,1%). Причем в I и II группах доминировал вид S.haemolyticus (50,0 и 53,1% соответственно). Интересным представляется также то обстоятельство, что из представителей семейства Enterobacteriaceae в обеих группах регистрировали Klebsiella spp. (10,7 и 15,4% соответственно). Во II группе у 2 пациентов (7,7%) в эякуляте обнаружены Enterobacter spp. с минимальным уровнем обсемененности (lg 1,0 КОЕ/мл). В единичных случаях у пациентов II группы из эякулята выделяли дрожжеподобные грибы Candida tropicalis. В группе НАБ у пациентов II группы наблюдается смещение доминирующего кластера III (Eubacterium spp.). У больных с инфертильностью преобладают Propionibacterium spp., Peptococcus spp. и Peptostreptococcus spp. (по 53,8%). Уровень обсемененности Propionibacterium spp. во II группе (lg 3,1 КОЕ/мл) достоверно выше (p<0,05) по сравнению с I группой (lg 2,0 КОЕ/мл). Обращает на себя внимание идентичный уровень обсемененности эякулята Peptostreptococcus spp. в обеих группах (lg 2,8 КОЕ/мл). Удельный вес Propionibacterium spp., Fusobacterium spp., Peptococcus spp., Veillonella spp. достоверно выше (p<0,05) у пациентов II группы. Однако уровень обсемененности эякулята НАБ во II группе в большинстве случаев достоверно не отличался от аналогичного показателя обсемененности I группы. ОБСУЖДЕНИЕ Результаты проведенных исследований показали, что в сперме здоровых и инфертильных мужчин обнаружен широкий спектр разнообразных микроорганизмов, в частности, неклостридиальных анаэробов. По многим позициям ПЦР и бактериологическое исследование практически совпадают. Хочется обратить внимание, что в данной работе использован не рутинный бактериологический анализ с использованием нескольких питательных сред, предназначенных для выделения крайне узкого спектра микроорганизмов, а специальные среды и условия культивирования для анаэробных бактерий. Отличий в факультативно -анаэробном компоненте микробиоты эякулята здоровых и инфертильных мужчин практически нет. В обеих группах доминируют Corynebacterium spp. и КОС, причем в последнем кластере вид S.haemolyticus. Паттерн НАБ в обеих группах тождественен, но со смещением по частоте обнаружения доминирующих позиций Eubacterium spp. в I группе на Propionibacterium spp. и Peptostreptococcus spp. во II группе. На сегодняшний день невозможно однозначно ответить на вопрос о том, что широкий спектр микроорганизмов (а сколько еще видов не идентифицировано) всегда был присущ данному биотопу или это результат транслокационного механизма из близлежащих биотопов. Многие из бактерий, обнаруженных в эякуляте, могут содержаться в моче [14], мочеиспускательном канале [19, 22], венечной борозде [16] и влагалище [4]. Таким образом, бактерии, регистрируемые в эякуляте, могут иметь различное происхождение. Данные работы [6], которая проведена на основе изучения 16S pРНК бактериальные сообщества спермы здоровых и инфертильных мужчин, корреспондируют с полученными нами данными о доминирующих кластерах бактерий. Это свидетельствует о том, что в основных позициях сперма здоровых и инфертильных мужчин практически не отличается. На основании математического анализа авторы показали, что имеется отрицательная коррелятивная связь между качеством спермы и обнаружением в ней анаэробных кокков, которые относят к нормальным симбионтам различных биотопов макроорганизма, в частности влагалища, кишечника, кожи [8, 16]. В исследовании [10] указывается на высокую частоту обнаружения некоторых видов анаэробных кокков в сперме бесплодных мужчин. Влияют ли анаэробные кокки на качество спермы, на сегодняшний день ответить невозможно. Этот вопрос требует дальнейшего изучения. На наш взгляд, интересным представляется следующий факт: в микробиоте эякулята мужчин четко прослеживается тенденция микробиоты влагалища женщин с доминированием и широким спектром НАБ, а также тождественными таксонами ФАБ. В наших исследованиях это Corynebacterium spp., обширная группа КОС, Propionibacterium spp., Eubacterium spp., Peptostreptococcus spp., Peptococcus spp. и другие. По данным [17] этот обмен микрофлорой между мужчиной и женщиной изменяет состав микробных сообществ в репродуктивном тракте на кратковременный или отсроченный период. Данные изменения могут не влиять на композицию микробных сообществ в биотопе, но могут увеличивать риск бактериального вагиноза и инфекций, передающихся половым путем. Проведенное исследование эякулята, направленное на поиск бактериальных маркеров инфертильности, пока лишь констатирует факт незначительных отличий в частоте обнаружения некоторых представителей НАБ в сперме мужчин с бесплодием, но количественные характеристики микроорганизмов, обнаруженных в сперме здоровых и инфертильных мужчин, практически не отличаются. Исследование микробиоты эякулята в норме и при инфертильности требует дальнейшего изучения в связи с актуальностью при бесплодии как таковом, бактериальном вагинозе как проблеме беременности и заболеваниями, передающимися половым путем, вызванными не только облигатно-, но и условно патогенной (оппортунистической) микрофлорой.

About the authors

Yu. L Naboka

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

M. I Kogan

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

I. A Gudima

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

Kh. S Ibishev

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

D. G Pasechnik

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

A. K Logvinov

Rostov State Medical University, Research Institute of Neurocybernetics

Rostov-on-Don, Russia

Sh. B Ilmdarov

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files