FLOW-CYTOFLUOROMETRIC STUDY OF BACTERICIDAL GRANULES IN BLOOD PHAGOCYTES OF ANIMALS WITH VARIOUS SPECIES SENSITIVITY TO EXPERIMENTAL PLAGUE INFECTION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ На территории нашей страны и многих государств мира имеются природные очаги чумы, где возбудитель этой самой опасной бактериальной инфекции постоянно циркулирует среди восприимчивых грызунов, создавая потенциальную угрозу эпидемических осложнений. Однако хорошо известно, что наряду с высокочувствительными и относительно резистентными к чуме видами животных существуют виды, которые нечувствительны к экспериментальному подкожному заражению вирулентными чумными микробами из оптически плотных стационарных культур, выращенных при температуре 28°C [4]. Резистентные к экспериментальной чуме животные либо совсем не болеют чумой (например, лошади), либо очень редко заболевают этой инфекцией в природных условиях (собаки, свиньи и некоторые другие крупные млекопитающие) [7]. Врожденный иммунитет играет ключевую роль в защите от патогенных микроорганизмов [6], но при чуме клеточные механизмы врожденной антибактериальной защиты недостаточно изучены [13, 18]. В частности, недостаточно исследованы особенности устройства и функционирования бактерицидных систем различных типов клеток врожденного иммунитета у людей и экспериментальных животных c различной видовой чувствительностью к чуме. Биологически активные вещества, обладающие выраженным бактерицидным эффектом (эластаза, катепсин G, протеаза 3, миелопероксидаза, азуросидин и дефенсины), присутствуют в первичных (азурофильных) гранулах нейтрофилов [16]. Эти гранулы, в отличие от лизосом макрофагов, считаются истинными бактерицидными органеллами, мобилизующимися при фагоцитозе [5], а также при более эффективном механизме киллинга бактерий, связанным с формированием и функционированием в крови сетеподобных бактерицидных структур (внеклеточных нейтрофильных ловушек), состоящих из смеси ядерного хроматина и содержимого бактерицидных гранул фагоцитов [14]. При внутрикожном заражении чумой способность возбудителя проникать в кровь и лимфатические узлы на 80% зависит через 4 ч после заражения от исхода взаимодействия чумных микробов с нейтрофильными гранулоцитами [18]. С различным содержанием (и/или с особым состоянием) БГ в этих клетках врожденного иммунитета могут быть связаны видовые различия в уровне чувствительности животных к экспериментальной чумной инфекции. Цель настоящей работы заключалась в сравнительном исследовании методом проточной цитометрии БГ фагоцитов крови животных с различной видовой чувствительностью к экспериментальной чумной инфекции в условиях процесса измерения, обеспечивающих эффективное автоматическое дифференцирование по данному показателю моноцитов и гранулоцитов в образцах цельной крови человека (то есть, без лизиса в крови эритроцитов и без предварительного выделения из крови фагоцитов). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования служили лейкоциты цельной крови людей и семи видов экспериментальных животных: мышей (белых беспородных, BALB/c, C57BL/6J, CBA), морских свинок, белых крыс, золотистых хомяков, кроликов, собак и лошадей. Кровь мышей и хомяков получали с помощью декапитации. У крыс ее выделяли из хвостовой вены, а у морских свинок и кроликов из ушной вены. Венозную кровь людей, собак и лошадей забирали общепринятыми способами. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в дозе 20 ЕД активности/ мл крови. Суправитальную окраску лейкоцитарных БГ проводили в крови с помощью красителя акридинового оранжевого (АО, Sigma, CША) по методу M.R. Melamed et. а! [15]: 0,05 мл крови добавляли к 1,5 мл раствора красителя ( 2 мкг АО/мл 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl) и тщательно перемешивали на вибрационной мешалке. Через 8 мин окраски при комнатной температуре красную флуоресценцию БГ (в области спектра более 600 нм) измеряли в отдельных лейкоцитах на импульсном проточном цитофлуориметре [9] со скоростью около 500 клеток в секунду при напряжении на фотоумножителе, равном 720 вольт. В каждом образце исследовали не менее 10 000 отдельных клеток. Использовали коммерческий проточный цитофлуориметр ICP 22 PHYWE (Германия) со ртутной лампой высокого давления в качестве источника света. Для автоматической сортировки клеток по исследуемому параметру (импульсов по амплитуде) и построения соответствующих гистограмм применяли 2048-канальный анализатор модели 2102 фирмы Ortho Instruments (США). Выбирали режим анализа, соответствующий 512 условным единицам измерения (каналам для входного сигнала). Для удобства сравнения результатов анализа лейкоцитов крови различных видов животных выбирали на гистограммах три диапазона условных единиц измерения, характерных по исследуемому параметру для трех типов лейкоцитов цельной крови человека [22]: лимфоцитов (каналы с 10 по 50), моноцитов (каналы с 51 по 100) и гранулоцитов (каналы со 101 по 512). В каждом из этих диапазонов подсчитывали в процентах долю зарегистрированных клеток с использованием курсора и специального интегрирующего устройства в анализаторе. Средние показатели содержания БГ на клетку рассчитывали в условных единицах (каналах) из значений максимумов пиков гистограмм и результаты обрабатывали статистически [9]. Кроме того, для определения суммарного количества различных типов цитоплазматических гранул в фагоцитах крови людей и лабораторных животных (мышей), чаще всего используемых при изучения чумного вакцинального и инфекционного процессов, применяли широко распространенный способ автоматического дифференцирования клеток по показателю степени гранулярности их цитоплазмы (по интенсивности бокового светорассеяния) [19]. В этом случае 0,1 мл крови смешивали с 2 мл лизирующего реагента фирмы Dako и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин до полного лизиса эритроцитов. Оставшиеся в плазме крови лейкоциты исследовали на лазерном проточном цитометре CyAn ADP фирмы DakoCytomation (Дания), используя 256 каналов (условных единиц изверения) для сортировки клеток по интенсивности светорассеяния и построения соответствующих гистограмм. РЕЗУЛЬТАТЫ Возможность автоматического дифференцирования лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов в образцах крови человека по показателю клеточной гранулярности наглядно иллюстрируют экспериментальные данные, представленные на рис.1 (А1, Б1). Гранулоциты крови (около 60% лейкоцитов в области R1 гистограммы Б1 - пик справа) содержат в три раза больше цитоплазматических гранул на клетку (максимум пика 126±2,4 у.е, P<0,001), чем моноциты (около 5% клеток; маленький пик в центре с максимумом 38±0,5). Доля лимфоцитов в крови людей составляла около 30%. Эти клетки с самым низким содержанием ципоплазмати-ческих гранул характеризовались относительно слабой интенсивностью светорассеяния и учитывались на цитограмме А1 в виде клеточной популяции слева, а также в виде пика слева на гистограмме Б1. В сравнении с результатом анализа лейкоцитов крови человека на рис. 1 представлены также данные, полученные при анализе лейкоцитов крови мышей линии ВАЬВ/с. Они свидетельствуют, что & 2 5SL*1 I Biwl \ %m\ 1 Tmd 10(731 КИ.Ш h.1 их т},»ч Рис.1 Результат сравнительного анализа цитоплазматических гранул в фагоцитах крови людей и мышей по показателю бокового светорассеяния (SS - side scatter). Представлен в виде двупараметрических цитограмм (люди - А1, мыши - А2) и однопараметрических гистограмм (люди - Б1, мыши - Б2). R1 - область гистограммы, где учитываются гранулоциты крови людей (около 60 % общего числа лейкоцитов) и мышей (около 30% клеток). FS (forward scatter) - это малоугловое светорассеяние, коррелирующее с клеточным размером. Л I I I ТоЩ UM3 ]«.W A 2 2Ж-1- 15ГЙ rH-1-1-1- 0 fi 1Л 133 3» nu I Hffgonl Cwtf|%-w| ~ Ш-J 10731 iWOfl Таблица 1. Относительное содержание в крови людей моноцитов и грану-лоцитов по данным двух методов проточно-цитометрического анализа Анализ по параметру прямоуглового светорассеяния (гранулярности) (n=12) Анализ путем окраски БГ красителем АО (n=30) Моноциты М+m, % Гранулоциты М+m, % Моноциты М+m, % Гранулоциты М+m, % 6,5+0,95 60,8+2,4 5,4+1,73 64,1+5,5 А 1 356 “1- I -fi -1-1-1а И 13JJ 152 35£ SSLH E I I RKfr- I | I | T<ftJ JTJB3 Ц03.ПЭ [U МЩ 53.2: в крови мышей фагоцитов вдвое меньше, чем в крови людей (пик справа в области R1 на гистограмме Б2, около 30% клеток). По суммарному содержанию гранул на клетку мышиные фагоциты крови четко отделялись от лимфоцитов, и по значению максимума фагоцитарного пика (гистограмма Б2 на рис. 1) можно было оценить средний показатель относительного содержания гранул в фагоцитах крови мышей (74+0,3 у.е.), чтобы сравнить мышиные фагоциты крови по данному показателю с моноцитами и гранулоцитами крови человека. Из гистограмм Б1 и Б2 рис.1 следует, что суммарное содержание различных типов гранул в грануло-цитах крови мышей вдвое выше, чем в моноцитах крови человека, но в 1, 7 раза ниже, чем в гранулоцитах крови людей. Высокая эффективность автоматического дифференцирования моноцитов и гранулоцитов, а также двух типов фагоцитов крови человека от лимфоцитов сохранялась, когда это дифференцирование проводили в образцах цельной крови. Причем, не по общему содержанию в клетках различных типов цитоплазматических гранул, а по количеству первичных (бакте- Примечание. P>0,05. (табл. 2). рицидных) гранул (рис. 2, табл. 1), ответственных за аккумуляцию в цитоплазме живых лейкоцитов крови молекул АО [9]. Путем измерения интенсивности красной флуоресценции БГ большого числа отдельных клеток в потоке нами были получены данные о дефиците БГ в моноцитах крови человека, подтверждаемые результатами биохимических исследований о дефиците в этих клетках лейкоцитарной эластазы Таблица 2. Дефицит аккумуляции АО в БГ моноцитов крови человека, коррелирующий с дефицитом содержания в этих клетках лейкоцитарной эластазы Содержание БГ в условных единицах измерения (каналах) Содержание эластазы в экстрактах цитоплазматических гранул (нг/10б клеток) Моноциты М±:ш, n=30 Гранулоциты М±:ш, n=30 Моноциты М±:ш, n=23 Гранулоциты М±:ш, n=23 89,0±4,32 198,0±8,4 69,04±7,0 Ш0,0±114,0 Примечание. Данные о содержании в клетках эластазы адаптированы из [11]. Из результатов, представленных на рис. 2, видно, что фагоциты крови мышей, имея достаточно большой общий запас гранул в цитоплазме, фактически не содержат БГ, способных аккумулировать молекулы красителя АО. Очень важно, что таких гранул в фагоцитах крови животных этого вида даже меньше, чем в моноцитах крови людей. Хотя доля фагоцитов в крови мышей BALB/c была около 30%, эти клетки Рис. 2 Различная степень дефицита БГ в фагоцитах крови высокочувствительных и относительно резистентных к чуме видов лабораторных животных в сравнении с показателем, характерным для грануло-цитов крови человека. По оси абсцисс - содержание БГ в усл. ед. интенсивности красной флуоресценции (каналах) от 0 до 512; по оси ординат - количество клеток (импульсов) на канал от 0 до 100. Пик слева на каждой гистограмме соответствует лимфоцитам крови; справа - фагоциты с низким содержанием БГ у лабораторных грызунов и высоким содержанием БГ у людей. Только у людей наблюдается четкое разделение моноцитов и гранулоцитов крови на гистограмме по исследуемому показателю. четко не отделялись по интенсивности красной флуоресценции БГ от лимфоцитов в виде отдельного пика на гистограмме. Лишь наиболее интенсивно окрашенные гранулоциты крови мышей (11,2% клеток) учитывались в области гистограммы, где у человека по интенсивности флуоресценции БГ обычно регистрируются моноциты. Аналогичные данные были получены нами при исследовании лейкоцитов в образцах цельной крови беспородных мышей и мышей других линий (табл. 3). Для высокочувствительных к чуме мышей был характерен самый высокий уровень видового дефицита БГ в фагоцитах крови, что подтверждают биохимические данные о самом высоком уровне дефицита активности эластазы именно в мышиных полиморфноядерных лейкоцитах (табл. 3). Фагоциты с высоким содержанием БГ, характерным для гранулоцитов крови человека, полностью отсутствовали в крови не только мышей, но и двух других видов грызу- Таблица 3. Доля фагоцитов с содержанием БГ, характерным для моноцитов и гранулоцитов крови человека, в образцах крови животных с различной видовой чувствительностью к экспериментальному подкожному заражению вирулентными чумными микробами (сравнение с усредненным биохимическим показателем содержания БГ в фагоцитах) Вид и количество исследованных животных (n) КР ИЗФ Распределение фагоцитов по интенсивности красной флуоресценции БГ (>600 нм) в области гистограммы, где учитываются моноциты# и гранулоциты## человека АЭ, % от 51 до 100 у. е.# от 101 до 512 у.е. ## Доля, % М±ш,у.е. Доля, % М+ш, у.е. Мыши беспородные (30) 0-2 <1 8,6+0,36 ? Мыши C57BL/6J (10) 0-2 <1 4,5+0,11 1,0* Мыши СВА (10) 0-2 <1 8,4+0,08 ? Мыши BALB/c (10) 0-2 <1 11,2+0,46 ? Золотистые хомяки (10) 0-2 <1 22,2+0,68 58,3+2,10 ? Морские свинки (20) 0-2 <1 43,2+2,30 86,0+2,12 17,5** Белые крысы (10) 3-5 >1 53,2+2,70 85,0+1,02 6,5+0,5 41** Кролики (8) 3-5 >1 61,4+3,42 97,0+3,70 11,4+1,75 33** Собаки (6) - ? 30,8+3,10 96,0+2,50 46,3+3,60 202+9,70 200** Лошади (6) - ? 32,2+0,88 96,5+1,37 20,4+2,60 490+14, 8 ? Люди (30) ? ? 5,4+1,73 89,0+4,32 64,1+5,50 198+8,40 100*, ** Примечание. По исследуемому показателю высокочувствительные, относительно резистентные и резистентные к чуме виды животных различаются с уровнем достоверности P<0,001. Доля клеток дается в % от обшего количества лейкоцитов в образцах крови. АЭ - активность эластазы в экстрактах гранул полиморфноядерных лейкоцитов исследуемого вида животного (в %) по отношению к принятому за 100% показателю у людей. При расчете использованы данные [23]* и [10]**. КР - коэффициент резистентности согласно [4]: 0 - 2 высокочувствительные, 3 - 5 относительно резистентные, - резистентные при заражении дозой 109 м. к. [7]. ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза чумных микробов в опытах с лейкоцитами крови in vitro согласно [ 4]: <1 - незавершенный, >1 - завершенный, ? - нет данных. М - среднее значение показателя интенсивности флуоресценции БГ, соответствующее максимуму фагоцитарного пика на гистограмме. В широком выбранном интервале ## у лошадей значение М в 2,5 раза выше, чем у людей и собак. нов (морских свинок и хомяков), отличающихся высокой чувствительностью к экспериментальному заражению чумой (табл. 3). Из характерных гистограмм было видно, что в фагоцитах крови морских свинок и хомяков содержится больше БГ, чем в фагоцитах крови мышей, но не больше, чем в моноцитах крови человека. Содержание аккумулирующих АО БГ в фагоцитах крови относительно резистентных к чуме белых крыс и кроликов выше, чем в фагоцитах крови высокочувствительных к чуме видов животных, что подтверждается биохимическими данными и согласуется с информацией о завершенности фагоцитоза чумного микроба in vitro полиморфноядерными лейкоцитами крови белых крыс и кроликов (табл. 3). Елетки врожденного иммунитета нечувствительных к экспериментальной чуме собак и лошадей отличались неоднородностью по исследуемому показателю. Доля гранулоцитов с высоким содержанием БГ была в крови этих видов животных вдвое больше, чем в крови относительно резистентных к чуме видов. Причем, только в крови абсолютно невосприимчивых к чуме лошадей одновременно присутствовали клетки врожденного иммунитета, содержание БГ в которых было как в 2,5 раза выше, так и ниже, чем в гранулоцитах крови человека. У нечувствительных к экспериментальной чуме собак в крови также отмечали наличие большого количества гранулоцитов с пониженным содержанием БГ (около 30%), наряду с клетками, не отличающимися по исследуемому показателю от гранулоцитов крови людей (табл. 3). ОБСУЖДЕНИЕ Данные, впервые полученные нами при сравнительном проточно-цитофлуо-риметрическом исследовании фагоцитов в образцах цельной крови высокочувствительных, относительно резистентных и резистентных к чуме видов животных, свидетельствуют о том, что БГ, несущие ферментные катионные белки (эластазу, катепсин G, протеазу 3 и миелопероксидазу), играют важную роль в защите организма от чумной инфекции, если речь идет об экспериментальном подкожном заражении животных чумными микробами из оптически плотных стационарных культур, выращенных при температуре 28°C. Метод проточной цитофлуориметрии открывает уникальные возможности для проведения дальнейших сравнительных исследований с клетками крови других видов животных, так как информация о бактерицидном потенциале фагоцитов может быть получена в этом случае очень быстро при полном сохранении клеточного состава крови, а также при полном исключении влияния на клетки каких-либо препаративных процедур. Используя данный подход, в условиях in vitro можно в динамике оценивать антибактериальное реагирование бактерицидных систем присутствующих в крови клеток врожденного иммунитета в зависимости от вида и биологических свойств возбудителя [8]. Хотя в гранулах фагоцитов крови присутствуют различные ферментные и неферментные катионные белки, принимающие участие в киллинге патогенных микроорганизмов, при изучении in vitro процесса дегрануляции выделенных из крови нейтрофилов ранее экспериментально было доказано, что интенсивность красной флуоресценци БГ, суправитально окрашенных красителем АО, является показателем, связанным строгой прямой корреляционной зависимостью с уровнем активности ^одержания) в клетках лейкоцитарной эластазы [9]. Результаты проведенного нами сравнительного проточно-цитофлуориметрического анализа подтверждают эту корреляцию на модели лейкоцитов цельной крови животных, различающихся по чувствительности к экспериментальной чумной инфекции. Видовая чувствительность животных к чуме зависит, таким образом, от уровня активности в фагоцитах крови лейкоцитарной эластазы. Это согласуется с выводами исследований Weinrauch Y. et al. [24], в которых установлено, что в составе гранул фагоцитов крови человека и животных именно эластаза является ключевым белком врожденной антибактериальной защиты, ответственным за быстрое избирательное расщепление факторов вирулентности иерсиний и других энтеробактерий [24]. Выявленная нами зависимость может иметь практическое значение, поскольку известно, что бактериальный белок не может быть протективным антигеном, если он быстро расщепляется лейкоцитарными протеазами [1]. Химическая противочумная вакцина на основе капсульного антигена чумного микроба эффективно защищает от чумы только мышей [3], вероятно, по той причине, что у мышей самый низкий видовой уровень активности эластазы в гранулах полиморфноядерных лейкоцитов. Для подтверждения этой гипотезы необходимы исследования, учитывающие выраженные видовые различия в состоянии БГ фагоцитов крови у людей и лабораторных животных. Если гипотеза верна, то существенное повышение иммунологической эффективности химических противочумных вакцин в опытах на других экспериментальных моделях сможет обеспечить включение в состав вакцинных препаратов специфических пролонгированных ингибиторов лейкоцитарной эластазы. В обезвреживании иерсиний важную роль играет не только фагоцитоз, но и механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофилов [2], реализуемый путем формирования внеклеточных нейтрофильных «ловушек» [12] и обеспечивающий наиболее эффективный киллинг патогенных бактерий в кровеносных сосудах при развитии бактериемии [14]. Формирование «ловушек» начинается с частичной дегрануляции нейтрофилов, с высвобождения эластазы из БГ в ядро эукариотической клетки, где фермент запускает процесс деконденсации ядерного хроматина [16]. Высокая степень неоднородности гранулоцитов крови собак и лошадей по исследуемому показателю, вероятно, отражает неспецифическую функциональную активацию (дегрануляцию) части клеток врожденного иммунитета у этих видов животных. У людей, в меньшей степени контактирующих с различными инфекционными агентами, высокая степень неоднородности гранулоцитов крови по содержанию БГ в норме отсутствует. Однако, как свидетельствуют результаты клинических исследований, выполненных с использованием выбранного в данной работе метода проточно-цитофлуориметрического анализа, эта неоднородность появляется в крови пациентов при инфекциях и может служить индикатором высокой степени функциональной мобилизации клеток первой линии врожденной антибактериальной защиты [15]. Для людей наиболее опасна первичная легочная чума, когда человек аэрогенно заражается от другого человека чумными микробами, находящимися in vivo в экспоненциальной фазе роста при температуре 37°C. В отличие от микробов из оптически плотных стационарных культур, выращенных при 28°C, такие микробы обладают устойчивостью к фагоцитозу [8], размножаются внеклеточно и на определенной стадии развития инфекционного процесса запускают массовую гибель клеток врожденного иммунитета по типу апоптоза путем секреции в их цитоплазму белков внешней мембраны (Yops), обладающих цитотоксическими свойствами [13]. Предполагают, что при чуме генерализация воспаления с очень быстрым развитием в организме тромбогеморрагических осложнений и полиорганной недостаточности - это результат функционирования патогенетического механизма, в основе которого лежит массовый аутолизис (вторичный некроз) апоптотических нейтрофилов, приводящий к высвобождению из этих клеток огромного количества белков острой фазы воспаления. Особую опасность представляет разрушительный протеолитический эффект на белки плазмы крови и структурные белки тканей организма хозяина высвобождаемой из лизированных клеток лейкоцитарной эластазы [17]. В отличие от мышей, люди обладают высокой чувствительностью к патогенному эффекту эндотоксина чумного микроба [3]. Объяснить это поможет, вероятно, тот факт, что от сериновых лейкоцитарных протеиназ (эла-стазы и катепсина G), локализованных в БГ нейтрофилов, зависит чувствительность животных к бактериальным эндотоксинам [20, 21]. Таким образом, необходимо изучение механизмов иммуногенеза и патогенеза чумы с учетом видовых различий в БГ нейтрофилов крови у людей и экспериментальных животных. Нельзя игнорировать тот факт, что по составу и субстратной специфичности лейкоцитарных протеиназ люди в значительно большей степени отличаются от мышей и других грызунов, чем от крупных млекопитающих [10], которые к экспериментальной чуме нечувствительны, но иногда болеют этой инфекцией в природных условиях.

About the authors

A. L Kravtsov

Russian Research Institute of Plague Control «Microb»

Saratov, Russia

References

Supplementary files