EVALUATION OF MODERN EPIZOOTIC ACTIVITY OF NATURAL TULAREMIA FOCI IN VORONEZH REGION USING IMMUNE-SEROLOGICAL AND MOLECULAR-GENETIC STUDY OF MAIN CARRIERS OF THE DISEASE

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Природные очаги туляремии широко распространены на территории Российской Федерации и имеются практически во всех 83 субъектах страны. Наиболее эпидемически активные природные очаги расположены в Центральной европейской части РФ, Западной Сибири и приурочены к водным экосистемам [Мещерякова И.С., 2010]. На территории Воронежской области основными источниками и носителями туляремии в природных очагах являются различные виды грызунов, а переносчиками - кровососущие двукрылые и клещи. Впервые трансмиссивную эпидемическую вспышку туляремии 1925 года в Воронежской области, описал М.Д.Дедерер [3]. В дальнейшем с 1934 по 40-е годы прошлого века эпидемические вспышки туляремии промыслового и водного типов постоянно регистрировали в различных районах области и Воронеже, они были приурочены к поймам рек Дон, Хопер и их притокам и связаны с промыслом водяной полевки [5]. Начиная со второй половины сороковых годов в стране, в том числе в Воронежской области, начинается массовая вакцинация населения живой ту-ляремийной вакциной [9], что приводит к резкому снижению заболеваемости этой инфекцией и доведению ее до спорадических случаев. Так, за период с 1970 по 2013 годы в области было зарегистрировано всего 78 случаев туляремии. Между тем, природные очаги туляремии в Воронежской области втечение длительного времени проявляют свою эпизоотическую и эпидемическую активность - из 32 муниципальных районов 26, а также город Воронеж являются энзоотичными по туляремии. Для оценки эпизоотической активности очагов туляремии в настоящее время и выявления вероятного инфицирования биологических объектов (мелкие млекопитающие, насекомые, клещи и др.) возбудителем используют бактериологический, а когда это невозможно, иммуно-серологические и молекулярнобиологические методы исследования, направленные на обнаружение антигена или ДНК возбудителя туляремии [1, 4, 7, 11 - 16]. В 2010 году выявлен антиген возбудителя туляремии у мелких млекопитающих (ММ) и клещей, добытых в 10 районах области, в 2012 году инфицированные возбудителем туляремии ММ были обнаружены в 12 районах области. В 2013 году антиген F.tularensis обнаружен в 9 районах области в пробах грызунов, погадок хищных птиц, клещей, мошек. Цель исследования - совершенствование мониторинга и прогноза эпидемического проявления природных очагов энзоотичной по туляремии Воронежской области на основе современных биотехнологичных методов одновременной комплексной лабораторной диагностики. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Сбор материала проводили в летний период 2011 года в четырех энзоотичных по туляремии районах северо-восточной части Воронежской области: Аннинском, Верхнехавском, Панинском и Эртильском, расположенных в лесостепной зоне на юге Окско-Донской равнины. На территории районов хорошо развита разветвленная речная система. В результате учетов было отловлено 539 особей мелких млекопитающих. Грызунов собирали из ловушек в утренние часы в первой половине дня, замораживали (-20°С), транспортировали в лабораторию с соблюдением холодовой цепи. Перед вскрытием размораживали. Далее материал транспортировали с соблюдением холодовой цепи. Для выявления инфицированных ММ возбудителем туляремии у отловленных животных отбирали паренхиматозные органы: селезенку и(или) печень. Собранный материал помещали индивидуально в пробирки и хранили при -20°С. Видовой состав ММ представлен в табл. Выявлен антиген, ДНК F.tularensis Всего выявлено: Вид млекопитающего и антиген (РПГА) ДНК (ПЦР-РВ) антиген + ДНК Ftularensis и % титры в РПГА и % и % Органы животных подвергали комплексному исследованию с помощью иммуно-серологического (поиски антигена F.tularensis) и молекулярнобиологического (выявление ДНК F.tularensis) методов. Туляремийный антиген у ММ выявляли с помощью РПГА. Для выявления ДНК возбудителя туляремии применяли метод ПЦР-РВ. Исследуемые паренхиматозные органы ММ гомогенизировали в фарфоровых ступках с использованием раствора 0,9% хлорида натрия, содержащего мертиолят натрия в конечной концентрации 0,01% (1:10000). Соотношение гомогенизируемого органа и указанного раствора было в зависимости от веса органа от 1:3 до 1:15. Гомогенизат для иммунологической реакции прогревали при температуре 56°С в течение 30 мин, далее определяли туляремийный антиген с помощью РПГА с эритроцитарным туляремийным иммуноглобулиновым диагностикумом (набор «РНГА-Тул-СтавНИПЧИ», Россия). Чувствительность набора РПГА (сер. 6-11 ЭКСП-ПР) составляла ~106 м.к./мл. Для определения ДНК 100 мкл гомогенизата переносили в готовый реагент набора «Проба Рапид» (окончательное разведение - 1:6), далее - по инструкции производителя (ДНК-Технология, Россия). ДНК-мишенями служили: участок ISFtu2 - элементно-подобный вставки в геноме F.tularensis и ген tul4 (1риА), кодирующий иммуногенный эпитоп белка м.м. 17 кД наружной мембраны. В состав амплификационных смесей включены видоспецифические праймеры и зонды: ISFTU2F/R и ISFTu2P [14]; Tul4GF/R [2]; зонд tul4-PR2 (FAM) ctccagaaggttctaagtgccatgat-(RTQ1) подобран совместно с сотрудниками НПФ «Синтол». ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 5 мкл ДНК образца [2]. Концентрация каждого праймера была 12 pM, флуоресцентной пробы - 6 pM. ПЦР-РВ проводили в приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия): I цикл - 94° - 5 мин, II - (94° - 30 сек, 60° - 60 сек) х 45 циклов. После амплификации проводили плавление в диапазоне между 68 и 95°С с повышением температуры в 1°С и удержанием на каждом шаге 5 сек. Детекцию полученных фрагментов ДНК осуществляли гибридизационно-флуоресцентным методом по каналу Green. Результаты анализировали, используя программу Rotor-Gene 6000 (версия 1.8.17.5), специфичность амплификационного продукта определяли по кинетическим кривым плавления. Отрицательным контролем служили: пробы без ДНК-матрицы - дистиллированная вода и раствор 0,9% хлорида натрия с мертиолятом натрия (0,01%). Положительным контролем были пробы, содержащие ДНК-матрицу F.tularensis (штамм 503). Предварительно была установлена чувствительность ПЦР-РВ по Обыкновенная полевка Восточноевропейская полевка 235 16 6,8 Рыжая полевка 25 0 0 Водяная полевка 2 0 0 Полевая мышь 71 5 7 Малая лесная мышь 75 3 4 Желтогорлая мышь 86 2 2,3 Домовая мышь 20 1 5 Серый хомячок 11 0 0 Лесная соня 2 0 0 Бурозубки разных видов 12 0 0 Итого 539 27 5+1,84 1:08-1:240 35 14,9 42 17,9+4,90 0 3 12 3 12+12,74 0 0 0 0 0 1:10-1:120 13 18,3 15 21,1+9,49 1:15-1:40 9 12 11 14,7+8,01 1:16-1:20 7 8,1 7 8,1+5,77 1:32 1 5 2 10+13,15 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 16,7 2 16,7+21,10 1:08-1:240 70 13+2,84 82 15,2+3,03 ДНК-копиям, эквивалентным 3,9х102 КОЕ/мл. Выявление ДНК F.tularensis в исследуемых образцах осуществляли по tul4 мишени, а затем по ISFTu2 мишени для подтверждения первичных результатов. Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ STATISTICA 6.0 и общепринятые биометрические методы. Данные считали достоверными при превышении 95% уровня значимости (p<0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ Комплексное иммуно-серологическое и молекулярно-биологическое исследование позволило выявить эпизоотическую активность природных очагов туляремии на обследуемой территории. В 82 ММ (15,2%) были обнаружены антиген и/или ДНК F.tularensis (табл.). Антиген возбудителя туляремии выявлен в 27 (5,0%) образцах, а специфические фрагменты ДНК обнаружены у 70 (13,3%) ММ. Одновременно в обеих реакциях возбудитель туляремии установлен у 15 (2,7%) ММ. Использование ПЦР-РВ позволило дополнительно выявить 55 (10,2%) проб с относительно малым содержанием субстрата ДНК F.tularensis в тех случаях, когда антиген в пробах обнаружен не был. Высокую чувствительность и специфичность метода ПЦР-РВ обеспечило включение в реакцию специфических зондов (tul4-PR2 и ISFTu2P). Полученные данные позволяют оценить эффективность сочетанного применения различных методов выявления F.tularensis и диагностическую ценность каждого метода. Так, иммуно-серологический метод РПГА, отличаясь простотой исполнения и скоростью получения ответа, позволяет выявить антиген при концентрации не менее 1х105 КОЕ/мл [4], тогда как ПЦР-РВ дает возможность выявить единичные копии ДНК, что особенно важно при малых концентрациях возбудителя в материале. Использование меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб (или зондов), комплементарных участку PCR-продукта, позволяет увеличить специфичность реакции. Вместе с тем, известно, что антиген F.tularensis длительно сохраняется в биологических объектах, что облегчает их доставку и хранение, тогда как ДНК подвержена разложению или деградации при несоблюдении температурного режима транспортировки и хранения. С учетом вероятности деградации ДНК и малого количества субстрата в пробах возникает необходимость подбора праймеров к ДНК-мишени и соответствующих комплиментарных зондов, увеличивающих чувствительность и специфичность ПЦР-РВ. В этой связи, наиболее оптимальным и эффективным для анализа биологических объектов является комплексное исследование, направленное на поиск как антигена, так и ДНК F.tularensis. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные результаты свидетельствуют о функционировании и эпизоотической активности природных очагов туляремии на анализируемой территории в настоящее время. Это подтверждают последние данные других авторов [10], обнаруживших инфицированных возбудителем туляремии ММ в 12 районах области, в том числе и в четырех обследуемых нами районах Воронежской области. При этом заболеваемость туляремией остается на спорадическом уровне (исключение 2005 год, когда была зарегистрирована трансмиссивная эпидемическая вспышка туляремии в Центральном Федеральном округе РФ, охватившая более 700 человек, из которых 35 случаев были зарегистрированы в Воронежской области [Никифоров В.В., Кареткина Г.Н., 2007; Мещерякова И.С., 2010]. Заболевания были связаны с укусами слепней и комаров в августе и сентябре - период активизации природных очагов туляремии пойменно-болотного типа. Последний случай туляремии в Воронежской области зарегистрирован в 2011 году, заражение произошло в результате укуса слепня, а клинико-эпидемиологический диагноз подтвержден лабораторными методами. Относительно спокойная эпидемическая ситуация поддерживается своевременными мерами профилактики, в первую очередь, вакцинацией населения высокоэффективной туляремийной вакциной. В настоящее время иммунизация остается самым надежным способом профилактики туляремии, однако в последние годы наметилась тенденция сокращения числа вакцинированных и ревакцинированных лиц против туляремийной инфекции. Использование биотехнологичных методов лабораторного анализа материала при мониторинге природных очагов, а также методов диагностики и профилактики туляремии обеспечат своевременное выявление угрозы эпидемической опасности, а адекватные меры профилактики позволят избежать эпидемических осложнений. В целях повышения качества и эффективности эпизоотологическо-го и эпидемиологического мониторинга природных очагов, в том числе выявления возбудителя туляремии как во время эпизоотии, так и в межэпизоотический период, рекомендуется использование наиболее эффективного метода выявления возбудителя туляремии - ПЦР-РВ. Для предотвращения эпидемических вспышек туляремии необходимо осуществлять плановую вакцинацию населения, проживающего на территории природного очага туляремии, и контроль за состоянием иммунного статуса населения в соответствии с [8]: уровень иммунной прослойки в очагах туляремии лугополевого типа должен быть не ниже 70%, а в пойменно-болотных очагах - не ниже 90%. Необходимо проводить ежегодный посезонный эпизоотологический мониторинг территории природных очагов туляремии с учетом их типологии и активности паразитарной системы с прогнозом эпизоотической и эпидемиологической ситуации по туляремии в соответствии с [4] и [6].

About the authors

I. S Mescheryakova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

D. V Trankvilevsky

Federal Centre of Hygiene and Epidemiology

Moscow, Russia

D. A Kvasov

Centre of Hygiene and Epidemiology in Voronezh region

Voronezh, Russia

T. V Mikhailova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

M. I Kormilitsyna

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

T. N Demidova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

Yu. I Stepkin

Centre of Hygiene and Epidemiology in Voronezh region

Voronezh, Russia

V. I Zhukov

Federal Centre of Hygiene and Epidemiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files