PERSISTENCE OF BORDETELLA PERTUSSIS BACTERIA AND A POSSIBLE MECHANISM OF ITS FORMATION

Full Text

Коклюш - антропонозное респираторное инфекционное заболевание, вызываемое грамо-трицательными бактериями Bordetella pertussis, характеризующееся приступообразным судорожным кашлем и высокой летальностью у детей раннего возраста. Бактерии B. pertussis не обнаружены у животных или во внешней среде, хотя способны к переживанию на неживой поверхности в течение нескольких суток [20]. Считается, что возбудитель коклюша передается от человека к человеку исключительно воздушно-капельным способом. Мало что известно о состоянии бактерий в аэрозоле и во внешней среде. Некоторые исследователи [Urbiztondo L. et al., 2014] считают, что в процессе трансмиссии бактерии находятся в промежуточном фазовом состоянии (Bvgi), характеризующемся сниженной экспрессией основных адгезинов и факторов вирулентности. Обсуждается роль и механизмы формирования биопленок в патогенезе бордетеллезов и выживании бактерий [11]. Особенностью эпидемиологии современного коклюша является распространенность атипичных форм и изменение клинической картины заболевания, что затрудняет диагностику коклюша и определение критериев для его выявления. В разных странах при постановке диагноза «коклюш» используют определенный набор клинических симптомов, отражающих развитие заболевания и его лабораторное подтверждение. Золотым стандартом лабораторной диагностики коклюша является исследование материала назофарингеальных мазков бактериологическим методом. Однако чувствительность этого метода не превышает 50%, а в большинстве случаев составляет 20 - 30%. Низкая эффективность бактериологической диагностики, приводит к гиподиагностике коклюша. Несмотря на проводимую в разных странах с начала 1950-х годов прошлого столетия массовую противококлюшную вакцинацию, элиминации возбудителя среди населения не происходит. Ежегодно в мире регистрируется более 48,5 млн случаев заболевания разной степени тяжести, из которых около 300 000 заканчивается летальным исходом [22]. В последние годы отмечается значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев коклюша среди подростков и взрослых [22, 33, 34], распространение стертых форм заболевания, выявлено бессимптомное носительство бактерий B. pertussis [2, 32, 34]. В США с охватом детей прививками близким к 95% с начала 2000-х годов отмечен значительный рост регистрации коклюша, приближающийся к довакцинному периоду [10, 24]. Растет заболеваемость в Италии и Англии [15, 17]. Именно в эти сроки в этих странах начато массовое использование для вакцинации бесклеточных коклюшных вакцин. Вакцинация бесклеточными коклюшными вакцинами (БКВ) приводит к снижению остроты течения заболевания, но не обеспечивает противобактерийного иммунитета [15, 17, 18, 30]. Не исключено, что именно БКВ является причиной роста числа стертых форм коклюша, бессимптомных носителей инфекции и заболеваемости взрослых и подростков, являющихся источником инфекции для неиммунных младенцев [22, 32 - 34]. Следует особо отметить, что в 85 - 95% случаев заражение младенцев происходит в семье от инфицированных взрослых, в ряде случаев от бессимптомных носителей инфекции [22, 32 - 34]. Длительное использование одних и тех же корпускулярных коклюшных вакцин (ККВ) привело к смене генотипов циркулирующих бактерий B. pertussis. Показано значительное уменьшение доли бактерий с довакцинными генотипами и их замена на бактерии новых генотипов, содержащих точечные мутации в генах ptx, prn, fim и fga [6, 21]. Использование БКВ сопровождалось быстрым нарастанием популяции B.pertussis, содержащих нокаутные мутации в гене prn, кодирующем пертактин - компонент бесклеточной коклюшной вакцины [23]. Считается, что смена генотипов циркулирующих штаммов B. pertussis является одной из причин недостаточной эффективности современных противококлюшных вакцин и нарастания заболеваемости коклюшем в мире. Эти же причины могут вызывать, по-видимому, увеличение числа бессимптомных носителей возбудителя. До недавнего времени бактерионосительство при коклюше считали краткосрочным, однако такой подход к определению сроков персистенции бактерий B. pertussis возможно объяснить отсутствием чувствительных и эффективных методов выявления возбудителя, особенно на поздних стадиях заболевания. Использование молекулярно-биологических методов заставило пересмотреть это представление. Методом ПЦР возбудитель коклюша может быть зарегистрирован в носоглотке спустя 30 дней и позже после начала лечения больного, в то время как бактериологическим методом бактерии не выявляли. Нами показано, что у 7 - 10% практически здоровых детей в детском саду и у более, чем 80% практически здоровых детей и взрослых, контактировавших с больным коклюшем, регистрируется ДНК B.pertussis [2]. Формируется ли бактерионосительство в результате перенесенной инфекции или человек может оставаться практически здоровым, получив возбудитель со сниженной вирулентностью, остается не выясненным. Не изучены механизмы формирования бактерионосительства, вирулентности персистирующих бактерий, не определена их локализация в организме. По аналогии с внутриклеточными паразитами, можно предположить, что бактерии B. pertussis способны переживать внутри эукариотических клеток, на что указывает, например, ТЫ тип клеточного ответа организма на коклюшную инфекцию, характерный для внутриклеточных возбудителей [13, 18]. Персистенция бактерий рода Bordetella в клетках эукариот. В конце 90-х начале 2000-х годов проводились многочисленные исследования инвазии бактерий B. pertussis и их близких родственников B. parapertussis и B. bronchiseptica внутрь эукариотических клеток. В различных экспериментах установлено, что бактерии B. pertussis проникают и выживают в клетках HeLa, Hep-2, макрофагах, полиморфноядерных лейкоцитах человека (PMN) [8]. Продемонстрирована инвазия бактерий B. bronchiseptica в дендритные, эпителиальные клетки, клетки HeLa и макрофаги [19, 26]. Переживание в макрофагах клеток В. bronchiseptica носит устойчивый характер [7]. Отдельным вопросом является изучения условий, необходимых для проникновения и выживания бактерий в эукариотических клетках. Для проникновения бактерий в эукариотическую клетку они должны синтезировать, по крайней мере, некоторые адгезины [8, 31]. Для выживания в эукариотической клетке бактерия должна синтезировать факторы, препятствующие фагоцитозу, и не должна синтезировать токсины, снижающие жизнеспособность эукариотической клетки-хозяина и усиливающие ее апоптоз. Изучение выживаемости различных мутантов бактерий рода Bordetella в эукариотических клетках показало, что проникновение и внутриклеточное выживание B. pertussisя вляется bvg-зависимым процессом и Вvg мутанты значительно менее инвазивны для многих эукариотических клеток, чем вирулентные бактерии [22]. В ряде работ аденилатциклазный токсин B. pertussis был охарактеризован как фактор, препятствующий фагоцитозу бактерий макрофагами [8, 31] и усиливающий инвазию в клетки HeLa и НТЕ. Обсуждалось ингибирование внутриклеточными бактериями В. рertussis процесса слияния фагосома-лизосома, предотвращающего их убийство макрофагами [8]. С другой стороны, приводятся факты участия АЦ в индукции апоптоза клеток макрофагов [12]. Чтобы разрешить противоречие между необходимостью синтезировать внутриклеточную АЦ и адге-зинов для сохранения способности бактерий к персистенции и индуцируемым АЦ апоптозом, нужно допустить возможность регуляции продукции АЦ и, вероятно, других факторов патогенности внутриклеточными бактериями. Представленные результаты позволяют утверждать, что бактерии рода ВordeteИa способны персистировать в различных эукариотических клетках, длительность персистенции В. рertussis зависит от типа клеток, экспрессии генов вирулентности, а также других пока не идентифицированных генов. Гйпотетический механизм перехода бактерий в состояние вирулентности. Экспрессия абсолютного большинства детерминант вирулентности B.pertussis контролируется опероном bvgАS [9, 22]. Нарушение структуры оперона bvgAS сопровождается изменением фазового состояния бактерий B. pertussis. Проведенные нами и другими авторами исследования показали, что перемещение мобильных генетических элементов (IS-элементов) в специфические сайты оперона bvgAS,гена prn и, возможно, других генов вирулентности индуцирует переход бактерий в различные фазовые состояния [23, 31]. Эти результаты позволили нам предложить гипотезу о формировании персистирующих бактерий возбудителя коклюша в результате обратимой интеграции IS-элементов в специфические сайты оперона bvgAS и других генов вирулентности. Исходя из высказанной гипотезы, следовало ожидать, что у больных с разной тяжестью и на разных стадиях инфекции и практически здоровых бактерионосителей популяции бактерий B. pertussis могут содержать различное число авирулентных инсерционных Вvg мутантов. Для проверки этого предположения было проведено два типа исследований: изучение молекулярной структуры генов вирулентности в популяции бактерий у больных коклюшем на разных стадиях, с разной картиной заболевания и изучение динамики изменения структуры популяции бактерий в развитии инфекционного процесса. Для регистрации ДНК B.pertussis и инсерционных мутантов нами разработана тест-система ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), основной принцип работы которой описан ранее [3, 25]. Эти же работы содержат подробное описание методов исследования. Выявление ДНКB. pertussis и изучение молекулярной структуры генов вирулентности в популяции бактерий у больных коклюшем на разных стадиях и с разной картиной заболевания [2, 3]. Методом ПЦР-РВ проведено исследование образцов, смывов назофарингеальных тампонов, взятых от 261 человека - 32 ребенка с предположительным диагнозом ОРЗ, 106 детей и взрослых с симптомом длительный кашель, 34 ребенка и взрослых с предварительным диагнозом коклюш и 82 практически здоровых ребенка. Среди обследованных были 9 практически здоровых взрослых, контактировавших с больными детьми. ДНК возбудителя коклюша выявлена в 50,3% образцов от детей с клиническим диагнозом ОРЗ, в 31% образцов от длительно кашляющих детей, в 94,1% - от детей с клиническим диагнозом коклюш и в 7,3% образцов от практически здоровых детей. Особый интерес вызывает обнаружение ДНК B.pertussis у 7 из 9 (78%) практически здоровых взрослых членов семей, контактировавших с больными детьми [2]. Борисовой О.Ю. ДНК B.pertussis обнаружена у 26 обследованных родственников детей больных коклюшем, находящихся в стационаре Первой инфекционной больницы г. Москва, 16 их которых на момент обследования были практически здоровы. Эти результаты подтверждают вывод о большой роли внутрисемейного заражения в эпидемиологии коклюша [22, 32 - 34]. Присутствие возбудителя коклюша у практически здоровых детей и взрослых, а также у персонала учебных заведений и детских лечебных учреждений [2, 3, 27, 32] указывает на персистенцию возбудителя коклюша у людей, не имеющих клинических проявлений коклюша. Представители этих групп являются источником бактерий B. pertussis для наиболее восприимчивых к коклюшной инфекции - детей младшего возраста [22, 32 - 34]. Молекулярная структура генов вирулентности в популяции бактерий проанализирована у больных коклюшем на разных стадиях и с разной картиной заболевания [2, 3]. Для анализа с помощью ПЦР-РВ нами использованы препараты, полученные от детей и взрослых с диагнозом коклюш, группы обследованных с диагнозом ОРЗ или длительный кашель, от практически здоровых взрослых и детей, контактировавших с пациентами первой группы. Все пациенты первой группы имели характерную клиническую картину коклюша, у них обнаружено наибольшее количество копий ДНК B^ertussis (геном-эквивалентов), составляющее 106 молекул в 5 мкл образца. Во всех случаях при первичном анализе относительное количество инсерций IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS хромосомы бактерий B. рertussis (N48i и^оо2), определенное с помощью ПЦР-РВ, не превышало 5х10-5. Количество ДНК возбудителя коклюша у пациентов второй группы колебалось от 103 до 104, а значение параметра N481 достигало значений 10-2 - 10-3. Характерной чертой третьей группы пациентов являлась высокая доля бактерий, содержащих инсерцию IS481 в cctagg сайте оперона bvgAS. Общее количество бактерий в 5 мкл препарата колебалось от нескольких десятков до трех сотен. Проведенные исследования показали, что популяции бактерий возбудителя коклюша, обнаруженных во всех клинических образцах, гетерогенны и содержат бактерии с нативной структурой оперона вирулентности bvgAS и инсерционные мутанты, несущие К481или IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS. Структура популяции и количество бактерий у больных с клинической картиной коклюша значительно отличается от пациентов с диагнозом ОРЗ и от практически здоровых людей. Образцы, полученные от больных с типичной картиной коклюша, содержат значительно больше ДНК B. pertussis, чем образцы со стертой симптоматикой ОРЗ или образцы от здоровых людей, находящихся в контакте с больными. Подавляющее большинство бактерий возбудителя, идентифицированных у больных коклюшем, находятся в вирулентном состоянии, тогда как у больных с атипичным течением заболевания и практически здоровых бактерионосителей частота выявления инсерционных Вvg мутантов значительно выше и достигает десятков процентов от общего числа бактерий в популяции. Провести статистически достоверный анализ динамики изменения структуры бактериальной популяции в развитии инфекции нам не удалось. Однако повторное обследование двух пациентов с диагнозом коклюш спустя 3 недели выявило увеличение числа авирулентных инсерционных Вvg мутантов от значений 10-5 - 10-4 до десятков процентов, а в одном случаи, наоборот, у пациента с длительным кашлем через 6 недель после первичного обследования зарегистрированы выраженные симптомы коклюша и значительное уменьшение от 50% до 0,1 - 0,01% числа инсерционных Вvg мутантов. Первый пример указывает на накопление инсерционных мутантов в процессе заболевания, а второй - на возможность исключения IS-элемента и восстановление нативной структуры оперона bvgAS и развития заболевания. Изучение динамики изменения популяции бактерий B. pertussis с развитием коклюшной инфекции было проведено на экспериментальных моделях лабораторных животных [1, 4]. Выявление ДНКB. pertussis и изучение молекулярной структуры генов вирулентности в популяции бактерий у инфицированных экспериментальных животных. Несмотря на то, что мыши не болеют коклюшем и не являются адекватной для человека экспериментальной моделью, на сегодняшний день «мышиная модель» используется для изучения некоторых характеристик инфекционного процесса и оценки качества коклюшных вакцин [5]. Важным преимуществом лабораторных мышей является возможность стандартизации эксперимента и использования для выделения ДНК ткани целого легкого. Лабораторных мышей инфицировали интраназаль-но вирулентными бактериями B. pertussis. Популяции персистирующих бактерий анализировали методом ПЦР-РВ в препаратах ДНК, выделенных из гомогенатов легких животных [4]. Максимальное количество геном-эквивалентов (ГЭ) B. pertussis было зарегистрировано в легких инфицированных мышей на 7 - 14 день, а затем снижалось с течением времени наблюдения. ДНК B.pertussis выявляли в образцах до конца срока наблюдения - 63 дня после заражения. Через 2 и 24 часа после инфекции в легких обнаружено от нескольких десятков до нескольких сотен ГЭ, а у четырех мышей около 105 - 106 ГЭ B. pertussis в 5 мкл образца. Количество интеграций IS481 и IS1002 в опероне bvgAS в трех из четырех препаратов с максимальным количеством ДНК не превышало единичных значений, а в одном не зарегистрировано совсем. Эти результаты позволяют считать, что популяция возбудителя в первые часы после инфицирования животных сохраняет гомогенность и также, как популяция бактерий B. pertussis, выращенных на среде КУА, содержит не более 10-5 инсерционных Вvg мутантов от общего числа бактерий [25]. Относительное число авирулентных бактерий в анализируемой популяции существенно нарастает, начиная с 7 - 14 дня после заражения мышей, и в среднем достигает 50% от общего объема бактериальной популяции к концу срока наблюдения. Обезьяны являются наиболее близкой и перспективной моделью для изучения заболеваний человека. Воспроизведение ряда признаков коклюша у обезьян наблюдали у тайваньских макаков, макаков резус, павианов анубис, а также в наших исследованиях на макаках резус, японских и яванских макаках и павианах гамадрилов при их экспериментальном заражении вирулентными коклюшными бактериями [1, 28 - 30]. Описана вспышка спонтанного коклюша у высших человекообразных обезьян - шимпанзе и горилл [16]. В нашем исследовании использовались половозрелые макаки резус в возрасте 3 - 6 лет. Животных интраназально заражали вирулентными бактериями. Экспериментальные методы описаны в [1 - 4]. Количество выявленных ГЭ B.pertussis 475 достигает максимума спустя 7 - 14 дней, что совпадает со значением tmax, приведенным в работе американских авторов при инфицировании 7 - 9-месячных павианов анубис вирулентными бактериями B. pertussis D420 [28]. После повторной экспериментальной инфекция обезьян бактериями B. pertussis 475 в носоглотке регистрируется значительно меньше бактерий, чем при первой инфекции, и сокращается максимальный период их выявления. С помощью ПЦР-РВ к 28 дню после повторной инфекции удавалось регистрировать только единичные ГЭ B. pertussis, тогда как в эти же сроки после первой инфекции число ГЭ могло составлять несколько десятков. Срок регистрации ДНК возбудителя при первом заражении может достигать 2 - 3 месяцев [1]. В препаратах, выделенных из смывов назофарингеальных тампонов через час после введения животным бактериальной суспензии, содержащих от 104 - 105 ГЭ B. pertussis в 5 мкл образца, количество интеграций IS481 в оперон BvgAS не превышало нескольких копий или не регистрировалось. Эти результаты позволяют считать, что сразу после экспериментального инфицирования популяция бактерий в носоглотке содержит не более 10-5 - 10-4 инсерционных Вvg■ мутантов. Аналогичные результаты получены при анализе бактериальных популяций у лабораторных мышей и больных с типичной формой коклюша. Число регистрируемых ГЭ B. pertussis падает к 28 дню до десятков и единиц при первичной инфекции и до единиц при повторном инфицировании животных. Чувствительность разработанной нами тест-системы составляет одну копию для определения количества ГЭ B. pertussis и не превышает 5 - 10 копий в 5 мкл образца для определения событий интеграции IS481 [3]. Таким образом, измерение значений N 48i с приемлемой ошибкой, даже если оно совпадает с числом геном-эквивалентов, возможно только в течение первых двух- трех недель наблюдения. Для регистрации событий интеграции в образцах, содержащих одну-две копии искомой мишени, нами разработан метод nested-ПЦР. Nested-ПЦР проводили с использованием двух последовательных реакций амплификации с праймерами SF- Bp2 и SF- Bp111. Праймеры второй пары расположены внутри последовательности, фланкированной праймерами SF- Bp2, по обе стороны от сайта CCTAGG - предполагаемой интеграции IS481 в оперон bvgAS [2 - 4]. Продукт второй ПЦР регистрировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Использование nested-ПЦР позволило зарегистрировать положительный сигнал амплификации 0,1 - 1 копию плазмиды рК481, содержащей клонированный фрагмент SF- Bp2 [3], что обеспечивает приемлемую чувствительность для регистрации событий интеграции в образцах, содержащих несколько геном-эквивалентов хромосомы B. pertussis. Анализ ДНК с помощью nested- и РВ-ПЦР показал, что при первом заражении животных бактериями B. pertussis 475 интеграции зарегистрированы только с помощью nested-ПЦР у трех обезьян на 65 день. При повторном заражении уже на 10 день инфекции число инсерционных мутантов в популяции составляло 1 на 100 бактерий, а спустя 3 месяца у 6 из 9 обезьян методом nested-ПЦР удавалось зарегистрировать наличие бактерий B. pertussis, содержащих инсерцию IS481 в опероне bvgAS. Секвенирование нескольких продуктов nested-ПЦР доказало, что в экспериментах с лабораторными мышами и обезьянами регистрируемые продукты ПЦР действительно представляли собой структуры, сформированные в результате интеграции IS-элементов в TCtagg сайт оперона bvgAS [4]. Последовательности всех секвенированных продуктов амплификации идентичны друг другу и ожидаемой последовательности, сформированной в результате интеграции IS481 [4, 25]. Таким образом, было установлено, что бактерии B. pertussis сохраняются в организме лабораторных животных, по крайней мере, в течение 2 месяцев с постепенным снижением их количества. В первые часы после инфекции подавляющее большинство бактерий возбудителя коклюша находится в вирулентном состоянии, характеризующемся нативной структурой оперона bvgAS. В процессе развития инфекции возрастает степень гетерогенности популяции бактерий B. pertussis за счет увеличения доли авирулентных мутантов возбудителя коклюша, несущих инсерцию одного из IS-элементов в опероне bvgAS B. pertussis, количество которых может достигать 50% от общего числа бактерий в популяции. Увеличение доли инсерционных мутантов в популяции бактерий B. pertussis в носоглотке экспериментально инфицированных обезьян и легких лабораторных мышей согласуется с результатами описанных выше единичных наблюдений на разных стадиях заболевания больных коклюшем. Инсерционные мутанты накапливаются, вероятно, быстрее при повторном контакте организма с возбудителем коклюша. Инсерционные Ргп мутанты составляют значительную часть из упомянутых выше Ргп мутантов, обнаруженных в популяциях бактерий B. pertussis, циркулирующих в настоящее время во многих странах, использующих для профилактики БКВ [23]. Следовательно, гены рт также являются мишенью для IS-индуцированной инактивации, закрепление которой может быть выгодно для выживания бактерии в данном хозяине или для ее сохранения в изменяющихся условиях внешней среды. Результаты изучения IS-индуцированной инактивации генов делают актуальным дальнейшее исследование гетерогенности популяций бактерий возбудителя коклюша в организме больных и бактерионосителей, используя для анализа другие гены вирулентности B. pertussis. Результаты изучения эпидемиологии коклюша, выявление возбудителя у практически здоровых людей, регистрация ДНК B. pertussis в носоглотке перенесших коклюш людей и экспериментально инфицированных животных в течение двух и более месяцев доказывает возможность длительной персистенции возбудителя коклюша в организме. Снижение вирулентности бактерий в результате инсерционной инактивации одного или нескольких генов вирулентности может обеспечить длительную персистенцию бактерий в организме хозяина и формирование практически здоровых носителей инфекции. Дальнейшие исследования механизмов формирования персистирующих бактерий, изучение факторов, влияющих на частоту транспозиции IS-элементов, на разных стадиях заболевания, наблюдение за практически здоровыми детьми и взрослыми, находящимися в контакте с больными, могут сформулировать новые подходы к профилактике коклюша и привести к созданию принципиально новых лекарственных препаратов, предотвращающих возможность развития пер-систенции. Авторы выражают признательность за помощь в работе сотрудникам НИИ экспериментальной патологии и терапии (Абхазия) З.В.Шевцовой, А.З.Матуа, Д.Т.Кубрава, И.Г.Конджария; сотруднику МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского О.Г.Борисовой; сотрудникам ФНИЦЭМ им. H. Ф.Гамалеи Ю.П.Румянцевой, О.Л.Ворониной, М.С.Кунда.

About the authors

G. I Karataev

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

L. N Sinyashina

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

A. Yu Medkova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

E. G Semin

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

References

Supplementary files