DETECTION OF VENEZUELAN EQUINE ENCEPHALOMYELITIS VIRUS RNA IN BIOLOGICAL SAMPLES BY REVERSE-TRANSCRIPTION POLYMERASE CHAIN REACTION


Cite item

Full Text

Abstract

Aim. Detection and identification of Venezuelan equine encephalomyelitis (VEE) virus RNA in biological samples by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and RT-PCR in real time (rRT-PCR). Materials and methods. VEE, Sindbis, West Nile, Japanese and tick-borne encephalitis viruses were studied. Cell culture of chicken fibroblasts, outbred mice and rats, Javanese macaques were used in the experiments. Biological activity determination of the running culture of causative agents used in the experiments was carried out by negative colony method in monolayer cell culture under agar coating and using intra-cerebral infection of mice. Reagent kits developed in the 48th Central Research Institute and Institute of Analytical Instrument Engineering were used during execution of experiments of VEE virus RNA detection by RT-PCR and rRT-PCR. Results. VEE virus was detected in biological samples by various methods. Data from RT-PCR and rRT-PCR are in accordance with the results of virus detection in samples using sensitive animals. Conclusion. Use of molecular-diagnostics methods for detection in biological samples of a causative agent of a dangerous infectious disease is important for procuring biological safety of Russian Federation.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вирус венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) - арбовирус, относящийся к роду Alphavirus семейства Togaviridae. Комплекс вируса ВЭЛ содержит 13 подтипов, включающих 8 различных вирусов. Подтипы IAB и IC вируса ВЭЛ вызывают эпидемии и эпизоотии [4, 14, 15]. С момента первого выявления (1938 г.) вируса ВЭЛ [5] имеются сведения о многочисленных эпизоотиях и эпидемиях на территории Колумбии, Венесуэлы, Мексики, США и других стран Западного полушария, во время которых были зарегистрированы многочисленные случаи заболевания людей и лошадей. Развитие транспортных связей делает возможным завоз возбудителя на неэндемичные территории [3, 7, 9 - 12]. Несмотря на имеющееся разнообразие биологических методов диагностики вирусных инфекций, проблема быстрого и высокочувствительного выявления и идентификации этиологического агента заболевания остается актуальной. Выделение вируса в культуре клеток и реакция нейтрализации типоспецифическими сыворотками, традиционно считающиеся «золотым стандартом» диагностики, обладают рядом недостатков, главными из которых является высокая трудоемкость и продолжительность анализа. Кроме того, для верификации результатов серологических методов необходимо располагать сертифицированными сыворотками. Следует подчеркнуть, что именно эти методы до настоящего времени занимали ведущее положение при диагностике ВЭЛ. Общей тенденцией проводимых в последние годы диагностических исследований с возбудителями опасных и особо опасных вирусных инфекционных заболеваний является преобладание молекулярно-биологических методов, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей вирусных геномов. Среди этих методов ведущее положение занимает ПЦР для возбудителей с ДНК-геномом и ОТ-ПЦР для возбудителей с РНК-геномом. В настоящее время в области диагностики опасных и особо опасных инфекционных заболеваний человека широко используется ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [8]. Применение ПЦР-РВ и ОТ-ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет вирусных нуклеиновых кислот. Этот метод дает возможность минимизировать влияние так называемого человеческого фактора. За рубежом разработаны наборы реагентов для выявления РНК вируса ВЭЛ методом ОТ-ПЦР [6, 8, 13]. При этом чувствительность данных методов варьировала и значительно различалась (2 - 70, 150, 5000 ЛД50МИЦмл-1). В Российской Федерации наборы реагентов для выявления РНК вируса ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ не разработаны, что определяет актуальность данной работы. Целью данной работы является выявление и идентификация РНК вируса ВЭЛ в биологических пробах методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирусы: вирус ВЭЛ, штамм Тринидад; вирус Синдбис, штаммы AR-339 и Аз-574; вирус Западного Нила (ЗН), штамм Eg-101; вирус японского энцефалита (ЯЭ), штамм Пекин-1; вирус клещевого энцефалита (КЭ), штамм Софьин. Были получены из государственной коллекции вирусов 48 ЦНИИ. Для получения биомассы вирусов ВЭЛ и Синдбис использовали 11-суточные развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ), возбудители лихорадки Западного Нила, ЯЭ, КЭ накапливали в головном мозге мышей. В экспериментах использовали беспородных мышей массой 7 - 9 г, беспородных крыс массой 50 - 100 г, яванских макаков массой 4 - 5 кг, полученных из вивария института. Работу с животными проводили в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. Культуру клеток куриных фибробластов (КФ) получали из отдела культур клеток. Определение биологической активности использованных в экспериментах рабочих культур возбудителей проводили методом негативных колоний на монослойной культуре клеток КФ под агаровым покрытием [2] и с помощью внутримозгового инфицирования мышей [2]. Крысам (подкожно) и яванским макакам (внутримышечно) вводили возбудитель ВЭЛ в дозе 1x103 БОЕ. Кровь у инфицированных животных в количестве 1 мл от каждой особи отбирали на 1 - 7 сутки после заражения. При проведении экспериментов по выявлению РНК вируса ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в биологических пробах использовали разработанные в 48 ЦНИИ и Институте аналитического приборостроения наборы реагентов. Для пробоподготовки использовали 100 мкл сыворотки. Был выбран наиболее быстрый и широко используемый метод выделения нуклеиновых кислот, основанный на лизисе образцов высоко концентрированным хаотропным веществом - гуанидинидин тиоционатом в смеси с этилендиаминтетрауксусной кислотой с одновременной сорбцией нуклеиновых кислот на микрочастицах стекла. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Таблица 1. Результаты оценки аналитической чувствительности наборов реагентов для выявления РНК ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ Биологическая активность возбудителя в исследуемой пробе, ЛД50МИЦхмл-1 Определение доли положительных результатов в экспериментах (n/N, X±o, процент) ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР-РВ 1,0х104 Пол. (10/10, 100-10) Пол. (10/10, 100-10) 1,0х103 Пол. (10/10, 100-10) Пол. (10/10, 100-10) 1,0х102 Пол. (10/10, 100-10) Пол. (10/10, 100-10) 10,0 Пол. (7/10, 70±15) Пол. (8/10, 80±13) 1,0 Пол. (3/10, 30±15) Пол. (4/10, 40±13) 0,1 Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) П римечание. N - общее количество проб; n - количество проб, давших положительный результат; Х±о - среднее значение доли положительных проб и его ошибка, рассчитанные по [1]; Пол. - положительный, Отр. - отрицательный (здесь и в табл. 2). На первом этапе исследований провели выравнивание секвениро-ванных геномных последовательностей штаммов вируса ВЭЛ и выбрали наиболее консервативную область генома - последовательность, кодирующую неструктурный белок Nsp1 вируса ВЭЛ. Для соответствующей области гена ВЭЛ была выбрана и обоснована структура видоспецифических праймеров. В дальнейшем при оценке аналитической чувствительности наборов реагентов методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для выявления РНК вируса ВЭЛ использовали 10-кратные разведения рабочей культуры возбудителя, содержащие от 0,1 до 1x104 ЛД50МИЦхмл-1. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что чувствительность разрабо- Таблица 2. Результаты оценки аналитической специфичности наборов реагентов для выявления РНК ВЭЛ методами ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ Исследуемый материал Биологическая активность возбудителя в исследуемой Определение доли положительных результатов в экспериментах (n/N, X±o, процент) пробе ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР-РВ Вирус ВЭЛ штамм Тринидад Вирус ЯЭ штамм Пекин 1 Вирус ЗН штамм Eg-101 Вирус Синдбис штамм AR-339 Вирус Синдбис штамм Аз-574 Вирус КЭ штамм Софьин Неинф. РКЭ Головной мозг неинф. мышей 1,0х102 ЛД50МИЦхмл-1 1,0х105 ЛД50МИЦхмл-1 1,0х105 ЛД50МИЦхмл-1 1,0х105 БОЕхмл-1 1,0х105 БОЕхмл-1 1,0х105 ЛД50МИЦхмл-1 Пол. (10/10, 100-10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Пол. (10/10, 100-10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) Отр. (0/10, 0+10) танных наборов реагентов находится в диапазоне 1 - 10 ЛД50МИЦхмл-1, что превышает чувствительность разработанных за рубежом тестсистем. Таблица 3. Результаты выявления возбудителя ВЭЛ в сыворотках крови инфицированных крыс и яванских макаков методами ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР-РВ и с помощью биопробы Исследуемые Сутки после Результаты выявления возбудителя с помощью... (доля положительных проб, процент) вания ОТ-ПЦР ОТ-ПЦР-РВ Биопробы Инф. крыс 3 100 100 100 5 100 100 100 7 50 50 50 9 0 0 0 Неинф. крыс - 0 0 0 Инф. яванских макаков 3 100 100 100 5 100 100 100 7 50 50 50 9 0 0 0 Неинф. яванских макаков - 0 0 0 Примечание. Биопроба - выявление вируса ВЭЛ с помощью интрацеребрального заражения мышей с последующим подтверждением специфичности гибели. Результаты оценки аналитической специфичности наборов реагентов для выявления РНК вируса ВЭЛ, представленные в табл. 2, свидетельствуют, что разработанные наборы реагентов обладают видовой специфичностью - определяют только РНК вируса ВЭЛ. С учетом того, что наиболее распространенным видом биологических проб, исследуемых на содержание инфекционного агента, является кровь заболевших, в последующем была оценена возможность выявления возбудителя ВЭЛ в сыворотках крови инфицированных лабораторных животных, взятых в различное время после заражения. В экспериментах были использованы крысы и яванские макаки, у которых заболевание не сопровождается летальным исходом. Уровень вирусемии у животных данных видов (1,0x103 - 1,0x107 ЛД50МИЦхмл-1) соответствует таковому у больного ВЭЛ человека [3, 4]. Определение возбудителя в пробах проводили одновременно с помощью ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР-РВ и титрования на мышах при внутримозговом способе инфицирования с последующим подтверждением специфичности гибели животных. Результаты выявления РНК вируса ВЭЛ в сыворотках крови инфицированных животных, представленные в табл. 3, свидетельствуют, что данные ОТ-ПЦР совпадают с таковыми ОТ-ПЦР-РВ, а уровень чувствительности обоих методов позволяет выявлять РНК вируса ВЭЛ в сыворотках крови животных уже на 3 сутки после инфицирования. Результаты обеих реакций хорошо согласуются с уровнем накопления вируса в головном мозге мышей, инфицированных исследуемыми пробами интрацеребрально (минимальная концентрация вируса ВЭЛ, определяемая при подобном способе инфицирования ~7 ЛД50МИЦхмл-1). Коэффициент соответствия, рассчитанный по [1], составляет (100-5)%. ОБСУЖДЕНИ Е Общей тенденцией проводимых в последние годы диагностических исследований с возбудителями опасных инфекционных заболеваний является преобладание молекулярнобиологических методов, специфичность которых основана на уникальности нуклеотидных последовательностей геномов микроорганизмов. Среди этих методов ведущее положение занимает ОТ-ПЦР для возбудителей с РНК-геномом. Применение ОТ-ПЦР-РВ позволяет проводить выявление продуктов амплификации в процессе реакции и вести количественный учет нуклеиновых кислот микроорганизмов. Этот метод дает возможность минимизировать влияние так называемого человеческого фактора. Наиболее распространенным видом биологических проб при выявлении инфекционного агента является кровь заболевших. Нами была проведена оценка возможности выявления возбудителя ВЭЛ с помощью ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в сыворотках крови инфицированных крыс и яванских макаков. Установлено, что на 5 сутки после инфицирования вирус выявлялся у всех животных тремя методами, а на 7 - только у 50% животных, что, видимо, связано с индивидуальными особенностями организма. На 9 сутки, когда происходит элиминация вируса из организма, вирус не определялся ни одним из указанных методов. Следует отметить, что затраты времени при проведении указанных методов являются несопоставимыми - 4 часа при постановке ОТ-ПЦР, 2 часа - для ОТ-ПЦР-РВ (без учета пробоподготовки) и 10 суток - при выявлении активности возбудителя, а с учетом необходимости подтверждения специфичности гибели животных - 14 суток [2]. Таким образом, данные результаты подтверждают возможность использования ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ в диагностических целях для выявления РНК вируса ВЭЛ не только в биологических, но и в клинических пробах, в частности, в сыворотках крови больных людей.
×

About the authors

A. A Petrov

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

N. S Pyshnaya

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

V. N Lebedev

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

V. S Kulish

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

L. F Stovba

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

A. V Kazantsev

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

S. V Borisevich

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

References

  1. Генес В.С. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. М., Медицина, 1967.
  2. Здродовский П.Ф., Соколов М.И. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. М., Медицина, 1965.
  3. Bowen G.S., Fashinell T.R., Dean P.B., Gregg M.B. Clinical aspects of human Venezuelan equine encephalitis in Texas. Bull. Pan. Am. Health Organ. 1976, 10: 46-57.
  4. Johnson K.M, Martin D.H. Venezuelan equine encephalitis. Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 1974, 18 (I) : 79-116.
  5. Kubes V, Rios F.A. The causative agent of infectious equine encephalomyelitis in Venezuela. Science. 1939, 90 (1): 20-21.
  6. Linnsen B., Kinney R.M., Agnilar P et al. Development of reverse-transcription-PCR assay specific for detection of equine encephalitis viruses. J. Clin. Microbiol. 2000, 38(15): 1527-1535.
  7. Oberste M.S., Fraire M., Navarro R. Association of Venezuelan equine encephalitis virus subtype IE with two equine epizootics in Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1998, 59 (1): 100-107.
  8. Pisano M.B., Seco M.PS., Re YE. et al. Specific detection of all members ofVEE complex development of a RT-nested PCR. J. Virol. Met. 2012, 185 (1): 203-206.
  9. Rico-Hesse R., Weaver S.C., de Siger J. et al. Emergence of a new epidemic/epizootic Venezuelan equine encephalitis virus in South America. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, 92 (16): 52785281.
  10. Rivas F., Diaz L.A., Cardenas YM. Epidemic Venezuelan equine encephalitis in La Guajira, Colombia, 1995. J. Infect. Dis. 1997, 175 (4): 828-832.
  11. Salas R.A., Garcia C.Z., Liria J. Ecological studies of enzootic Venezuelan equine encephalitis in north-central Venezuela 1997 - 1998. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2001, 64 (1): 84-92.
  12. Walton T.E., Grayson M.A. Venezuelan equine encephalomyelitis. In: Monath T.P (ed.). The Arboviruses: Epidemiology and Ecology. Boca Raton Florida, CRC Press, 1988, р. 203-231.
  13. Wang E., Paessler S., Agnilar P et al. Reverse transcription-PCR-enzyme linked immunosorbent assay for rapid detection and differentiation of alpha virus infection. J. Clin. Microbiol. 2006, 44 (II) : 4000-4008.
  14. Weaver S.C., Ferro C., Barrera R. Venezuelan equine encephalitis. Ann. Rev. Entomol. 2004, 49 (1): 141-174.
  15. Weaver S.C., Pfeffer M., Marriott K. et al. Genetic evidence for the origins of Venezuelan equine encephalitis virus subtype IAB outbreaks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 60 (2): 441-448.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2015 Petrov A.A., Pyshnaya N.S., Lebedev V.N., Kulish V.S., Stovba L.F., Kazantsev A.V., Borisevich S.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies