EXPERIENCE OF STUDY AND POSSIBLE WAYS OF ELIMINATION OF FALSE POSITIVE AND FALSE NEGATIVE RESULTS DURING EXECUTION OF POLYMERASE CHAIN REACTION ON AN EXAMPLE OF JUNIN VIRUS RNA DETECTION

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Широкое внедрение ПЦР для выявления возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью, надежностью и возможностью использовать для проведения анализа предварительно инактивированные клинические пробы. В настоящее время создана научная и материально-техническая база для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой генодиагностической технологии - количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов - ПЦР в реальном времени [1, 7, 8]. Достоверность метода ПЦР диагностики, по данным разных авторов, составляет от 95 до 100%, а информативность получаемого результата зависит от правильности выбора материала для исследования [1, 5 - 8]. Основными параметрами, характеризующими любой метод выявления и идентификации возбудителей опасных инфекционных заболеваний являются: чувствительность, специфичность и воспроизводимость. Известно, что специфичность и чувствительность ПЦР тест-системы прежде всего зависит от структуры праймеров [9]. При этом в диагностических наборах разных производителей используются праймеры различной структуры, что может обусловливать получение отличающихся результатов. Некоторые штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома и, таким образом, становиться нераспознаваемыми при использовании выбранной пары праймеров. Для предотвращения ошибок подобного рода в настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя). Существуют два вида ошибок при проведении ПЦР: ложноположительные, когда на самом деле возбудитель в пробе отсутствует, и ложноотрицательные, когда выявляется отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе. Необходимо отметить, что ПЦР может показать положительный результат даже в том случае, когда в организме больного уже нет жизнеспособного возбудителя. Причиной этого является то, что ПЦР не отличает живой микроорганизм от погибшего. Амплификация специфичной ДНК происходит и в том, и в другом случае. Однако в любом случае такой результат свидетельствует об имевшем место инфекционном процессе. Поэтому результаты ПЦР обязательно должны быть подтверждены данными других методов, в первую очередь, результатами выявления возбудителя в биопробе [4]. Большая часть ложноотрицательных результатов обусловлена загрязнением исследуемой пробы примесями, ингибирующими ПЦР. В частности, установлено, что гепарин и формальдегид способны ингибировать ПЦР. Именно поэтому при постановке ПЦР в качестве положительного контроля нельзя использовать формалинактивированные препараты возбудителей [4]. Еще одной возможной причиной ложноотрицательных результатов ПЦР может являться концентрация возбудителя в исследуемой пробе, находящаяся ниже порога чувствительности метода. Важно отметить, что при диагностике особо опасных инфекционных заболеваний наибольшую опасность представляют ложноотрицательные результаты ПЦР. Поэтому в дальнейшем была экспериментально оценена возможность устранения некоторых ложноположительных и ложноотрицательных результатов на примере проведения ПЦР для выявления РНК вируса Хунин. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Вирус Хунин - возбудитель АГЛ штамм XJpR37/5787 получен из Национальной коллекции вирусов I группы патогенности 48 ЦНИИ. Набор реагентов для выявления РНК вируса Хунин методом ОТ-ПЦР, разработанный в Центре, состоит из 4 комплектов: для выделения РНК, проведения реакции обратной транскрипции, проведения ПЦР и электрофоретической детекции продуктов ПЦР. ОТ-ПЦР проводили по стандартной методике [9]. Перевиваемые культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero B, GMK-AH-1(T) получали из музея отдела клеточных культур Центра. Статистическую обработку данных проводили в соответствии с [2, 3]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Проведено экспериментальное изучение влияния различных факторов на получение ложноотрицательных анализов при постановке ПЦР при использовании разработанного в Центре амлификационного набора для выявления возбудителя АГЛ вируса Хунин методом ПЦР с электрофоретической детекцией. При проведении исследований была использована следующая методика. В пробирку с венозной кровью человека вносили вирус Хунин в концентрации, соответствующей аналитической чувствительности метода (1,0х103 БОЕхмл-1). Затем было изучено влияние различных факторов на получение ложноотрицательных результатов: трехкратное «замораживание - оттаивание» пробы; наличие в пробе формальдегида; наличие в пробе гепарина. Все исследования проводили в 10-кратной повторности. Результаты оценивали по доле положительных результатов в опыте и контроле. В результате исследований установлено (табл. 1), что изученные факторы оказывают различное воздействие на воспроизводимость результатов ПЦР по сравнению с контролем (стандартная мето-Таблица 1. Влияние воздействия различных факторов на ис- дика выявления РНК с помо-следуемую пробуиполучение ложноотрицательных щ ОТ-ПЦР) Гледует отме-результатов при выявлении РНК вируса Хунин щ Ц ). ду с помощью ОТ-ПЦР тить что абсолютно недопус Исследуемая проба Кол-во определе ний, n Кол-во полож. рез. в ПЦР, n Доля полож. рез., %, Х±о Р Кровь человека, содержащая вирус Хунин (1,0x103 БОЕхмл-1) 10 10 100-10 - То же при трехкратном «замораживании - оттаивании» 10 9 90±10 Нет То же при наличии в пробе 0,05% формальдегида 10 4 40±14 Р<0,01 То же при наличии в пробе 0,01% гепарина 10 0 0+10 Р<0,001 Примечание. - Вариант сравнения. тимым является добавление в исследуемую пробу гепарина. Поскольку в настоящее время широко используют одноразовые устройства для взятия крови, предусматривающие получение гепаринизированного материала, это необходимо учитывать при взятии крови у пациента. В то же время, трехкратное «замораживание-оттаивание» исследуемой пробы не оказывает достоверного влияния на чувствительность ОТ-ПЦР. Таблица 2.Результаты выявления РНК вируса Хунин с помощью ОТ-ПЦР в пробах после подращивания исходной культуры возбудителя Расч. конц. биол. акт. возб. Выявление РНК вируса Хунин в пробах взятых на ... час в исх. пробе, БОЕхмл-1 0 24 48 72 96 120 144 0,01 - - - - - + + 0,1 - - - - + + + 1 - - - + + + + 10 - - + + + + + Проведенные исследования позволили установить, что ложноотрицательные результаты ПЦР вследствие концентрации возбудителя в исследуемой пробе ниже порога чувствительности метода могут быть устранены с помощью подращивания возбудителя в подходящем субстрате накопления с последующим анализом полученного материала с помощью ПЦР. При анализе различных проб на предмет наличия в них того или Примечание. + Положительный, - отрицательный ре- ин°г° в°збудителЯ зачастую мы зультат выявления РНК вируса Хунин в пробе. сталкиваемся с ситуацией, когда концентрация возбудителя ниже пороговой чувствительности метода. В этом случае обычно подращивают возбудитель в чувствительной системе накопления. Однако и в указанном случае ПЦР может быть эффективно использована для максимально более раннего выявления возбудителя. С этой целью были приготовлены рабочие культуры вируса Хунин штамм XJpR37/5787, расчетная концентрация биологически активного возбудителя в которых составляла 0,01; 0,1; 1,0 и 10 БОЕхмл-1, соответственно. Данные культуры были использованы для инфицирования монослойной культуры клеток GMK-AH-1 (Д), используемой в качестве субстрата подращивания. С этой целью во флакон вносили 1,0 мл приготовленной культуры возбудителя. Расчетное количество клеток GMK-AH-1 (Д) во флаконе, исходя из расчетной концентрации клеток 2,0x105, составила 2,0x106. Расчетная множественность инфицирования составляла от 5x10-9 до 5x10-6 БОЕ на клетку. После адсорбции в течение 1 часа при температуре 37°C неадсорбировавшийся инокулят удаляли пипеткой и во флаконы вносили поддерживающую среду. После этого флаконы делили на 7 групп. Флаконы группы 1 помещали в холодильник, а флаконы групп 2 - 7 инкубировали в термостате при температуре 37°C. Флаконы группы 2 инкубировали в течение 24 часов, 3 - 48 часов, 4 - 72 часа, 5 - 96 часов, 6 - 120 часов, 7 - 144 часа. В полученных пробах с помощью ОТ-ПЦР определяли наличие РНК вируса Хунин. Результаты исследований, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что в зависимости от исходной концентрации возбудителя в анализируемой пробе с помощью ОТ-ПЦР удается выявить РНК вируса Хунин в пробах после подращивания в течение 48 - 144 часов, в зависимости от исходной концентрации возбудителя. Необходимо отметить, что минимальный период выявления вируса Хунин с помощью биопробы (инфицирование чувствительных лабораторных животных с последующей идентификацией возбудителя с помощью серологических тестов) составляет не менее 15 суток. ОБСУЖДЕНИ Е Существуют два вида ошибок при проведении ПЦР-анализа: ложноположительные, когда на самом деле возбудитель в пробе отсутствует и ложноотрицательные, когда выявляется отрицательный результат при наличии возбудителя в пробе. Причина этих ошибок может быть как на этапе исследования в лаборатории (лабораторная ошибка), так и на долабораторном или постлабораторном этапах. Ложноположительные результаты на долабораторных и постлабораторных этапах чаще всего обусловлены контаминацией пробы на стадии забора материала (при использовании нестерилизованного инструментария, пробирок, перчаток и др. материалов). Кроме того, существует опасность получения ложноположительных результатов в силу контаминации реагентов продуктами ампликонов, получаемых в данной лаборатории. Ложноотрицательные результаты на долабораторном этапе обусловлены несоблюдением правил забора материала, выбором метода исследования без учета особенностей возбудителя. Большая часть ложноотрицательных результатов обусловлена загрязнением исследуемой пробы примесями, ингибирующими ПЦР. Другой распространенной причиной ложноотрицательных анализов на долабораторном этапе является деградация (распад) геномной нуклеиновой кислоты возбудителя при транспортировке и хранении пробы. Это может происходить при несоблюдении правил транспортировки и хранения проб. Наконец, возможной причиной получения ложноотрицательных результатов при постановке ПЦР является концентрация возбудителя в пробе ниже порога чувствительности метода. При изучении влияния различных воздействий на пробу, содержащую вирус Хунин (трехкратное «замораживание - оттаивание», наличие в пробе 0,05% формальдегида или 0,01% гепарина), показано, что наиболее ингибирующее воздействие оказывает добавление гепарина. Данное обстоятельство необходимо учитывать при взятии крови у больных для дальнейшего проведения ПЦР с целью выявления возбудителя. Нами показано, что ложноотрицательные результаты ПЦР вследствие низкой исходной концентрации возбудителя в исследуемой пробе могут быть устранены с помощью подращивания патогена в подходящей системе накопления с последующим анализом полученного материала с помощью метода ПЦР, что позволяет в динамике выявлять возбудитель и тем самым минимизировать влияние недостаточно высокого порога чувствительности метода, обеспечивая при этом значительный выигрыш во времени по сравнению с традиционными вирусологическими методами.

About the authors

T. E Sizikova

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

V. N Lebedev

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

V. B Pantyukhov

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

S. V Borisevich

48th Research Institute of the Ministry of Defense of Russian Federation

V. A Merkulov

Scientific Centre of Medical Products Expertise

References

Supplementary files