STUDY OF PROTECTIVE ACTIVITY OF PROTEIN-CONTAINING ANTIGENS OF STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE IN A HETEROLOGOUS SYSTEM

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Проблема пневмококковой инфекции в последние десятилетия остается актуальной для России [4]. Streptococcus pneumoniae способен вызывать тяжелые инвазивные формы пневмококковой инфекции, особенно среди детей младше 2 лет и у лиц пожилого возраста [5, 7]. В настоящее время отмечается рост антибиотикорезистентности пневмококка, что значительно затрудняет лечение [9]. Кроме того, с определенной частотой меняется этиологическая значимость серотипов возбудителя. Так, в структуре доминирующих серотипов в России после 2000 года возросло значение серотипов 3, 6В, 7F, а также появились новые, ранее не выявлявшиеся, серотипы 4 и 15А/В [1]. Поэтому наиболее рациональным представляется профилактика пневмококковой инфекции с помощью вакцинации. Перспективным направлением является разработка вакцины на основе белков пневмококка, которые, как известно [8], обладают высокой гомологией между собой и, предположительно, могут формировать перекрестную защиту. Ранее нами исследована активность белоксодержащих антигенов пневмококка против заражения гомологичным штаммом S. pneumoniae [2]. Однако известно, что иммунный ответ к пневмококковой инфекции строго сероспецифический [6], т.е. против штаммов S. pneumoniae разных серогрупп формируется каждый раз свой иммунитет. Исследования последних лет убедительно показывают, что нельзя создать вакцину от всех штаммов/серогрупп S. pneumoniae на основе капсульных полисахаридных антигенов. Цель работы - исследование перекрестной протективной активности ряда препаратов на основе белоксодержащих антигенов пневмококка против заражения гетерологичными штаммами (№ 3 и № 11/56) S. pneumoniae серотипа 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы штаммы S. pneumoniae серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R, полученные из коллекции НИИВС им. И.И.Мечникова. Культуру возбудителя выращивали в сердечно-мозговом бульоне в течение 16 - 18 часов в СО2 инкубаторе при температуре 37°C и 5% содержании углекислого газа. Опыты проводили на мышах линии Balb/c массой 16 - 18 г, полученных из питомника НЦ Биомедицинских технологий, филиал «Андреевка». Белоксодержащие антигены пневмококка выделяли путем ацетонового осаждения надосадочной фракции культуральной среды. Белоксодержащие антигены пневмококка мышам вводили внутрибрюшинно двукратно с интервалом в 2 недели в дозах 10, 30, 50 и 100 мкг/ особь. Через две недели после повторного введения препарата мышей за- Таблица 1. Выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении препарата белоксодержащего антигена пневмококка (Бса) серотипа 3 (штамм № 3) Препарат Иммунизирующая доза, мкг/мышь Выживаемость на 10 сутки* Критерий значимости Z Бса 10 5/10 2 2** //-// 50 5/10 //-// //-// 100 1/10 1,43 Контроль - 1/10 - (интактные мыши) Примечание. Заражающая доза 25 LD5 *Здесь и в табл. 2-4: в числителе - число выживших мышей, в знаменателе - число зараженных животных; ** достоверность разницы между опытом и контролем (р<0,05). Таблица 2. Выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка (Бса) серотипов 3 (штамм № 3), 14 и 19F Препарат Выживаемость на 10 сутки* Критерий значимости, Z Бса серотипа 3 (№ 3) 10/10 4,1** Бса серотипа 14 2/10 1,64 Бса серотипа 19F 7/10 3,33** Контроль (интактные мыши) 0/10 - Примечание. Иммунизирующая доза - 30 мкг/ мышь; серотип 3 (штамм № 3) заражающая внутрибрюшинная доза - 19,95 LD50. В работе проведено сравнение про-тективного действия белоксодержащих антигенов пневмококка в гомологичной и гетерологичной системах. Таблица 4. Выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка (Бса) серотипов 3 (штаммы № 11/56 и 3), 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R Препарат Выживаемость на 10 сутки* Критерий значимости, Z Бса серотипа 3 (№ 3) 9/10 2,5** Бса серотипа 3 (№ 11/56) 9/10 2,5** Бса серотипа 6В 9/10 2,5** Бса серотипа 10А 6/10 1,39 Бса серотипа 14 7/10 1,76 Бса серотипа 19F 7/10 1,69 Бса серотипа 23F 7/10 1,87 Бса серотипа 36R 9/10 2,5** Контроль (интактные мыши) 3/10 - П римечание. Иммунизирующая доза - 100 мкг/мышь; серотип 3 (штамм № 11/56) заражающая внутрибрюшинная доза - 1,58 LD50. ражали внутрибрюшинно суточной культурой S. pneumoniae в дозе 105 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора (штамм № 3) и в дозе 104 микробных клеток в 0,5 мл физиологического раствора (штамм № 11/56). В качестве контроля служили неиммунизированные мыши. Наблюдение за животными проводили в течение 10 - 14 дней. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Результаты оценивали по выживаемости мышей в течение срока наблюдения, рассчитывая достоверность по методу С.А.Гланца [3]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Таблица 3. Выживаемость мышей при внутрибрюшинном введении препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка (Бса) серотипов 3 ( штамм № 11/56), 6В, 10А, 14, 19F и 23F Препарат Выживаемость на 10 сутки* Критерий значимости, Z Бса серотипа 3 (№ 11/56 ) 10/10 3,83** Бса серотипа 6В 10/10 3,83** Бса серотипа 10А 8/10 2,94** Бса серотипа 14 8/10 3,2** Бса серотипа 19F 9/10 3,5** Бса серотипа 23F 8/10 3,1** Контроль (интактные мыши) 1/10 - Примечание. Иммунизирующая доза - 50 мкг/ мышь; серотип 3 (штамм № 11/56) заражающая внутрибрюшинная доза - 1,99 LD50. На первом этапе изучена протек-тивная активность антигенного препарата пневмококка, выделенного из серотипа 3 (штамма № 3) (табл. 1), в гомологичной системе. Мышей иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней белоксодержащим антигеном пневмококка в дозах 10, 50 и 100 мкг/ особь и заражали через две недели после второй иммунизации бульонной культурой S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 3) в дозе 25 LD50. Дозы 10 и 50 мкг/особь защищали 50% опытных животных на протяжении 10 дней (р<0,05), в контроле наблюдали гибель 90% мышей. Доза 100 мкг/особь оказалась неэффективной. Далее проведено сравнение протективной активности препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка в гомологичной и гетерологичной системе. Мышей иммунизировали двукратно антигенами, полученными из серотипов 3 (штамм № 3), 14 и 19F в дозе 30 мкг/особь. Через две недели после второй иммунизации животных заражали бульонной культурой S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 3) в дозе 19,95 LD5o (табл. 2). Полученные результаты свидетельствовали, что гомологичный белоксодержащий антиген пневмококка серотипа 3 защищал 100% мышей в течение 10 дней эксперимента, гетерологичный белоксодержащий антиген, выделенный из серотипа 19F, защищал 70% животных (р<0,05), а препарат из серотипа 14 вообще не проявлял протективного эффекта. В эксперименте оценена перекрестная протективная активность препаратов белоксодержащих пневмококка, полученных из серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F и 23F от заражения 1,99 LD50 S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 11/56) (табл. 3). Животным вводили препараты двукратно с интервалом 14 дней в дозе 50 мкг/особь. Подтверждено, что гомологичный белоксодержащий антиген пневмококка защищал 100% животных. Протективный эффект гетерологичных белоксодержащих антигенов пневмококка различался: вариант из серотипа 6В защищал 100% мышей, из серотипа 19F - 90%, а из серотипов 10А, 14 и 23F - 80% животных соответственно (р<0,05). В опыте изучена перекрестная протективная активность препаратов белоксодержащих антигенов пневмококка, выделенных из серотипов 3, 6В, 10А, 14, 19F, 23F и 36R от заражения 1,58 LD50 S. pneumoniae серотипа 3 (штамм № 11/56) (табл. 4). Животных иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней в дозе 100 мкг/особь. Гомологичные белоксодержащие антигены пневмококка, полученные из серотипа 3, защищали 90% мышей (р<0,05). Такая же протекция отмечалась при введении гетерологичных белоксодержащих антигенов пневмококка, выделенных из серотипов 6В и 36R (р<0,05). Препараты, полученные из серотипов 10А, 14, 19F и 23F, не защищали мышей от заражения штаммом № 11/56 серотипа 3. Таким образом, выявленная гетерологичная защита была сопоставима с таковой в гомологичной системе (80 - 100%). ОБСУЖДЕН И Е Представленные результаты по гомологичной защите подтверждают ранее полученные [2], свидетельствующие, что белоксодержащие антигены пневмококка, полученные из серотипа 3, способны создавать высокую защиту опытных мышей при заражении S. pneumoniae серотипа 3. В экспериментах на животных получены интересные результаты по наличию перекрестной защиты. Все испытанные препараты белоксодержащих антигенов пневмококка, выделенные из серотипов 6В, 10А, 14, 19F, 23F, защищали мышей от заражения гетерологичным штаммом № 11/56 S. pneumoniae серотипа 3. Выраженность защиты составила 80 - 100%. В другом опыте про-тективным эффектом обладали препараты, полученные из серотипов 6В и 36R (по 90% выживших животных соответственно) при заражении животных штаммом № 11/56 S. pneumoniae серотипа 3. Такая разница обусловлена, вероятно, разными иммунизирующими и заражающими дозами. В отдельном эксперименте продемонстрировано протективное действие (70%) препарата белоксодержащего антигена пневмококка, выделенного из серотипа 19F, при заражении мышей штаммом № 3 S. pneumoniae серотипа 3. Белоксодержащий антиген, приготовленный из серотипа 14, в этом же опыте защитным действием не обладал. В проведенных экспериментах наличие и выраженность защиты зависели от штамма заражающей культуры S. pneumoniae, а также от дозы введенного патогена. Таким образом, выявленная перекрестная протективная активность в опытах in vivo позволяет предположить, что она формируется преимущественно за счет белковых антигенов пневмококка, поскольку последние обладают высокой степенью гомологии между собой, в то время, как среди капсульных полисахаридов такой гомологии не обнаружено. Эту мысль подтверждает также эффективность белоксодержащего антигена пневмококка, полученного из бескапсульного серотипа 36R, в котором должны отсутствовать полисахаридные антигены. Однако наличие капсульных полисахаридов в других исследуемых образцах может играть роль адъювантов и, соответственно, усиливать иммунный ответ к белоксодержащим антигенам. Учитывая полученные данные, необходимо проверить перекрестную протектив-ную активность отдельных белковых фракций пневмококка, выделенных из разных серотипов, против заражения как гомологичным, так и гетерологичными серотипами S. pneumoniae. Главной целью следующих экспериментов станет отбор наиболее иммуногенных штаммов S. pneumoniae, из которых будут выделены протективные белковые фракции пневмококка.

About the authors

D. S Vorobiev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

I. B Semenova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Yu. V Volokh

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

E. E Romanenko

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

A. P Baturo

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

N. A Mikhailova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

References

Supplementary files