IMMUNOLOGIC MONITORING OF HELICOBACTER PYLORI PERSISTENCE IN THE ORGANISM

Full Text

В общей структуре инфекционной патологии острые кишечные инфекции (ОКИ) занимают одно из ведущих мест - второе место после острых респираторных заболеваний [6, 7]. Среди клинически выраженных острых заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) по-прежнему большая часть остается этиологически нерасшифрованной. Верификация диагноза острых и в особенности хронических и ассоциированных кишечных инфекций, а также обследование бессимптомных пациентов, учитывая их высокую антигенную нагрузку антигенами патогенных возбудителей ЖКТ, до настоящего времени трудна, недостаточно разработана и не всегда убедительна [1, 3]. Особое место среди заболеваний ЖКТ занимает Helicobacter pylori (Нр), инфицирующий более половины населения мира, а в экономически слабо развитых - до 80 - 100%. В большинстве случаев этот хронически персистирующий патоген вызывает бессимптомное воспаление слизистой оболочки желудка, однако примерно в 10% случаев может вызвать клинически выраженный хронический гастрит, гастродуоденит, язвенную болезнь. Более того, по данным ВОЗ, Hp относится к безусловным факторам риска развития рака желудка, вызывающего высокую смертность (второе место после рака легких). Хронический хеликобактериоз, таким образом, представляет серьезную проблему также в области онкологии. К наиболее изученным антигенам, играющим большую роль в патогенезе Нр-инфек-ции, относится ЛПС/О-антиген. Известно, что эндотоксин/ЛПС грамотрицательных бактерий при острых, хронических и латентных формах инфекционного процесса является причиной развития воспаления, на фоне которого возникает и усугубляется тяжесть клинического течения многих заболеваний как инфекционных (желтушные формы гепатитов), так и соматических (атеросклероз), а также изменение нейроповеденческих функций даже здорового человека [5]. Эндотоксин ЛПС оказывает разнообразные биологические эффекты как напрямую, так и опосредованно через клетки-мишени на гемостаз и гемодинамику, гепатоциты и иммуноциты, активируют CD4, CD8, клетки памяти, макрофаги, дендритные и другие клетки, органы и системы организма [5]. В отличие от О-антигенов других энтеробактерий, О-антиген Нр обладает менее выраженной активностью, его токсичность в связи с этим в 500 - 1000 раз меньше таковой О-антигена Salmonella typhimurium. В его составе обнаруживается компонент (фукоза), аналогичный Льюис Y (Ley) антигену эпителиальных клеток желудка человека и придающий О-антигену свойства аутоантигена [4, 8, 10]. VacA цитотоксин Нр, вызывающий вакуолизацию и гибель эпителиальных клеток желудка, играет важную роль в воспалении благодаря увеличению сосудистой проницаемости, адгезии лейкоцитов, агрегации тромбоцитов, нарушению микроциркуляции слизистой, участвует в апоптозе эпителиальных клеток и ингибирует Т-клеточную пролиферацию и эффекторные функции. Этот токсин определяет токсическое воздействие и тяжесть клинического течения заболевания. CagA - маркер островка патогенности, состоящего из 40 генов, контролирующих вирулентность, участвует в изменениях сигнального пути IV типа секреции (T4SS) эпите-лиоцитов слизистой желудка, приводящих к деструкции клеток, нарушению процесса апоптоза и колонизации, способствующей метаплазии и онкогенезу. CagA относится к бактериальным коонкогенам 1 класса. CagA и VacA взаимодействуют между собой, оба способствуют продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-а. При НР-инфекции отмечается высокая продукция IgG, при этом IgG и IgA к Нр могут секретироваться в слюну, мочу, желудочный сок [4, 8, 10]. К настоящему времени накоплен достаточно большой экспериментальный материал о механизмах взаимодействия факторов патогенности Нр при персистенции, влиянии на иммунитет в опытах на экспериментальных животных. Что же касается изучения его роли в механизмах персистенции у людей, и в особенности при длительном мониторинге, то эти исследования единичны. Отсутствуют исследования естественного иммунитета в целом и связанных с воспалением канцерогенных свойств микроба. Большое число отдельных работ и обзоров посвящено исследованию циркулирующих иммунных комплексов, образующихся при вирусных, паразитарных и бактериальных инфекциях, в том числе при заболеваниях ЖКТ. При хеликобактериозе подобные исследования весьма ограничены, особенно о роли ЦИК, включающих отдельные факторы патогенности Нр при хронической персистенции возбудителя. В целом, несмотря на длительную разработку проблем иммунитета при Нр и несомненные успехи в этой области, ключевые аспекты, такие как протективные антигены бактерий, иммунные механизмы, критически важные для предупреждения язвенных поражений и рака желудка, остаются пока предметом будущих исследований. К настоящему времени разработаны различные диагностические методы при хеликобактериозе, инвазивные, требующие предварительного проведения эндоскопии (гистологический, бактериоскопический, уреазный тесты), и неинвазивные [4, 8, 10]. Среди неинвазивных иммунологических методов наиболее широкое применение получили методы выявления специфических антител к Нр и в последние годы - определение антигенов Нр в кале. В наших исследованиях, начиная с 1978 г., используется реакция коагглютинации (РКА), основанная на способности поверхностного белка А S.aureus штамма Cowan I соединяться с Fc-фрагментами специфических IgG1, 2, 4, после чего свободные Fab-фрагменты этих антител могут связаться со специфическими антигенами, что проявляется реакцией агглютинации стафилококков. Известно, что IgG составляют более половины всех антител, образующихся при иммунном ответе. IgG1 и IgG3 весьма эффективны в привлечении фагоцитов и киллерных клеток, а также в активации комплемента. Роль IgG2 и IgG4 состоит преимущественно в прямой нейтрализации патогена. IgG2 чаще всего специфичны к углеводным компонентам антигенов. С помощью РКА можно выявлять свободные антигены Нр и антигены в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в различных биологических субстратах (сыворотка крови, слюна, кал, моча и др.). Хронический хеликобактериоз представляет серьезную проблему здравоохранения, для решения которой необходима разработка эффективных методов своевременной диагностики, определения риска возможных обострений и осложнений. Первостепенной задачей является изучение механизмов персистенции Нр в организме, в том числе иммунологических механизмов персистенции Цель работы - обобщение данных многолетних мониторинговых исследований динамики и механизмов персистенции H.pylori у добровольцев и амбулаторных пациентов с заболеваниями желудочно-кишечного тракта и оценка значения влияния внутренних и внешних факторов воздействия. С 2005 по 2014 гг. под нашим наблюдением находились 8442 амбулаторных больных в возрасте от нескольких месяцев до 75 лет ( средний возраст - 34 года). Диагноз хронического гастродуоденита поставлен 3206 чел., диагноз язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофического гастрита, хронического колита, синдрома раздраженного кишечника (СРК), неязвенной диспепсии, гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) - 2127 чел., неинтестинальные заболевания (болезни кожи, суставов, органов мочеполовой системы) - 89 чел. Также обследованы 30 практически здоровых лиц. Кроме того, за период 1999 по 2014 гг. включительно были также обследованы 22 добровольца различного возраста от 1,5 до 92 лет (средний возраст - 39 лет), из них 6 мужчин и 16 женщин, не имевших выраженных клинических симптомов со стороны ЖКТ. Мониторинговые исследования добровольцев проводили в течение 14 - 15 лет ( 3 человека), 3 - 4 лет (6 человек), 1 - 2 года (13 человек) на протяжении всего периода наблюдения регулярно с периодичностью 1 - 3 дня. Материалом для исследования от больных пациентов чаще всего служили сыворотка крови и кал, реже - слюна, общее число исследованных проб - 9315. Материалом для исследования от здоровых добровольцев являлись, в основном, пробы копрофильтратов и слюны, реже - сыворотка крови и моча, общее число исследованных проб - 2156. Для определения антигенов H.pylori применена реакция коагглютинации [2] в двух вариантах: 1) РКА на стекле с прогретым (100оС - 30 мин) биоматериалом для выявления свободного О-антигена в кале; 2) РКА на планшетах с нативным (негретым) биоматериалом для выявления О-, CagA и VacA-антигенов в составе иммунных комплексов в кале. Каждую пробу биоматериала исследовали с набором тест-систем для индикации О-антигена, высокомолекулярных белков (ВМБ), включая CagA-антиген, и антиген VacA-цитотоксина H.pylori. Тест-системы разработаны и изготовлены в ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Т-клеточный иммунитет у больных язвенной болезнью желудка исследован в реакции торможения миграции лейкоцитов (СТКМ) периферической крови in vitro в присутствии H.pylori. Статистическая обработка данных проведена с использованием параметрических и непараметрических методов анализа и корреляционного анализа по программам Statistica Microsoft Word for Windows, Excell 2007, BioStat 2012. Результаты представлены как среднее и стандартное отклонение (M±SD). Статистически достоверными считали различия при р<0,05. В результате мониторинговых исследований биоматериалов от больных заболеваниями ЖКТ было показано, что патогенетически значимые антигены H.pylori (ЛПС/О-антиген, ВМБ, включая CagA и VacA) встречались с высокой частотой - от 25 до 92%. Инфицированность H.pylori у добровольцев составляла 100%. Установлено, что частота встречаемости О-, CagA- и VacA- антигенов H.pylori в организме в значительной степени зависит от воздействия внутренних и внешних факторов - вида исследуемого биоматериала, возраста пациентов, временных периодов взятия материала (суточных, околомесячных, сезонных, годовых, многолетних в пределах 11-летних солнечных циклов), от особенностей клинических проявлений заболевания и выраженности интоксикации и воспаления, иммунитета, солнечной активности и в зависимости от их совокупности подвержена постоянным циклическим колебаниям. Прежде всего, вид исследуемого материала (кал, слюна, сыворотка крови, моча) имеет большое значение не только для определения частоты встречаемости антигенов H.pylori при его персистенции, но также для выявления значимости этих показателей в оценке взаимодействия в тандеме паразит-хозяин, а именно - в качестве показателя как жизнедеятельности микроба, так и ответной иммунной реакции организма. В специально проведенных экспериментах установлено, что использование кала для определения свободного О-антигена в РКА на стекле и связанных в иммунные комплексы О-, CagA- и VacA- антигенов свидетельствует о наличии патогенных штаммов H.pylori в организме (Нр-инфицированность), а нарастание этих показателей - о размножении микроба в желудке и активной продукции токсинов - факторов вирулентности. Использование сыворотки крови позволяет обнаруживать, главным образом, антигены в составе ЦИК, что является показателем ответной иммунной реакции организма, свидетельствует о накоплении антитоксических антител в сыворотке крови. Постановка РКА со слюной при использовании прогретого биоматериал позволяет определить наличие и интенсивность циркуляции свободного О-антигена, а при постановке РКА на планшетах - циркуляцию О-, CagA- и VacA- антигенов в составе ЦИК, то есть определять и жизнедеятельность микроба, и ответную иммунную реакцию организма. Кроме того, использование слюны и кала в качестве биоматериала для исследования в РКА делает этот метод истинно неинвазивным, безопасным, исследование слюны не уступает по информативности исследованию кала (чувствительность - 81%, специфичность - 73%) В моче ЛПС/О-антиген H.pylori в РКА на стекле и планшетах после прогревания биопробы не выявляется. Без прогревания биопроб О-, CagA- и VacA-антигены в составе ЦИК выявляются нередко с высокой частотой, что, возможно, связано с выделением с мочой низкомолекулярных фрагментов специфических детерминант этих антигенов. В определенные временные периоды, когда продукция CagA- и VacA H.pylori в организме прекращается и снижается их уровень в ЦИК сывороток крови и слюне, также снижается и частота положительных реакций в моче. Наряду с видом биоматериала, важно учитывать время суток, в которое происходит взятие биоматериала. Показано, что в ночное время суток антигены H.pylori находятся, в основном, в составе ЦИК, в то время как в дневное время, наоборот, повышаются показатели свободных антигенов. В течение календарного года среднемесячные показатели частоты встречаемости свободного О-антигена существенно нарастают в зимне-весенний период (февраль, март) и осенний период (сентябрь-ноябрь). Антигены в составе ЦИК на высоком уровне отмечаются в летние месяцы (июнь-август). Это косвенно свидетельствует о значении гуморального иммунитета при персистенции H.pylori, который, очевидно, снижается в осенний, зимний и весенний периоды года, при этом усиливается размножение H.pylori и уровень О-антигена, в то время как летом гуморальный иммунитет укрепляется, снижается размножение H.pylori, повышается уровень антитоксических антител, усиливается связывание его антигенов и токсинов в ЦИК. Сезонные колебания отмечены нами при исследовании Т-клеточного иммунитета в группе больных язвенной болезнью желудка в скрининговом тесте клеточной миграции в присутствии in vitro антигенов H.pylori. При этом установлено, что ускорение миграции лейкоцитов, свидетельствующее о циркуляции в организме ЦИК, сформированных в избытке антигенов H.pylori, отмечается в осенние, зимние и весенние месяцы года, а торможение миграции лейкоцитов, свидетельствующее о присутствии в организме ЦИК, сформированных в избытке антител на фоне их активной продукции - в летние месяцы года. Эти данные коррелируют с показателями сезонных колебаний соотношения свободных и связанных в ЦИК антигенов H.pylori. Важным фактором при оценке хронического хеликобактериоза является эффективность специфического антитоксического иммунного ответа, показателем которой в наших исследованиях является соотношение частоты встречаемости и уровня среднемолекулярных IgG-ЦИК, включающих О-, CagA- и \&cA- антигены, и показателей свободного О-антигена H.pylori на протяжении многолетней персистенции в организме. Нами установлено, что периоды снижения иммунитета, повышенного размножения H.pylori и продукции токсинов своеобразно отражаются в лабораторных показателях: происходит подъем частоты встречаемости О-антигена и снижение показателей ЦИК: снижение ЦИК при одновременном высоком содержании свободного антигена в 2001 г. и 2012 - 2013 гг., высокие показатели ЦИК в течение 2 - 3 лет в 2003 - 2006 гг. при постоянно снижающихся в это время показателях свободного О-антигена. Именно в периоды, когда частота встречаемости О-антигена поднималась выше частоты встречаемости ЦИК, показан риск возникновения клинических обострений хеликобактериоза. Среди факторов, оказывающих влияние на персистенцию H.pylori в организме возраст пациента имеет важное значение. Как известно из литературных данных и показано нами, инфицирование человека H.pylori происходит с самого раннего детского возраста и постепенно нарастая к 12 - 14 годам жизни достигает уровня взрослых. У взрослых лиц инфицированность H.pylori остается высокой до 70 - 80-летнего возраста, затем начинает снижаться [9]. При наличии явных клинических признаков обострения хеликобактериоза (хронического гастрита, гастродуоденита, язвенной болезни, атрофического гастрита) увеличивается частота встречаемости антигенов H.pylori в биопробах. В результате анализа данных многолетнего мониторинга H.pylori и сопоставления их с солнечной активностью, оцениваемой в числах Вольфа, были получены неожиданные результаты. Закономерные отмеченные выше циклические колебания частоты встречаемости антигенов H.pylori в свободном виде и в составе ЦИК строго коррелировали с показателями солнечной активности. Это отмечалось в отношении ежедневных, околомесячных, годовых (сезонных) и многолетних колебаний показателей динамики циркуляции антигенов H.pylori. Колебания показателей О-антигена синхронно с солнечной активностью отмечались в 65 - 100% случаев, в среднем - в 85% случаев. Критические годы с точки зрения возникновения обострений заболеваний ЖКТ - 2001 г. и 2012 - 2013 гг. (годы максимума солнечной активности), в которые на фоне существенного подъема уровня О-антигена резко снижался уровень ЦИК. Накопленные к настоящему времени данные позволил разработать способ определения риска возможных обострений хеликобактериоза (Патент RU 2481584 ). Сопоставление рассчитанных на 2009 - 2012 гг. предполагаемых показателей с фактическими данными выявления частоты встречаемости О-антигена H.pylori показало их высокую прямую корреляцию при язвенной болезни (r=0,98; р=0), хроническом гастродуодените (r=0,96; р=0,04), острых заболеваниях ЖКТ (r=0,96; р=0,04) [Belaya Yu.A. et al., 2012]. Разработанный в 2012 г. прогноз показателей частоты встречаемости О-антигена до 2019 г., с учетом ряда вышеизложенных факторов, находит свое подтверждение в последние 2 года. Это свидетельствует не только о возможности прогнозирования частоты встречаемости О-антигена в качестве показателя размножения H.pylori на фоне снижения иммунитета, но и правомерность полученных нами данных мониторинга о циклических колебания жизнедеятельности H.pylori и ответной реакции на это в зависимости от ряда внутренних и внешних факторов, среди которых иммунитет и солнечная активность являются доминантными. Используемые нами принцип и методика проведения длительного мониторинга H. pylori был применен для изучения не только специфического Нр-иммунитета, но и общего неспецифического иммунитета. Полученные данные свидетельствуют о синхронной корреляции естественного иммунитета со специфическим. Наличии его циклических колебаний в зависимости от тех же внутренних и внешних факторов, в том числе от солнечной активности. В результате многолетних мониторинговых исследований установлены закономерные циклические колебания частоты встречаемости патогенетически значимых О-, CagA- и VacA- антигенов H.pylori в биологической жидкости, свидетельствующие о циклических изменениях жизнедеятельности микроба и ответной иммунной реакции при хронической персистенции патогена в организме. Установлена зависимость этих изменений от ряда внутренних и внешних факторов, доминантными среди которых является иммунитет и солнечная активность. Установлены критические временные периоды возможных клинических обострений - околомесячные, окологодовые (сезонные), конкретные годы 11-летних солнечных циклов. На основе полученных данных разработан прогноз динамики циркуляции патогена при персистенции в организме и формирования иммунитета до 2019 г. Реакция коагглютинации для определения специфических антигенов H.pylori в кале, слюне, сыворотке крови является идеальным неинвазивным высокочувствительным и специфическим методом определения антигенов в свободном виде и в составе ЦИК, позволяет одновременно определять H.pylori-инфицированность, патогенность штамма, наличие иммунитета и, следовательно, возможность обострений и своевременной их профилактики. Установленная нами высокая чувствительность H.pylori к изменениям солнечной активности , зависимость циркуляции его антигенов от ряда внутренних факторов, главным образом, иммунитета, и внешних факторов, в особенности гелиогеомагнитных колебаний, а также их далеко не очевидная изменчивость в ближайшие годы определяют настоятельную необходимость в проведении постоянного иммунологического мониторинга перси-стенции H.pylori в организме с целью получения новых знаний о персистенции H.pylori в организме как о многофункциональном процессе.

About the authors

Yu. A Belaya

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

O. F Belaya

Sechenov First Moscow State Medical University

V. G Petrukhin

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

M. S Vakhrameeva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

S. M Bystrova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

A. V Pronin

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

References

Supplementary files