MALDI-TOF MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS OF LEPTOSPIRA SPP. USED IN SERODIAGNOSTICS OF LEPTOSPIROSIS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Лептоспироз является широко распространенным зоонозным заболеванием, вызванным различными сероварами патогенных лептоспир, которые прямо или косвенно передаются от животных человеку. Возбудителями лептоспироза являются грамотрицательные бактерии группы спирохет рода Leptospira, насчитывающие в настоящее время более 13 патогенных видов [2]. Существует две системы классификации лептоспир, а именно: определение таксономических видов на основе анализа ДНК молекулярно-генетическими методами и определение сероваров с помощью серологических методов. Серологическая классификация строится на основании различия липополисахаридных антигенов клеточной поверхности. Данная классификация разделяет патогенные лептоспиры более чем на 200 сероваров, объединенных по общим антигенам в серогруппы [9]. Поскольку иммунологические и генетические методы типирования ориентированы на различные клеточные структуры, эти две системы классификации не соответствуют друг другу [4]. Тем не менее, серовары являются основными внутривидовыми таксономическими единицами. Клинические проявления лептоспироза являются неспецифическими, поэтому диагностика заболевания основана на результатах лабораторных исследований. Получение изолята культуры лептоспир из патологического материала является безусловным подтверждением диагноза лептоспироза. Однако бактериологические методы выделения лептоспир трудоемки и могут занять срок до месяца, что не способствует ранней диагностике. Обнаружение ДНК лептоспир в крови пациента методом ПЦР является быстрым и доказательным тестом, но применение его наиболее информативно в острой фазе в течение первых 5 - 10 дней заболевания. Поэтому диагностика лептоспироза в вариабельные сроки от начала заболевания основывается на серологических методах, среди которых реакция микроскопической агглютинации (РМА) на сегодняшний день остается референтным тестом [14]. Для постановки РМА требуется поддержание коллекции живых штаммов Leptospira, которые используются в качестве антигенов. Диагностический набор референсных штаммов лептоспир, используемый в рутинной клинической и ветеринарной диагностике, должен строго контролироваться на качество и неизменность антигенного состава [5]. Классическим методом контроля качества коллекции референсных штаммов является перекрестная реакция агглютинации с моноспецифическими сыворотками, полученными при иммунизации кроликов соответствующими штаммами лептоспир или с моноклональными антителами. По причине высокой трудоемкости этого метода в качестве альтернативы предложены различные молекулярногенетические методы идентификации. Однако эти методы дают возможность дифференцировать штаммы Leptospira на видовом уровне, не позволяя учитывать серологическую классификацию, необходимую для контроля референсных штаммов, используемых в РМА. В последние годы для идентификации микроорганизмов предложен и стал широко использоваться метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS). Более того, данная технология стала использоваться в рутинных исследованиях клинических микробиологических лабораторий для выявления бактериальных и грибковых патогенов [3, 8, 12, 13]. По сравнению с традиционными или молекулярногенетическими методами, MALDI-TOF MS является быстрым, точным и экономически эффективным методом идентификации бактерий. Масс-спектрометрическая идентификация исследуемого микроорганизма основывается на выявлении уникального набора клеточных белков в виде пиков в составе масс-спектра, являющихся своеобразным «отпечатком пальца» конкретного штамма. При этом классификация микроорганизмов происходит путем сопоставления масс-спектров исследуемого образца с данными эталонных спектров в таксономических базах. Однако идентификация, а также типирование штаммов Leptospira с помощью масс-спектрометрии затруднены из-за отсутствия эталонных масс-спектров белков в существующих международных базах данных. Тем не менее, имеются литературные данные по использованию MALDI-TOF MS для идентификации штаммов Leptospira, представляющих интерес с точки зрения медицинской и ветеринарной микробиологии, с применением созданных авторами собственных библиотек масс-спектров. Показано, что этот метод может быть использован для идентификации штаммов лептоспир, выделенных из патологического материала, на видовом уровне. При этом результаты масс-спектрометрической идентификации были идентичны таковым, полученным с помощью секвенирования генов [6, 11]. Цель данной работы - определение возможности использования масс-спектрометрии в качестве метода внутрилабораторного контроля данных штаммов на неизменность состава по наличию специфических пиков в масс-спектрах. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследовали 10 референсных штаммов Leptospira spp., используемых в панели для РМА, включая непатогенный штамм лептоспир Leptospira biflexa st. Patoc 1 (табл.) из коллекции НИИЭМ им. Пастера. Все исследуемые штаммы выращивали в микробиологических пробирках с жидкой питательной средой Терских с добавлением 5% сыворотки кролика при 28°C в течение 10 суток. Культуры дважды отмывали от среды фосфатно-солевым буфером и для дальнейшей стадии получения экстрактов клетки Референсные штаммы лептоспир, использованные в масс-спектрометриче ском анализе Геномовид Серогруппа Серовар Штамм L. interrogans Icterohaemorrhagiae Copenhageni M 20 L. interrogans Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae RGA L. interrogans Canicola Canicola Hond Utrecht IV L. interrogans Pomona Pomona Pomona L. kirschneri Pomona Mozdoc 5621 L. kirschneri Grippotyphosa Grippotyphosa Moskva V L. borgpetersenii Sejroe Sejroe M 84 L. borgpetersenii Ballum Ballum Mus 127 L. borgpetersenii Tarassovi Tarassovi Perepelicin L.biflexa Semaranga Patoc Patoc I суспендировали в 1 мл буфера с концентрацией бактерий не менее 1х106 на мл. Для создания классификационной модели референс-ные штаммы культи -вировали параллельно в 3 пробирках. Для проведения исследований по контролю неизменности референсных штаммов в процессе пересевов коллекции производили повторное получение образцов клеток через 6 месяцев, используя при этом по одной пробирке для каждого штамма. Для получения экстрактов каждую пробирку со взвесью клеток центрифугировали (Centrifuge 5424 R Eppendorf ) при 14 000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 10 минут. Надосадочную жидкость удаляли, а осадки суспендировали в 300 мкл дистиллированной/деионизированной воды. Затем в пробирку добавляли трехкратный объем 96% этилового спирта, тщательно перемешивали на вортексе до получения однородной суспензии и центрифугировали в течение 10 мин при 14 000 об/мин при комнатной температуре. Супернатант полностью удаляли и пробы подсушивали в термостате при 30°С в течение 30 мин для полного удаления спирта. Затем осадок, видимый на стенках пробирок, растворяли в 30 мкл 70% муравьиной кислоты (Merck, 98 - 100%, Германия) с последующим добавлением равного объема 30 мкл ацетонитрила (Sigma-Aldrich, Германия) и осаждением разрушенных клеток центрифугированием в течение 2 минут. Образцы экстрактов из каждой пробирки наносили по 1 мкл на 6 позиций 96-местной стальной MALDI мишени (Bruker Daltonics, Германия). После высыхания на образцы наслаивали по 1 мкл матрицы, представляющей собой насыщенный раствор а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Bruker Daltonics, Германия) в 50% ацетонитриле и 2,5% трифторуксусной кислоте (TFA Реагент Plus® 99%, Sigma-Aldrich ) и давали высохнуть при комнатной температуре. Масс-спектры образцов были получены на спектрометре Microflex LRF (Bruker Daltonics, Германия) с помощью программного обеспечения FlexControl 3.3 (Bruker Daltonics, Германия) в ручном режиме при мощности лазера между 29 - 33%. Положительные ионы были извлечены с мишени в режиме частоты лазера 20 Гц при ускоряющем напряжении ионного источника 1 - 20 кВ, источника 2 - 9,0 кВ в линейном режиме. Каждый отдельный спектр был получен в диапазоне масса/заряд (m/z) от 2000 до 20 000 Da и представлял собой сумму ионов, полученных от 1500 лазерных вспышек, собранных с шагом 10 и выполненных в различных регионах одной и той же лунки. Перед каждым измерением прибор калибровали с помощью бактериального тест-стандарта (БТС) (Bruker Daltonics, Германия), представляющего собой экстракт Escherichia coli DH5alpha с двумя дополнительными пиками белков РНКазы А и миоглобина. Калибровка считалась удовлетворительной в диапазоне масс-спектров белковых пиков не более ±300 ppm. Полученные отдельные спектры были проанализированы с помощью программного обеспечения FlexAnalysis версии 3.3 (Bruker Daltonics, Германия) с использованием БТС для внутренней калибровки. Равномерность созданных отдельных спектров визуально проверяли в массовом диапазоне от 2000 до 15 000 Da. Спектры с интенсивностью менее 104 орбитральных единиц и с наличия менее 60 пиков с соотношением сигнал - шум S/N >3 были исключены из дальнейшего анализа. Построение модели, валидация и статистический анализ данных: отобранные спектры референсных штаммов были загружены в программу ClinProTools 3.0 для анализа данных [7]. Предварительная обработка сырых спектров состояла из выравнивания базовой линии (алгоритм TopHat, параметр минимальной базовой ширины 10%), нормализации спектров (относительно суммарной интенсивности спектра), их рекалибровки (максимальной сдвиг пика 1000 ppm, 30% сходства по отношению к пикам калибратора и исключение спектров, не прошедших повторную калибровку), определения условий расчета средних интенсивности пиков (разрешение 800) и расчета суммарной средней интенсивности пиков в спектре (пороговый S/N=5). Формирование модели осуществлялось по 10 классам, каждый из которых соответствовал серовару референсных штаммов и состоял из набора не менее чем 16 спектров. Генерация классификационных моделей осуществлялась автоматически с использованием алгоритмов быстрого классификатора (QC), метода опорных векторов (SVM) и генетического алгоритма (GA) со следующими параметрами: не более 50 генераций, не более 60 пиков в каждой модели, частота мутаций 0,2, частота перекрестов 0,5, число соседей 3. В результате для каждой модели были получены списки из 60 пиков, входящих в состав анализируемых спектров в соответствии с выбранным алгоритмом. Дальнейший анализ суммарных масс-спектров каждого класса был осуществлен на основе списка пиков, сформированного на основе генетического алгоритма. Для формирования списка пиков и определения статистической значимости различия в интенсивности пиков применялся t тест Уэлша. Подтверждение значимости различия было проведено с использованием критерия Андерсона-Дарлинга для определения нормальности распределения, дисперсионного анализа ANOVA с использование непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05. Корреляционный анализ пиков был проведен с помощью непараметрического коэффициента корреляции Тау Кендалла с получением корреляционной матрицы, в которой каждый пик сопоставлялся с каждым другим из списка пиков. Для внешней валидации классификационной модели использовали спектры, полученные от образцов референсных штаммов при их повторном пересеве. Факторный анализ интенсивности пиков в наборах отдельных спектров, составляющих классы модели, осуществляли методом главных компонент (PCA). Результаты анализа представлены в виде трехмерных графиков, сгенерированых автоматически с помощью программного обеспечения. Кроме того, с помощью программного обеспечения Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Германия) были созданы эталонные спектры для всех исследуемых референсных штаммов путем объединения не менее 20 отдельных спектров и получения единого главного спектрального профиля (MSP) для каждого штамма. Полученные эталонные спектры были добавлены к основной библиотеке спектров (Bruker Daltonics, Германия), что позволило провести их анализ методом древовидной кластеризации в виде построения MSP дендрограммы. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Сравнение таксономического родства и меры сходства между исследуемыми штаммами лептоспир было выполнено с помощью кластерного анализа специфических пиков главных масс-спектров этих штаммов, а также MSP 3 штаммов спирохет рода Brachyspira, взятых в качестве контроля различия. Для этого созданные эталонные масс-спектры Leptospira spp. и эталонные масс-спектры спирохеты Brachyspira murdochii st.12563T DSM и двух штаммов Brachyspira pilosicoli из таксономической библиотеки Biotyper 3.1 использовали для построения дендрограммы. При построении дендрограммы числовые признаки пиков каждого из главных спектров сравнивались друг с другом, в результате чего создавалась матрица расстояний с баллами значений меры близости (расстояния Евклида) между объектами. Как видно на рис. 1, все 10 штаммов Leptospira spp. дали специфические профили. При этом все исследуемые штаммы, включая непатогенный, составили единый кластер профилей рода Leptospira, отличный от кластера MSP спирохет рода Brachyspira. Внутри группы профилей рода Leptospira отсутствовала группировка согласно таксономическим видам. При этом в кластере лептоспир наблюдалось дистанцирование профиля серовара Tarassovi, относящегося к виду L.borgpetersenii, от профилей остальных сереваров. В то же время, MSP непатогенного штамма Patoc 1 вида L.biflexa распологался на близкой дистанции от MSP всех сероваров, включающих представителей трех геномовидов патогенных лептоспир, за исключением L.borgpetersenii sv. Tarassovi. Дикриминантный анализ был проведен для нахождения различия между серова-рами лептоспир. Для этого наборы спектров всех исследуемых сероваров, каждый из которых соответствовал отдельному классу модели, были исследованы на выявление аналогий и различий в белковых пиках их профилей с помощью генетического алгоритма (GA) построения модели. Параметр кросс-валидации созданной GA модели, являющийся показателем эффективности, и параметр подтверждающей способности, являющейся показателем предсказательной способности модели, составили 99,14 и Erxhvsnn :iloi- ::l: GjcS :'jj t!i a(hrspir.j plOKflll Kffi ECO nurductri PS^ 125БЗТ DSr^ Lt r.■ Taiassnoi:: Perefalnsn L :.n Sr Pita: M P:?l < -Li 5V &|I|Htvpnnii Л McEkwa V L nl 50 Hi! mil Пи Si ■Tl.l-l I L nl fr. СнШкИа V Hood Uli^ i IV L<j. кь Sejue si. LL 50 Нл1 i_|i| l-Ajili? Lml. it L-teiOlmeinOir'-^iafc HI.RUA L nl so CDpcnhaqri st M 2. DrSlailL'P L'.'-t Рис. 1. Анализ профилей главных спектров (MSP) референсных штаммов Leptospira 8рр.методом древовидной кластеризации. Эталонные масс-спектры спирохет Brachyspira murdochii st. DSM 12563T, Brachyspira pilosicoli st.GD82 GDD и Brachyspira pilosicoli st.GD83 GDD из коммерческой базы данных использовались как контроль различия между двумя родами спирохет. 100% соответственно. В результате проведенного дискриминантного анализа программа с помощью генетического алгоритма выбрала интеграционную область, состоящую из комбинации пиков, которые являются наиболее важными для дифференциации анализируемых классов. Построенная корреляционная матрица пиков интеграционного региона показала, что коэффициенты корреляции имели или отрицательные, или небольшие абсолютные значения, что свидетельствует о противоположном значении или независимом различии площадей пиков. Индивидуальные белковые пики различия были обнаружены у сероваров Tarassovi (3764, 6173 Da), Ballum (3447 Da), Copenhageni (8364 Da), Icterohaemorrhagiae (2959, 8364 Da). Общими пиками для всех сероваров были 5221, 6701, 7013 Da, а также пики 3548 и 3895 Da, у которых значительно более высокая интенсивность наблюдалась в классе серовара Sejroe. Классы сероваров Patoc, Pomona, Canicola, Grippotyphosa и Mozdoc не имели индивидуальных дискриминантных пиков. Дополнительно для оценки исследуемых спектров был применен факторный анализ методом главных компонент (PCA), позволяющий визуализировать однородность или неоднородность белковых спектров, использованных для построения модели (рис. 2). Целью PCA являлось снижение размерности масс-спектров, полученных от различных образцов, в которых имеется большое количество взаимосвязанных переменных, а именно значения интенсивности отдельных пиков. С помощью PCA была рассчитана новая система координат в виде трехмерного графика, которая выражалась как линейная комбинация исходных переменных. При этом использовалось гораздо меньшее количество координат (основные компоненты) по сравнению с множеством переменных у исходных данных и обозначенных на графиках как PC1, PC2, PC3. Значения по осям координат соответствовали коэффициентам корреляции, каждая точка на графиках представляла собой единичный спектр. Спектры с близкими коэффициентами корреляции образовали кластеры. Как видно на рис. 2, А, серо-вары Pomona, Copenhageni и Icterohaemorrhagiae давали четкое разделение на кластеры. В то же время, серовары Patoc, Canicola, Grippotyphosa и Mozdoc, хотя и образовывали отдельные кластеры, но не имели достаточного различия в коэффициентах корреляции для удовлетворительного визуального расхождения их кластеров. На рис. 2, Б видно, что все три серовара, принадлежащие к геномовиду L.borgpetersenii, имели отдельные кластеры. При этом, в отличие от графика PCA геномовидов Рис. 2. Анализ методом главных компонент масс-спектров референсных штаммов Leptospira spp. (А) 1 - L.int. Pomona st. Pomona, 2 - L.int. Icterohaemorrhagiae st. RGA, 3 - L.int. Copenhageni st. M20, 4 - L.int. Canicola st.Hond Utrecht IV; L.k. Grippotyphosa st. Moskva V; L.bifl. Patoc st. Patoc I; L.k. Mozdoc st.5621. (Б) 1 - L.b. Tarassovi st.Perepelitsin, 2 - L.b. Sejroe st. M 84, 3 - L.b. Ballum st. Mus 127, 4 - L.bifl. Patoc st. Patoc I. L. interrogans и L. kirschneri, на графике PCA геномовида L.borgpetersenii имелось четкое визуальное разделение кластеров Ballum, Sejroe и Tarassovi относительно кластера серовара Patoc. Для внешней валидации разработанной GA модели использовали спектры, полученные от образцов экстрактов тех же самых референсных штаммов при их повторном пересеве через полгода. Результаты внешней валидации показали, что правильное отношение к своему классу имели все спектры, за исключением половины спектров, полученных от сероваров Pomona и Canicola. ОБСУЖДЕНИ Е В исследование были включены определенные патогенные штаммы Leptospira, а именно те, которые входят в международный набор референс-штаммов лептоспир для постановки РМА [1]. Они были представлены девятью сероварами, относящимися к трем геномовидами L.interrogans (4 серовара), L.borgpetersenii (3 серовара), L. kirschneri (2 серовара). Кроме того, в качестве дополнения к ним был исследован непатогенный штамм Patoc 1, относящийся к геномовиду L.biflexa. Это дополнение было обусловлено данными, что штамм Patoc 1 имеет перекрестную антигенную реактивность с некоторыми штаммами, относящимися к патогенным серогруппам [9]. Дендрограмма главных белковых профилей референсных штаммов лептоспир и MSP эталонных спектров штаммов спирохеты рода Brachyspira spp. подтверждает таксономическое родство между всеми исследованными штаммами Leptospira spp. и свидетельствует об отличии их от Brachyspira spp. Однако на дендограмме видно очень небольшое различие в баллах евклидового расстояния между главными спектрами в кластере лептоспир, что свидетельствует о значительной мере близости исследованных штаммов, за исключением серовара Tarassovi. Существует гипотеза, что пики масс-спектров представлены белками, преимущественно рибосомального происхождения [12]. Поэтому можно предположить, что исследованные патогенные штаммы и непатогенный штамм Patoc 1 имеют очень близкое эволюционное родство. Однако основное отличие патогенных штаммов лептоспир состоит в наличии на наружной мембране липопротеинов LipL32 и LipL41, которые, по-видимому, отсутствуют в получаемых клеточных экстрактах, и пики этих липопротеинов не участвуют в формировании классификационных моделей. С другой стороны, перекрестная серологическая реактивность серовара Patoc с патогенными лептоспирами обусловлена схожестью их полисахаридных O-антигенов, входящих в состав липополисахаридов клеточных стенок лептоспир. Можно предположить, что используемый метод экстракции с применением этанола позволяет выделять не только рибосомальные белки, но и сохранять целостность и присутствие полисахаридов в образцах, что может оказывать непосредственное влияние на получаемые пики в масс-спектрах. Програмное обеспечение ClinProTools предоставляет возможность генерировать классификационные модели из большого числа спектров относительно быстрым и гибким способом. Модели строятся для того, чтобы определить общие показатели в спектрах каждого класса модели таким образом, что испытуемые спектры, например, полученные от клинических изолятов бактерий, могли бы быть классифицированы по этой модели. В нашем исследовании каждый класс модели был представлен различными сероварами лептоспир, а испытуемые спектры были получены от повторного пересева тех же штаммов, которые вошли в построение модели. ClinProTools обеспечивает ряд весьма сложных математических алгоритмов, которые генерируют модели для различного типа. Нами была выбрана модель на основе генетического алгоритма, так как он имитирует эволюцию в природе и используется для выбора комбинации пиков, которые наиболее актуальны для разделения. В нашем исследовании программа ClinProTools автоматически выбрала 11 пиков с наибольшей силой разделения сероваров и включила их как интеграционный регион в созданную модель. Полученную модель мы подвергли верификации, используя для этого спектры, полученные от повторного пересева культур, для того чтобы определить способность этой модели правильно распознавать спектры референсных штаммов при их повторных исследованиях. Полученная матрица неточностей показала 100% сходимость во всех классах, за исключением классов сероваров Pomjna и Canicola, в которых 50% спектров классифицировались как серовар Patoc. Такое расхождение можно объяснить тем, что распознавательная способность процесса внешней валидации, при которой группы пики не усредняются, может отличаться от расчета усредненных пиков при генерации модели. Эти результаты свидетельствуют, что 11 пиков, вошедших в модель, могут служить в качестве маркерных белков для дифференциации сероваров. Дальнейшие исследования по определению этих белков будут способствовать лучшему пониманию различий между масс-спектрами патогенных и непатогенных штаммов лептоспир. Таким образом, примененный нами метод MALDI-TOF масс-спектрометрии в сочетании с построением классификационной модели при помощи программы ClinProTools для дифференциации референсных штаммов лептоспир может быть полезным инструментом для внутрилабораторного контроля постоянства пересеваемых культур лептоспир. Полученные результаты обосновывают перспективность исследования, направленного на применения метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для диагностики лептоспироза.

About the authors

E. V Zyeva

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

N. A Stoyanova

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

N. K Tokarevich

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

A. Totolyan Areg

Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology

References

Supplementary files