PERSISTENCE OF MYCOPLASMA DURING UROLITHIASIS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Микоплазмы - представители класса Mollicutes являются мельчайшими способными к свободному существованию бактериями. В организме человека обитают, по крайней мере, 16 видов микоплазм, 7 видов - в урогенитальном тракте, 4 вида из них патогенны для человека: Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum [4]. M. hominis с высокой частотой обнаруживают во влагалище и цервикальном канале при бактериальном вагинозе и воспалительных заболеваниях урогенитального тракта (УГТ). Многократно описаны случаи острого и хронического пиелонефрита, вызванного M. hominis [12]. Исследователи считают, что хронический пиелонефрит может развиться в результате проникновения микоплазм в почки из очагов инфекции нижних отделов УГТ. Описаны пороки развития плода при внутриутробном инфицировании его этой микоплазмой [4]. Уреаплазмы вызывают острый и хронический уретриты, септический артрит, передающийся половым путем на фоне гамаглобулинемии, и являются причиной рождения детей с низкой массой тела и пороками развития респираторного тракта [4]. Специфическое свойство уреаплазм - наличие уреазной активности может являться провоцирующим фактором в камнеобразовании. В работах 70 - 80 гг. ХХ в показано образование камней в почках крыс при их экспериментальном заражении U. urealyticum в почку или мочевой пузырь. Камни образовывались у 60% животных уже на 4 - 5 день инфекции. Заражение крыс M. hominis также приводило к образованию камней в мочевом пузыре у 10% животных через 6 недель после заражения. Процесс можно было предотвратить или приостановить с помощью доксициклина. Было показано также, что U. urealyticum может быть выделена из камней и мочи 13% пациентов с метаболическими камнями в сравнении с 30% пациентов с инфекционными камнями [7, 13]. Однако в более поздних исследованиях не удалось получить убедительных доказательств камнеобразования под действием уреаплазм. Уреаплазмы, также как M. hominis, часто обнаруживают в тканях предстательной железы при хроническом простатите. Наиболее выраженное патогенное действие из всех перечисленных микоплазм оказывает M. genitalium [8, 9, 11]. Она вызывает хронический и острый негонококковый уретрит, занимая по частоте выявляемости при этой патологии второе место после хламидий. Все указанные выше виды микоплазм могут участвовать в развитии смешанных инфекций. Однако за длительный период их изучения получены убедительные доказательства, что они сами по себе могут вызывать широкий спектр заболеваний, при которых другие инфекционные агенты не выявляются. Микоплазмы способны прикрепляться к любым клетках микроорганизма, в том числе к эритроцитам и лимфоцитам. С током лимфы и крови они разносятся по органам и тканям, вследствие чего развивается генерализованная микоплазменная инфекция. Генерализация инфекционного процесса - одна из особенностей микоплазменных инфекций [3]. Другой особенностью является длительная персистенция возбудителя в тканях инфицированного организма [5]. Их выделение при персистентных инфекциях часто затруднительно. Из-за малого размера генома и отсутствия ряда ферментных систем микоплазмы нуждаются в биосинтетических предшественниках аминокислот и ДНК, стероидах и жирных кислотах. Несмотря на трудности их выделения из организма, их роль в хронизации инфекции респираторного тракта и УГТ общепризнана. Тем не менее, для диагностики микоплазменных инфекций рекомендуется использовать не только культуральный, но и современные серологические и молекулярно-генетические методы. В наибольшей степени это относится к M. genitalium, выделение которой из организма представляет наибольшие трудности, и диагноз инфекции осуществляется только на основании данных ПЦР [10]. Целью работы явилось изучение возможной патогенетической роли микоплазм в развитии постоперационных осложнений при мочекаменной болезни (МКБ). Задача первого этапа исследований - определение частоты выявления представителей семейства Mycoplasmataceae в клиническом материале, полученном непосредственно в ходе оперативного вмешательства. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинический материал для исследования был получен из урологического отделения клинической больницы им. С.П. Боткина Москвы. От 31 больного исследовали: образцы свежевыделенной мочи и мочи, полученной при катетеризации из почечной лоханки, образцы сыворотки крови и мочевые камни, извлеченные при проведении чрескожной контактной нефролитолапаксии (дробление и извлечение камня из почки под визуальным контролем с помощью нефроскопа). Этот метод позволяет предотвратить контаминацию камня посторонней бактериальной флорой. Всего было исследовано 124 пробы. Наличие микоплазм в пробах определяли культуральным, серологическим (РАГА) и молекулярно-генетическим (ПЦР) методами. Для выделения микоплазм из клинического материала использовали коммерческую питательную среду Difco PPLO агар (1,3%) с добавлением 20% сыворотки крови лошади, 1% L-аргинина (для аргининзависимых видов) или 0,05% мочевины (для уреаплазм) и 1000 ЕД/мл пенициллина. Уреаплазмы выращивали в бульоне той же прописи. Для посева материала почечного камня его стерильно растирали в ступке в небольшом количестве физиологического раствора. Чашки и пробирки с посевами инкубировали при температуре 37°С до 14 дней, каждые два дня контролируя рост бактерий. При появлении специфического роста или подозрении на него проводили пассирование колоний на чашках с аналогичной питательной средой. Принадлежность выделенных культур к микоплазмам и уреаплазмам подтверждали с помощью ПЦР. Для определения сопутствующей бактериальной флоры раздробленные камни помещали в LB-бульон и инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С с аэрацией. Выращенные бульонные культуры высевали на агаровые селективные среды (среда Эндо, кровяной агар, энтерококковый агар, стафилококковый агар, среда Сабуро) и получали чистые культуры. Выросшие микроорганизмы идентифицировали до вида с помощью биохимического тестирования. Образцы клинического материала исследовали на наличие в них ДНК M. hominis, M. genitalium и U. spp. методом ПЦР. Для этого были использованы лицензированные тестсистемы (ООО «ИнтерЛабСервис»). Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-сорбВ», предназначенного специально для работы с клиническим материалом. Для выявления ДНК использовали следующие тест-системы: АмплиСенс Mycoplasma hominis, АмплиСенс Mycoplasma genitalium, АмплиСенс Ureaplasma spp. (тест-система, обнаруживающая одновременно U. urealyticum и U. parvum) и универсальную тест-систему «МИК-КОМ», выявляющую ДНК микоплазм. ПЦР ставили согласно прилагаемым к тестсистемам методическим инструкциям. Детекцию продуктов амплификации проводили в агарозе с помощью электрофореза. Антигены клеток микоплазм в пробах сыворотки крови выявляли в реакции агрегатге-магглютинации (РАГА) по методике, разработанной в ФНИЦ им. Н.Ф. Гамалеи [4]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ При исследовании клинического материала от 31 больного культуральным методом микоплазмы были выделены в образцах от 8 человек (28,8%). Всего было получено 23 культуры микоплазм, идентифицированные методом ПЦР как M. hominis. В 5 случаях микоплазма была выделена из камня, в 5 - из свежевыделенной мочи, в 8 - из мочи лоханки и в 5 случаях - из сыворотки крови больных. Выделить уреаплазмы ни в одном случае не удалось. Все выделенные культуры микоплазм были представлены в виде чрезвычайно мелких светопреломляющих колоний («мини-колонии») значительно менее 10 мкм в диаметре, обнаруживаемых только с помощью светового микроскопа при увеличении х125. Ни в одном случае мы не наблюдали типичных «fried-egg» колоний. Рост был скудным, колонии пассировались с трудом, иногда после 3 - 4 пассажей погибали, иногда, по-видимому постепенно адаптируясь к среде, успешно перевивались. Но и при пассировании в течение нескольких месяцев морфология колоний не подвергалась изменениям, реверсии к классическим для этого вида колониям ни разу не наблюдали. Заметим, что и из образцов мочевых камней микоплазма вырастала также только в виде «мини-колоний». Результаты исследования клинических образцов методом ПЦР показали, что из 31 обследованного больного ДНК микоплазм выявлена у 25 человек (80,6%). ДНК микоплазм чаще всего обнаруживали в мочевом камне 21(84%), моче лоханки 9(36%), свежевыделенной моче 14(56%), реже - в сыворотке крови 8 (32%). Анализ видового состава выявленных микоплазм показал, что M. hominis тестировали наиболее часто 12(48%). Также выявлена ДНК M. genitalium 1(4%), ДНК U. spp. 1(4%) и ДНК нескольких возбудителей 8 (32%). В трех случаях была выявлена ДНК, которую не удалось идентифицировать имеющимися у нас моно тест-системами. Всего из 124 изученных клинических образцов ДНК разных видов микоплазм была обнаружена в 52 случаях. Образцы сыворотки крови 14 пациентов исследованы методом РАГА на наличие в них антигенов M. hominis. Положительные результаты получены в 8 случаях, причем в шести из них они коррелировали с результатами ПЦР и культурального метода. В нашей недавней работе (Романова Ю.М. и др., 2015) было высказано предположение, что микоплазмы могут принимать участие в образовании биопленок на мочевых камнях. Для проверки этого предположения было проведено исследование сопутствующей бактериальной флоры камней от 27 больных. Результаты показали, что 10 камней (37%) были инфицированы следующими бактериями: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Candida albicans, Enterococcus faecalis, Streptococcus spp. В 17 камнях бактерии обнаружены не были. Как ранее было показано, все выделенные бактерии обладали уреазной активностью и были способны формировать биопленку. При изучении материла этих камней (27 образцов) на наличие в них микоплазм методом ПЦР установили, что из 10 камней, инфицированных бактериями, ДНК микоплазм была выявлена в 6 (60%) случаях, а из 17 неинфицированных - в 11 (64,7%). Одновременно культуральным методом микоплазмы в виде «мини-форм» были выделены в 5 случаях, причем только из неинфицированных бактериями камней. Из инфицированных камней микоплазмы выделить не удалось. ОБСУЖДЕНИЕ При обследовании клинического материала, полученного от 31 пациента культуральным методом, микоплазмы были выделены от 8 (28,8%) пациентов. Частота выявления ДНК микоплазм была значительно выше - от 25 пациентов (80,6%). Разницу в полученных данных можно объяснить трудностями выделения микоплазм из клинического материала при персистентных инфекциях, а также возможной потерей способности расти в отсутствии эукариотической клетки, в результате длительного паразитизма, т.е. переходом в некультивируемое состояние. На такую возможность указывают Baseman J.B. и Tully J.G. [5]. Известно также, что ПЦР выявляет не только нативную ДНК, но и ее фрагменты, поэтому эту реакцию не рекомендуют использовать для контроля излеченности после антибиотикотерапии. Следует заметить, что в предоперационном периоде и во время операции больные получали антибиотики. Выделение микоплазм из проб сывороток крови свидетельствует о генерализованном характере микоплазменной инфекции. Известно, что в формировании очагов инфекции при различных хронических рецидивирующих инфекционных заболеваниях важную роль играют биопленки [1]. В нашей недавней работе (Романова Ю.М. и др., 2015) было показано, что микроорганизмы, инфицирующие почки, могут существовать в биопленке. В некоторых случаях с помощью ПЦР и электронной микроскопии в составе биопленки были обнаружены единичные клетки микоплазм. Данных о способности микоплазм образовывать биопленки на различных поверхностях в литературе нет. Можно предположить, что они могут входить в состав бактериальной биопленки и, возможно, в некоторой степени участвовать в ее формировании, тем более что клетки некоторых видов микоплазм имеют капсулу или окружены капсулоподобным веществом, содержащим полисахаридный комплекс. Полученные нами данные свидетельствуют однако о том, что микоплазмы могут существовать в мочевых камнях при отсутствии других бактерий, при этом в виде моноинфекции даже несколько чаще, чем в составе смешанной бактериальной популяции. Особое внимание заслуживает факт персистенции микоплазм в моче и мочевых камнях в виде клеток, образующих «мини-колонии». Такие культуры никогда не реверсировали в классические «fried-egg» формы. Подобное явление мы отмечали ранее [2] при посеве крови пациентов с персистентной урогенитальной микоплазменной инфекцией. В системе in vitro при контакте клеток микоплазм с гипериммунной антисывороткой мы наблюдали образование таких форм. При контакте клеток микоплазм с мочой от инфицированных и неинфицированных ими пациентов подобного явления не наблюдали. Было высказано предположение, что образование «мини-форм» происходит под воздействием гуморальных факторов иммунной системы. Образование «мини-форм» демонстрирует феномен широкой изменчивости микоплазм и существование неизвестной ранее формы их персистенции в различных очагах в организме человека.

About the authors

O. I Barkhatova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

G. A Levina

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

I. V Rakovskaya

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

N. S Mulabaev

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

N. A Gamova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

E. R Tolordava

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

Yu. M Romanova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Botkin City Clinical Hospital

References

Supplementary files