NTIBIOTICS SENSITIVITY OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS, PSEUDOMONAS AERUGINOSA AND BACTERIA OF BURKHOLDERIA CEPACIA COMPLEX, PERSISTING IN LUNGS OF PATIENTS WITH MUCOVISCIDOSIS (MV)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Продолжительность жизни у больных муковисцидозом (МВ) зависит от тяжести течения хронической персистентной легочной инфекции. При этом инфекция может быть обусловлена одним возбудителем, а также может иметь смешанный характер в виде ассоциаций таких возбудителей как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia complex (Bcc) и др. [4]. Такая инфекция, как правило, представляет собой значительно большую проблему для врачей, чем моноинфекция, так как трудно поддается лечению и способствует постепенному ухудшению функции легких. При длительной персистенции в дыхательных путях больного в условиях постоянного стресса, обусловленного воздействием антибиотиков, иммунной системы хозяина, дефицита кислорода и питательных веществ, микроорганизмы подвергаются адапта-тивной эволюции, обусловленной ускоренным мутагенезом и горизонтальным переносом генов, приспосабливаются к условиям существования, приобретая патогенетическое и эпидемическое значение для больных МВ. В связи с этим, ограничение колонизации дыхательных путей больных МВ микроорганизмами, имеющими патогенетическое значение, предупреждение формирования персистентной инфекции - первичная эрадикация возбудителя и предотвращение обострения инфекционного процесса - основные направления борьбы с инфекционными осложнениями при МВ. Основное значение при этом имеет правильная антибактериальная терапия, которая способствует замедлению темпа прогрессирования легочных поражений, оказывая положительное влияние на прогноз заболевания. Выбор антибиотика при этом определяется видом микроорганизма и его чувствительностью к антибиотикам. Цель работы - изучить спектр резистентности к антибиотикам и его изменчивость у бактерий видов S. aureus, P. aeruginosa и Всс, персистирующих в дыхательных путях больных МВ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследовали антибиотикочувствительность 260 штаммов S. aureus, выделенных от больных МВ детей и 52 штаммов S. aureus от взрослых, 163 штаммов P. aeruginosa от больных МВ детей и 50 штаммов P. aeruginosa от взрослых, 156 штаммов Bcc от детей и 30 от взрослых. Мониторинг антибиотикочувствительности проводили у штаммов, выделенных от 30 больных с хронической S. aureus инфекцией, от 22 больных с хронической Всс инфекцией и от 21 больного с хронической синегнойной инфекцией. Интервал мониторинга составил от 14 дней до 5 лет 7 месяцев. Определение чувствительности к антибиотикам осуществляли на среде Мюллера-Хинтона с использованием диско-диффузионного метода согласно МУК 4.2.1890-04 и систем АТВ STAPH 5 и ATB PSE 5 фирмы BioMerieux. Ген mecA идентифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров МecA-F 5'-ACT GCT АТС САС ССТ САА АС-3 и МecA-R 5'-CTG GTG AAG TTG ТАА ТСТ GG-3 согласно методическим рекомендациям [2]. Выявление генов интеграз на основе ПЦР осуществляли по методике [10]. Генотипирование штаммов проводили методом RAPD-ПЦР со случайным олигонуклеотидным праймером размером 10 нуклеотидов Sh1 (Short 1) - AATCGGGCTG [1]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Исследование антибиотикорезистентности штаммов S. aureus показало, что 35% штаммов от детей и 33,3% штаммов от взрослых больных были мультирезистентными. К ампициллину были устойчивы 70,1%, к амоксициллину - 13,3%, к оксациллину - 8,0%, к цефалексину - 2,8%, к цефотаксиму - 4,3%, к гентамицину - 15,8%, к доксициллину - 6,53%, к эритромицину - 31,5%, к азитромицину - 33,7%, к офлок-сацину - 2,3%, к норфлоксацину - 13,1%, к линкомицину - 16,5%, к бисептолу - 9,2%, к левомицетину - 21,0%, к левофлоксацину - 8,1%, к рифампицину - 2,3%, к фурадонину - 0,8%, к фузидиевой кислоте - 1,2%, к ванкомицину - 1,15% штаммов, выделенных от детей. К препаратам выбора при MRSA инфекции тейкопланину и хинупристину/дальфопристину были устойчивы 1,2% штаммов, к ванкомицину чувствительны были все штаммы. Штаммы, выделенные от взрослых, были устойчивы к ампициллину - 33%, к амоксициллину - 5,8%, к оксациллину - 3,5%, к цефалексину - 2,0%, к цефотаксиму - 2,0%, к гентамицину - 3,8%, к доксициллину - 2,0%, к эритромицину - 34,6%, к азитромицину - 32,6%, к офлоксацину - 7,7%, к норфлоксацину - 9,6%, к линкомицину - 9,6%, к бисептолу - 9,2%, к левомицетину - 23,0%, к левофлоксацину - 5,8%, к рифампицину - 3,8%. К фурадонину и ванкомицину не было обнаружено резистентных штаммов. Установлено, что у всех штаммов резистентность к оксациллину была обусловлена наличием гена mecA. Микробиологический мониторинг хронической стафилококковой инфекции у 30 больных МВ показал, что только у 5 (16,6%) больных изолят, выделенный на позднем этапе мониторинга, был генотипически идентичен ранее выделенному, что может свидетельствовать о персистенции данного клона в дыхательных путях больного. Только у одного больного из 5 персистентная инфекция была обусловлена мультирезистентным клоном MRSA (табл.). В более чем 80% случаев, вероятно, происходила элиминация первоначального клона и повторная колонизация клоном, в связи с чем «ранние» и «поздние» штаммы были генотипически отличны друг от друга и имели различные спектры устойчивости к антибиотикам. Изменчивость антибиотикочувствительности у персистирующих клонов S. aureus № Ампи циллин Бисептол Гента мицин Эритро мицин Клиндамицин Тетра циклин Ванкомицин Тейкопланин Рифампицин Норфлоксацин Левофлоксацин Фузидиевая к-та Хинупристин Оксациллин 006 S S R R S S S S I R S I S S 018 S S S S S - S - S S S - - S 016 R S R S R S S S S S S S S S 124 R S R S S S S S S S S S S S 039 R S R R R I S S S R R S S R 171-1 R S R R R - S S S S S S S R 060 R S R S S S S S S R S S S S 073 R S I S S S S S S S S S S S 083 R S I R S S S S S S S S S S 256 R S S S S - S - S S S - - S Исследование антибиотикограмм генотипически идентичных штаммов, выделенных от одного больного на разных этапах, показало изменение антибиотикочувствительности. В одном случае наблюдали разную чувствительность к гентамицину, эритромицину, норфлоксацину: резистентность менялась на чувствительность (интервал выделения составлял 14 дней). В одном случае наблюдали потерю резистентности к клиндамицину (интервал - 3 мес), в одном - потерю резистентности к норфлоксацину и левофлоксацину (интервал 6 месяцев), в одном - к норфлоксацину (интервал 14 дней), в одном - к эритромицину (интервал 9 месяцев) (табл.). Изучение чувствительности к антибиотикам штаммов P. aeruginosa показало, что 37% штаммов от детей и 46% штаммов от взрослых больных были мультирезистентными. К ампициллин-сульбактаму были устойчивы 82 % штаммов, к имипенему - 25%, к меропенему - 18%, к азлоциллину - 24%, к цефотаксиму - 59%, к цефтази-диму - 15%, к цефепиму - 25%, к цефтриаксону - 36%, к гентамицину - 36%, к азитромицину - 58%, к офлоксацину - 21%, к ципрофлоксацину - 18%, левомице-тину - 72%, к левофлоксацину - 18%, к тобрамицину - 22%, к фосфомицину - 16%, к котримоксазолу - 79%, к пиперациллину - 8%, к пиперациллин-тазобактаму - 3%, к колистину не было обнаружено резистентных штаммов, выделенных от детей. Штаммы, выделенные от взрослых, были устойчивы к имипенему - 34%, к азлоциллину - 34%, к цефотаксиму - 70%, к цефтазидиму - 14%, к цефепиму - 46%, к цефтриаксону - 50%, к гентамицину - 8%, к азитромицину - 86%, к офлоксацину - 14%, к ципрофлоксацину - 8%, к левомицетину - 74%, к левофлоксацину - 18%, к тобрамицину - 10%, к фосфомицину - 4%. Микробиологический мониторинг хронической синегнойной инфекции у 21 больного МВ показал, что у 17 (81%) больных изолят, выделенный на позднем этапе мониторинга, был генотипически идентичен ранее выделенному. То есть наблюдали персистенцию одного клона в дыхательных путях больного. Доказана длительная персистенция до 6 лет 7 мес. У 19% персистентная инфекция была обусловлена разными генотипами, сменяющими друг друга. При этом в одном случае наблюдали замещение «раннего» клона клоном, резистентным к большему количеству антибиотиков, в 2 - к меньшему количеству антибиотиков и в 4 случаях - резистентным к одинаковому количеству антибиотиков. Генотипически идентичные штаммы P. aeruginosa, выделенные от одного больного в разные периоды, также характеризовались изменением антибиотикочувствительности. Например, если «ранний» изолят был резистентен только к двум антибиотикам, то изолят, выделенный через 6 лет, генетически идентичный с «ранним» изолятом, проявлял резистентность к 9 антибиотикам. Это еще раз доказывает, что в процессе персистенции микроорганизмы становятся более резистентными. Только у одного больного штамм, выделенный с интервалом в 5 лет, имел одинаковую чувствительность ко всем исследуемым антибиотикам. Приобретение резистентности у штаммов наблюдали по отношению к цефепиму, цефтазидиму, офлоксацину, ципрофлоксаци-ну, хорамфениколу, гентамицину, левофлоксацину, фосфомицину в 1 случае, к ими-пенему и азитромицину - в 3, к цефепиму - в 4, к азлоциллину и цефтриаксону - в 5, цефотаксиму - в 6 случаях. По отношению к тобрамицину не наблюдали формирования резистентности в течение мониторинга. Некоторые изоляты проявляли чередование резистентности и чувствительности по отношению к имипенему, азлоциллину, цефепиму, азитромицину и офлоксацину. Наблюдали также потерю резистентности к гентамицину и ципрофлоксацину в 1 случае, имипенему, цефтази-диму и офлоксацину - в 2, цефепиму, цефтриаксону, азитромицину, хлорамфенико-лу и левофлоксацину - в 3 случаях. Как и в случае со стафилококковой инфекцией, наблюдали одновременное инфицирование двумя и/или тремя клонами P. aeruginosa, характеризующимися разными антибиотикограммами. Изучение спектра чувствительности к антибиотикам штаммов Всс, выделенных от больных МВ, показало, что все штаммы являются мультирезистентными. Установлено, что все штаммы резистентны к амикацину, гентамицину, тобрамицину и имипенему. К ко-тримоксазолу резистентны 88,6%, к хлорамфениколу - 58,7%, к цефепиму - 80,8%, к цефоперазону - 76,5%, к ципрофлоксацину - 85,5%, к цефри-аксону - 60,8%, к меропенему - 14,1%, цефтазидиму - 17,9% штаммов; 90,9% штаммов Всс были чувствительны к комбинированному антибиотику пиперациллин-тазобактаму. Микробиологический мониторинг позволил установить, что во всех случаях Всс инфекция у больных МВ была персистентной. При этом штамм, выделенный в начале мониторинга, был генетически идентичен штамму, выделенному в конце мониторинга. Доказана длительная (до 5 лет 7 мес.) персистенция штаммов Всс в легких больного МВ. При этом у всех больных, кроме одного, Всс инфекция была обусловлена одним штаммом. У одного больного наблюдали коинфекцию 2 разными клонами. Мониторинг антибиотикочувствительности штаммов, выделенных от одного больного в разные периоды, показал, что у штаммов, выделенных многократно от 9 больных в разные периоды хронической инфекции, антибиотикограмма не менялась, несмотря на длинный интервал между периодами выделения штаммов (3 года 7 мес). У 14 больных штаммы, выделенные в разные периоды, проявляли разную чувствительность по отношению к некоторым антибиотикам. У 4 больных наблюдали приобретение штаммами резистентности по отношению к цефтазидиму - антибиотику, вероятно, наиболее часто применяемому при лечении МВ. У 2 больных «поздние» штаммы B^, в отличие от ранее выделенных, были резистентны к цефепиму, у 3 - к хлорамфениколу, у 2 - к ко-тримоксазолу. У некоторых больных более поздние штаммы, наоборот, потеряли резистентность по отношению к конкретному антибиотику. Например, у 3 больных штамм, выделенный в начале мониторинга, был резистентен к меропенему, а в конце - чувствителен. То же самое наблюдали у 3 больных по отношению к хлорамфениколу, у 2 больных - к цефепиму и у 1 - к цефтазидиму. При этом интервал между выделенными штаммами составлял от 3,5 до 5 лет 7 месяцев. У 1 штамма потеря резистентности к меропенему и цефепиму сопровождалась приобретением резистентности к хлорамфениколу и цефтазидиму. Также у другого штамма потеря резистентности к бисептолу и хлорамфениколу сопровождалась приобретением резистентности к цефтазидиму. Самый короткий интервал времени, зафиксированный нами, при котором генетически идентичные штаммы проявляли разную чувствительность к антибиотикам - 14 дней, когда у 2 больных штамм, выделенный до начала лечения антибиотиками, был чувствителен к бисептолу, а штамм, изолированный через 14 дней, был резистентен. При этом в одном случае с помощью ПЦР в «позднем» изоляте нами был обнаружен ген интегразы IntI, являющейся частью ин-тегрона - потенциального мобильного генетического элемента, способного к захвату участка чужеродной ДНК, то есть интегрированию и экспрессии генов антибиотикорезистентности. ОБСУЖДЕН И Е Таким образом, исследование антибиотиочувствительности штаммов S. aureus, P. aeruginosa и Всс показало, что 35 и 33,3% стафилококковой инфекции у детей и взрослых соответственно, 37 и 46% синегнойной инфекции у детей и взрослых соответственно, 100% Всс инфекций были обусловлены мультирезистентными клонами. При этом наибольший процент штаммов S. aureus был чувствителен к цефалексину, цефо-таксиму, офлоксацину, рифампицину, ванкомицину, тейкопланину, хинупристину/ дальфопристину. Штаммы синегнойной палочки были чувствительны к имипенему, меропенему, азлоциллину, цефтазидиму, офлоксацину, ципрофлоксацину, левофлок-сацину, тобрамицину, фосфомицину, пиперациллину, пиперациллин-тазобактаму и колистину. Штаммы Всс были чувствительны к комбинированному антибиотику пиперациллин-тазобактаму. Среди S. aureus MRSA составляли 8% у детей и 13,5% у взрослых. При этом резистентность во всех случаях была обусловлена наличием гена mecA. С клинической точки зрения важно дифференцировать штаммы, имеющие ген mecА, обусловливающий резистентность ко многим антибиотикам, от штаммов с другими механизмами резистентности. При стафилококковых инфекциях, вызванных штаммами с геном mecА, терапия бета-лактамными антибиотиками неэффективна. Кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков, за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин). Надо отметить, что резистентность может быть также обусловлена гиперпродукцией Р-лактамазы BOR-SA (borderline S. aureus) либо новой, модифицированной способностью связывания пенициллина (MOD-SA), или наличием гена mecQ то есть нового варианта гена mecА, идентичность которого с mecА составляет примерно 70%. Это необходимо учитывать при исследовании на метициллин-резистентность молекуярно-генетическими методами. Ранее нами было показано, что у 24,2% больных независимо от проведенного лечения наблюдали персистентную инфекцию, вызванную золотистым стафилококком [3]. При этом, только у 17% больных инфекция была обусловлена персистенцией в легких S. aureus одного генотипа. Вероятно, это связано с эрадикацией «раннего» клона и заменой его «поздним» клоном. В случае с синегнойной инфекцией эффект антибиотикотерапии был у 58,8% больных, в остальных случаях наблюдали хроническую персистентную инфекцию. При этом у 81% больных инфекция была обусловлена длительной персистенцией одного клона. У 19% больных, вероятно, происходила элиминация первоначального клона и повторная колонизация клоном, который генотипически отличался от «раннего» клона и имел другой спектр устойчивости к антибиотикам. Элиминации Всс при антибиотикотерапии не наблюдали. Случаи с отсутствием высева Всс, описанные нами, вероятно, были связаны с переходом микроорганизмов в некультивируемую форму [3]. Наши данные показывают, что нет выраженной корреляции между антибиотикорезистентностью штаммов S. aureus и их персистенцией. Механизм персистенции, вероятно, связан с внутриклеточной локализацией микроба, где он защищен от антибиотиков и иммунной системы хозяина, и образованием биопленки. Более того, у S. aureus «поздние» изоляты были менее резистентными, чем «ранние». В отличие от S. aureus у персистирующих клонов P. aeruginosa наблюдали в большинстве случаев приобретение резистентности к антибиотикам. У штаммов Всс также наблюдали в процессе персистенции как приобретение, так и потерю резистентности по отношению к определенным антибиотикам. Разную чувствительность к антибиотикам у генетически идентичных штаммов, персистирующих в легких больного, можно объяснить несколькими механизмами - фенотипической гетерогенностью, приобретением резистентности, потерей резистентности, а также способностью микроорганизмов защищаться от антибиотиков благодаря внутриклеточной локализации и образованию биопленок. Фенотипическая гетерогенность - это проявление разного фенотипа у разных бактериальных клеток одного клона, имеющих одинаковый набор генов. Она имеет адаптивное значение и гарантирует выживание субпопуляции, хорошо подготовленной к изменениям окружающей среды. Способность образовывать фенотипически неоднородную клональную популяцию клеток (разную антибиотикочувствительность), направленную на выживание и размножение в разнообразной и меняющейся окружающей среде, микроорганизмы приобрели в процессе эволюции. В англоязычной литературе данное явление принято называть «bet hedging» («страховка ставок»), то есть выбор стратегии выживания [8] Исследования Foweraker J.E. et al. также показали, что штаммы P.aeruginosa, взятые из разных, но имеющих одинаковый вид на среде культивирования колоний, относящиеся к одному генотипу, могут проявлять различную чувствительность к антибиотикам [5]. Проявление резистентности к тому или иному антибиотику зависит от многих факторов, в частности, от того, когда выделен штамм, в начале обострения, во время обострения, после антибиотикотерапии или в стабильном клиническом состоянии [7], какими антибиотиками лечился больной в данный период времени. При этом работает сложная схема направленной регуляции экспрессии генов, определяющих чувствительность к антибиотикам [9]. Потерю резистентности к антибиотику можно объяснить удалением гена, определяющего резистентность, из генома бактерии. Предполагается, что бактерии могут потерять ген резистентности и, соответственно, резистентность, если частота воздействия на них конкретного антибиотика будет уменьшена. Это, вероятно, наблюдается в случае с персистирующими золотистыми стафилококками. Приобретение и сохранение антибиотикорезистентности может зависеть от частого воздействия на популяцию бактерий антибиотиков, особенно в неингибирующих концентрациях. Данный процесс элиминирует бактерии, которые чувствительны к антибиотику, и увеличивает процент устойчивых к данному антибиотику бактерий. Приобретение Всс резистентности к бисептолу в нашем случае можно объяснить обнаружением в «позднем» изоляте гена интегразы IntI, который является частью интегрона, способного к захвату участка чужеродной ДНК, то есть интегрированию и экспрессии генов антибиотикорезистентности. Интегроны способны передаваться в результате горизонтального переноса генов от одного штамма к другому, играют ключевую роль в распространении генов устойчивости к лекарственным препаратам, а также в эволюции бактериальных геномов. В нашем случае, вероятно, в условиях стресса штамм в результате горизонтального переноса генов приобрел интегрон вместе с геном sulI, кодирующим резистентность к бисептолу. Важна также в появлении антибиотикорезистентности роль мутаций. При этом мутация обычно происходит в генах, кодирующих мишени действия антибиотика, системы эффлюкса, пориновые каналы. Мутации в генах mutS и mutL, которые являются основными генами системы MMR (methyl-directed mismatch repair - система восстановления несоответствий), приводят к возникновению гипермутабельного фенотипа, особенно в персистирующих клетках. Гипермутабельные клоны имеют преимущество, так как обладают высокой адаптационной способностью к окружающим условиям [6]. Устойчивость к антибиотикам может быть обусловлена способностью бактерий формировать биопленку и невозможностью проникновения антимикробного препарата в матрицу биопленки. Биопленки дают возможность микроорганизмам пер-систировать в организме хозяина и вызывать хроническую инфекцию. По нашим данным около 60% штаммов P. aeruginosa и более 83% штаммов Всс, выделенных от больных МВ, обладали выраженной способностью к формированию биопленки. Таким образом, персистирующие микроорганизмы представляют собой так называемый эволюционный резервуар, из которого образуются резистентные микроорганизмы уже со стойкими наследуемыми генетически обусловленными механизмами резистентности.

About the authors

L. R Avetisyan

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

M. Yu Chernukha

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

I. A Shaginyan

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

N. I Kapranov

Medical-Genetic Scientific Centre of Russian Academy of Sciences

E. A Siyanova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

O. S Medvedeva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

E. I Kondratieva

Medical-Genetic Scientific Centre of Russian Academy of Sciences

G. V Alekseeva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

S. A Krasovsky

Research Institute of Pulmonology

M. V Usacheva

Research Institute of Pulmonology

E. L Amelina

Research Institute of Pulmonology

References

Supplementary files