DISTRIBUTION OF TWO-LOCUS HAPLOTYPES OF MICROBIAL COMPONENT SENSOR GENES TLR1 AND TLR6 IN MAJOR POPULATIONS OF SOUTH URALS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вся эволюция животных и растений построена из взаимоотношений хозяин/микро-организм и основывается на становлении и развитии универсальных механизмов, определяющих защиту хозяина от патогенов и партнерство между хозяином и его микробиотой. Первый уровень распознавания микроорганизмов (патогенов и симбионтов) связан с врожденной иммунной системой, обеспечивающей узнавание с помощью своих рецепторов «образов» чужеродных и опасных микроорганизмов/патогенов, не столько для конкретного организма, но для всего вида, к которому данный организм принадлежит. Такие рецепторы называют патоген- или паттерн-узнающими рецепторами (PRR), так как они выступают в качестве микробных сенсоров, узнающих молекулярные мотивы, консервативные для специфических групп микроорганизмов и активирующих воспалительный ответ. Часто их определяют как патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs) [8, 10]. У человека существует несколько семейств рецепторных белков, запускающих врож-деннный иммунный ответ. Часть из них располагается на мембране клеток врожденного иммунитета и включает в себя толл-подобные рецепторы (TLRs) и лектиновые рецепторы C-типа (CLRs), часть - находится в цитозоле клеток: RIG-подобные рецепторы (RLRs), NOD-подобные рецепторы (NLRs) и другие сенсорные молекулы, связывающие нуклеиновые кислоты. Кроме того, выделяют рецепторы комплемента и фиколины, которые относятся к циркулирующим белкам и принадлежат к факторам гуморальной составляющей врожденного иммунного ответа [13, 15]. Наиболее хорошо изученными PRRs являются TLRs, которые у человека представлены 10 функциональными членами (TLR1 - TLR10) из известных 12 и могут быть подразделены на группы в зависимости от ряда свойств: 1) на основании субклеточного распределения выделяют TLRs, локализующиеся во внутриклеточных везикулярных компартмен-тах (эндоплазматический ретикулум, эндосомы, лизосомы, эндолизосомы) - TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, и расположенные преимущественно на клеточной поверхности - TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6, TLR10; 2) в зависимости от природы лигандов, связывающихся с TLRs - внутриклеточные рецепторы, «узнающие» фрагменты нуклеиновых кислот бактерий и вирусов, а также эндогенные кислоты в патогенном контексте [18], и преимущественно поверхностные TLRs, связывающие компоненты клеточных оболочек микроорганизмов (зимозан, липопептиды, флагеллин, гликолипиды, липополисахарид, фла-геллин и др.) [8]. Существует еще одна особенность в механизмах «узнавания» микробных патогенов - одни и те же PAMPs могут распознаваться различными TLRs [13], способными создавать различные комбинации, в том числе друг с другом, для оптимальной индукции патогенспецифических и клеточно-типоспецифичных иммунных ответов хозяина на инфекцию. Так, TLR2 образует гетеродимеры с TLR1 и TLR6, и такие димерные комплексы проявляют свойства функциональных рецепторов [6]. Вскоре после описания молекул TLRs было показано, что гены, кодирующие их, образуют высокополиморфное семейство, варианты которых, возникающие в ходе эволюции и селекции, позволяют современному человеку отвечать на множество инфекционных агентов и обеспечивать себе защиту. В то же время, чрезвычайные генетические вариации способны определить предиспозицию индивидуумов и даже различных популяций современных людей к дисрегуляторным иммунным ответам, лежащим в основе высокой чувствительности к воспалительным и аутоиммунным заболеваниям [11, 15]. Генетическая история TLRs у человека свидетельствует о наличии селективных сил, определяющих их эволюцию. Как показывает ряд авторов, высокая частота встречаемости определенных аллелей и гаплотипов генов, кодирующих TLRs, связана как с их протективными эффектами против инфекции, так и с неадаптивными генетическими процессами в прошлом (путями миграции, дрейфом генов и т.д.) [15]. В настоящее время представлены строгие доказательства недавней в истории человечества селекции TLR10-TLR1-TLR6 кластера, особенно в европейских популяциях [7]. Этот кластер находится на коротком плече 4 хромосомы (4p14), состоит из тесно сцепленных генов, занимает область в 60 кб и несет в себе генетические полиморфизмы, отмечающие события положительного отбора [12, 16]. Показано, что точковые замены 1805T>G в гене TLR1 и 745C>T в гене TLR6 определяют гаплотип H34, характерный для европеоидных популяций (встречается с частотой >30%), но практически не встречающийся в популяциях монголоидного и негроидного происхождения [10, 12, 19]. Территория Челябинской области представлена многонациональным населением, среди которого наиболее распространенными являются популяции: русская, европеоидного происхождения, башкирская, для которой характерен комплекс генов иммунного ответа, с высокой частотой встречающихся у монголоидных популяций [2, 4, 5] и уникальная по иммуногенетическому профилю малая народность - нагайбаки, на формирование которой оказали влияние тюркские и финно-угорские народы [2, 4]. В свете выше изложенного, представляется интересным провести оценку распределения генного кластера TLR10-TLR1-TLR6 в популяциях Челябинской области и сравнить с данными, полученными при изучении мировых популяций. Целью данного исследования являлась оценка распределения частот встречаемости двухлокусных гаплотипов SNPs - 1805T>G гена TLR1 и 745C>T гена TLR6 в популяциях русских, башкир и нагайбаков Челябинской области. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа проводилась на базе Челябинского государственного университета и Челябинской областной станции переливания крови. Контингент обследуемых лиц: случайные выборки представителей трех этнических групп - русские (81), башкиры (78) и нагайбаки (84 человека). Исследуемые группы были сформированы из числа потенциальных доноров стволовой клетки, принадлежность к этнической группе определялась по данным генеалогического анамнеза в трех поколениях (согласно рекомендациям 8 Международного симпозиума 1980 г., Лос-Анджелес, США). Геномная человеческая ДНК была выделена из образцов венозной крови при помощи реагентов Axygen (Quiagen, Германия) согласно инструкции производителя. Типирование по точковому полиморфизму 1805T>G гена TLR1 проводилось с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с эндонуклеазой рестрикции AluI (37°С, 15 минут) (Fermentas, США). Определение полиморфизма 745C>T гена TLR6 проводилось аллель-специфической ПЦР (реагенты НПФ «Литех», Москва). Амплификацию проводили в приборе ТПЧ-ПЦР-01 «Терцик» (НПФ ДНК-Технология, Москва). Детекция результатов осуществлялась путем электрофореза в 3% агарозном геле с последующей визуализацией данных в УФ-свете. Статистическая обработка данных проведена при помощи средств программного пакета Arlequin (v. 3.5, Swiss Institute of Bioinformatics) по следующему алгоритму: 1) проверка наблюдаемого распределения генных частот на соответствие закону Харди- Вайнберга; 2) определение величины коэффициента неравновесного сцепления (D’) аллелей в локусах TLR1 и TLR6; 3) оценка частот двухлокусных гаплотипов TLR1-TLR6 с определением гаметной фазы методом максимизации ожидания; 4) установление достоверности различий в распределении частот встречаемости двухлокусных гаплотипов между популяциями определяли с помощью критерия %2 Пирсона и отклонений Фри-мана-Тьюки. Во всех случаях статистически значимыми признавали различия при p<0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Наблюдаемые в исследовании частоты генотипов в выборках изучаемых популяций соответствуют ожидаемым согласно закону Харди-Вайнберга, данные популяции находятся в состоянии равновесия. Ранее нами были оценены различия в частотах распределения аллелей и генотипов TLR1 и TLR6. В отношении TLR1 были установлены следующие особенности: в популяции русских Челябинской области чаще встречались аллель с заменой 1805*G и его гомозиготный генотип (1805 GG); для популяции башкир характерна низкая частота аллеля 1805*G и повышенная частота гомозиготного генотипа аллеля дикого типа (1805 TT). В выборке нагайбаков оба аллеля (1805*T и 1805*G) встречаются с близкими частотами за счет повышения носительства гетерозиготного генотипа 1805 TG. Распределение аллелей и генотипов TLR6 имело следующие различия: в популяциях башкир и нагайбаков Челябинской области чаще встречался аллель 745*C и гомозиготный генотип 754 CC [1]. В то же время, популяция русских Челябинской области характеризовалась повышенной частотой аллеля с заменой 745*T и его гомозиготного генотипа. Презентуемое исследование проведено в рамках научной проблемы «Популяционная иммуногенетика» и посвящено оценке неравновесного сцепления и формирования двухлокусных гаплотипов TLR1 - TLR6 в популяциях русских, башкир и нагайбаков Челябинской области. Нами установлено наличие неравновесного сцепления для исследуемых полиморфных сайтов генов TLR1 и TLR6 во всех выборках. В табл. 1 представлены частоты распределения двухлокусных гаплотипов TLR1-TLR6 (HF) в изученных популяциях и коэффициенты неравновесного сцепления (D’) гаплотипов. Как видно из данных табл. 1, гаплотипы TLR1 1805*T-TLR6 745*C и TLR1 1805*G-TLR6 745*T характеризуются положительным значением коэффициента неравновесного сцепления (D’, p<<0,001). Это свидетельствует о повышении вероятности совместного наследования аллелей TLR1 1805*T с TLR6 745*C и TLR1 1805*G с TLR6 745*T. Расчет частоты встречаемости двухлокусных гаплотипов показал существование межпопуляционных различий на уровне статистической значимости (%2[2.]=44,48 p<0,001). Для определения гаплотипов, обеспечивающих статистическую значимость полученных различий, были рассчитаны отклонения Фримана-Тьюки (FTdev) и оценки их значимости (p). Данные приведены в табл. 2. Из табл. 2 видно, что гаплотип TLR1 1805*G-TLR6 745*T статистически значимо чаще встречается в популяции русских (42%) и реже - в популяции башкир (17%). Данный гаплотип содержит аллели с заменой в обоих полиморфных Таблица 1. Двухлокусные гаплотипы в популяциях Челябинской области Гаплотипы Русские (n=162) Нагайбаки (n=168) Башкиры (n=156) HF абс. ( %) D’ HF абс. ( %) D’ HF абс. (%) D’ TLR1 1805*T- TLR6 745*C 38(23) 1,000 72 (43) 0,958 101 (65) 0,850 TLR1 1805*T- TLR6 745*T 0 (0) -1,000 1 (0,6) 0,958 3 (2) -0,850- TLR1 1805*G- TLR6 745*C 56 (35) -1,000 41 (24) 0,958 25 (16) -0,850- TLR1 1805*G- TLR6 745*T 68 (42) 1,000 54 (32) 0,958 27 (17) 0,850 Таблица 2. Отклонения Фримана-ТЪюки и их статистическая значимость для сцепленных гаплотипов Гаплотипы Русские (n=162) Нагайбаки (n=168) Башкиры (n=156) Оценка HF абс. (%) FTdev p HF абс. (%) FTdev p HF абс. (%) FTdev p различий TLR1 1805*T-TLR6 745*C 38 (23) -4,393 <0,001 72 (43) -0,081 0,909 101 (65) 3,660 <0,001 X2[2]=44,48 TLR1 1805*G-TLR 6 745*T 68 (42) 2,422 0,001 54 (32) 0,376 0,595 27 (17) -3,380 <0,001 p<0,001 сайтах изучаемых генов. Гаплотип TLR1 1805*T-TLR6 745*C реже представлен у русских (23%), но чаще - в популяции башкир (65%) и несет аллели дикого типа. Частоты встречаемости TLR1 1805*G-TLR6 745*T и TLR1 1805*T-TLR6 745*C гаплотипов в популяции нагайбаков имеют средние значения по отношению к данным, характеризующим популяции русских и башкир. ОБСУЖДЕНИЕ Из литературы известно, что неравновесное сцепление аллелей TLR1 1805*G-TLR6 745*T определяет гаплотип H34, который типичен для европеоидов, встречается среди них с частотой 30% и более и практически не встречается в популяциях монголоидного и негроидного происхождения [19]. Данное обстоятельство связано с точковой заменой 1805T>G TLR1, которая приводит к замене изолейцина на серин в положении 602 (I602S) молекулы TLR1. Эта замена происходит в области трансмембранного домена рецептора, что является само по себе довольно редким для TLRs явлением: чаще всего аминокислотные замены случаются во внеклеточном домене. Функциональным следствием замены I602S является ухудшение встраивания синтезированных молекул рецептора в цитоплазматическую мембрану, что приводит к снижению активации провоспалительных факторов до 60% [19]. Исследования различных авторов убедительно показывают, что такие изменения произошли в ходе относительно недавних периодов эволюции человека и, возможно, отражают давление инфекционных заболеваний, которые шли вместе с успешным развитием агрокультур, начавшимся приблизительно 10 000 лет назад [9, 11, 17], и внесли свой вклад в генетическую историю TLRs и определили генетическое разнообразие мировых популяций. Нами показано, что частота гаплотипа TLR1 1805*G-TLR6 745*T в исследованной популяции русских Челябинской области соответствует значению, характерному для европеоидов (42%). Согласно данным, представленным разными исследователями [2 - 4], популяции русских по частоте распределения гаплотипов генов, HLA, митохондриальной ДНК, Y-хромосомы мало отличаются от среднеевропейского уровня. Как оказалось, частота встречаемости гаплотипа TLR1 1805*G-TLR6 745*T в популяции башкир Челябинской области практически в 2,5 раза меньше, чем у русских, но значительно выше, чем у популяций монголоидного происхождения, в которых данный гапло-тип имеет ограниченное распространение [19]. Для нагайбаков было установлено, что частота гаплотипов имела промежуточные значения по сравнению с соответствующими показателями в популяциях русских и башкир. Как определено нами, частота гаплотипа TLR1 1805*G-TLR6 745*T у нагайбаков соответствует среднеевропейскому значению (32%), что может быть обусловлено генетической разнородностью предков нагайбаков и другими неадаптивными факторами. Южный Урал представляет собой один из наиболее многонациональных и поликонфессиональных регионов России. С глубокой древности на территории края сталкивались народы, пришедшие с Востока и Запада. В результате их взаимодействия происходил не только взаимный обмен культурами, но также генетическое смешение и формирование новых этносов. Процесс глобализации, активно начавшийся в XX веке, стирает границы между ранее обособленными популяциями, что объясняет необходимость проведения подобных исследований в настоящее время [5]. Кроме того, изучение частоты встречаемости генетических полиморфизмов TLRs в различных популяциях может не только расширить наше понимание процессов генетического ландшафта адаптации через геном человека, но и иметь практическую значимость, в частности, как предполагают исследователи, может использоваться для поиска генов-кандидатов риска развития общих мультифакторных заболеваний [18].

About the authors

A. L Burmistrova

Chelyabinsk State University

A. V Evdokimov

Chelyabinsk State University

D. S Stashkevich

Chelyabinsk State University

Yu. Yu Filippova

Chelyabinsk State University

T. A Suslova

Chelyabinsk State University; Chelyabinsk Region Station of Blood Transfusion

References

Supplementary files