IMMUNE REGULATORY PROPERTIES OF BIFIDOBACTERIA METABOLITES DURING EUBIOSIS AND DYSBIOSIS OF THE HUMAN COLON

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Качественное и количественное состояние микрофлоры кишечного биотопа является важным звеном системы, поддерживающей нормальный гомеостаз организма человека. Несмотря на значительные успехи в изучении механизмов эубиоза и микроэкологических нарушений кишечника, недостаточно исследованы особенности микробиоты толстой кишки, отражающие воздействие доминантных и ассоциативных микроорганизмов на цитокиновую сеть макроорганизма в аспекте изучения взаимоотношений в системе микросимбиоценоз-хозяин. Про- и противовоспалительным цитокинам, продуцируемым эпителиальными, иммунными клетками под воздействием представителей нормобиоты, принадлежит ведущая роль в регуляции кишечного гомеостаза посредством формирования адекватного цитокинового баланса [6, 8]. В физиологических условиях штаммы доминантных бактерий стимулируют протектив-ный иммунный ответ и подавляют воспалительные реакции [9, 11]. Таким свойством обладают как непосредственно микробные клетки, так и их экзометаболиты [5, 7]. Установлено, что негативная регуляция бифидобактериями провоспалительных цитокинов реализуется на уровне экспрессии генов, определяя тем самым гетерогенность иммуномодулирующих свойств бифидобактерий [6, 13, 14]. Вместе с тем, имеющиеся сведения об иммуномодулирующем действии симбиотических бактерий не позволяют оценить вклад бифидобактерий в формирование кишечного гомеостаза в зависимости от микроэкологического состояния толстого кишечника человека. Целью исследования явилось изучение иммунорегуляторных свойств метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для изучения иммунорегуляторных свойств метаболитов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека в качестве исследуемых микроорганизмов использованы штаммы Bifidobacterium spp., выделенные из фекалий 38 пациентов в возрасте от 1 до 60 лет при обследовании на дисбиоз кишечника. Выделение и идентификация микроорганизмов проводились общепринятыми бактериологическими методами. Для верификации результатов идентификации все изоляты были дополнительно идентифицированы по их белковым профилям с использованием масс-спектрометра MALDI TOF MS серии Microflex LT c программным обеспечением Maldi BioTyper 3,0 («Bruker Dal-tonics», Германия). Для получения метаболитов суточную бульонную культуру двукратно центрифугировали при 3000 об/мин и готовили фильтрат (мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, «Millipore», USA). Результат влияния супернатантов бифидобактерий на нестимулированные мононуклеары оценивали по изменению концентрации цитокинов в культуральной среде. Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из гепаринизированной крови здоровых доноров методом градиентного центрифугирования (400 g) в градиенте плотности фиколл-верографин («Pharmacia», Швеция) плотностью 1,077 г/см3. Продукцию цитокинов изучали в культурах мононуклеаров после 48-часовой инкубации клеток (2х106) при 37°C в атмосфере 5% СО2 в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США) и 80 мкг/мл гентамицина. Уровень TNF-a, IL-8, IFN-y и IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов оценивали в ИФА с помощью наборов «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия). Изучение способности метаболитов бифидобактерий в условиях in vitro вызывать изменение концентрации про- (IFN-y, TNF-a, IL-8) и противовоспалительных (IL-10) цитокинов - антицитокиновая активность (АЦА) проводилось путем соинкубирования супернатантов бактерий с рекомбинантными цитокинами («Sigma», IFN-y - I3265-1MG, TNF-a - T6674-10UG, IL-8 - I1645, IL-10 - I9276-5UG) [2]. Определение конечной концентрации цитокинов в опытных и контрольных пробах проводили в ИФА с использованием реагентов «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия), учет результатов регистрировался на фотометре Multiskan Labsystems (Финляндия) при длине волны 492 нм. Количественные значения АЦА выражались в условных единицах по соотношению опытных проб к контрольным. Статистическую обработку (общая статистика, дискриминантный анализ) полученных данных проводили средствами пакета Statistica 10 (StatSoft, USA) с оценкой различий между средними величинами по t-критерию Стьюдента. Проверка нормального распределения переменных проводилась методом Шапиро-Уилка. Статистические результаты выражали в виде медианы (Ме), нижних (Q25) и верхних (Q75) квартилей. Уровень статистической значимости различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при р<0,05. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Исследование распространенности антицитокиновой активности среди исследованных штаммов бифидобактерий показало, что способность изменять концентрацию провоспалительных цитокинов (IFN-y, TNF-a и хемокина IL-8) в среде сокультивирования чаще встречалась у изолятов, выделенных от пациентов с эубиозом и дисбиозом 1 степени, по сравнению со штаммами из кишечника с микроэкологическими нарушениями 2 - 3 степени. При эубиозе и дисбиозе 1 степени АЦА бифидобактерий в отношении ИНФ-у и TNF-a выявлялась у 50,0±0,4 и 83,0-94,0 % штаммов соответственно, при дисбиозе 2 степени - у 43,0±1,1 и 71,0±0,6 % изолятов и 3 степени - только у 29,0±1,8 % культур в отношении как одного, так и другого цитокина. Способность бифидобактерий снижать уровень IL-8 отмечалась у 43,0±0,5% эубиотических и у 29,0±1,8% дисбиотических штаммов. Активность бифидобактерий в отношении противовоспалительного цитокина IL-10 также чаще встречалась у эубиотических штаммов (94,0±0,1%), однако формирование дисбиоза незначительно влияло на распространенность данного признака у бактерий, так как при тяжелой степени дисбиоза АЦА регистрировалась у 83,0±0,9% штаммов. Таким образом, в условиях микроэкологических нарушений (при дисбиозах), по сравнению с эубиозом, из биотопа толстого кишечника реже выделялись изоляты бифидобактерий, способные изменять концентрацию цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-8 в условиях in vitro. tecrai г ДОоСчп» ДдоЛдо? Рис. 1. Влияние метаболитов бифидобактерий на продукцию цитокинов мононуклеарами в зависимости от состояния микросимбиоценоза толстого кишечника человека. По оси ординат - изменение продукции цитокинов мононуклеарами по отношению к контролю (базовый уровень спонтанной продукции цитокинов) (%); по оси абсцисс - □ INF-y, Е5 TNF-a, ■ IL-8, Е IL-10; фигурными скобками обозначены изменения в продукции цитокинов при эубиозе и дисбиозе кишечника человека. Исследование выраженности АЦА показало, что для штаммов бифидобактерий, колонизирующих биотоп толстого кишечника здорового человека, характерна высокая способность АЦА в отношении провоспалительных медиаторов IFN-y и TNF-a. В зависимости от микроэкологического состояния кишечника АЦА бифидобактерий в отношении IFN-y и TNF-a существенно снижалась только при 2 - 3 степени дисбиоза, при этом уровень АЦА уменьшался в ряду эубиоз, дисбиоз 1 > дисбиоз 2 > дисбиоз 3 степени. Далее данные (Ме [Q25- Q75]) приводятся в соответствии с указанным рядом по сравнению с эубиозом: для IFN-y - (0,42 [0, 28 - 0, 63]), (0,6 [0, 43 - 0, 7], р=0,08) > (0,46 [0, 45 - 0, 47], р=0,37) > (0,29 [0, 22 - 0, 29] усл. ед., р=0,002). Для TNF-a выраженность данного свойства составляла соответственно: (0,44 [0, 34 - 0, 6]), (0,46 [0, 24 - 0, 56] усл. ед., р=0,35 > (0,32 [0, 3 - 0, 35], р=0,01) > (0,11 [0, 11 - 0, 17] усл. ед., р=0,001. Уровень выраженности АЦА супернатантов бифидобактерий в отношении IL-8 имел более низкие значения, чем для IFN-y и TNF-a, и для эубиоти-ческих штаммов составлял 0,11 [0, 11 - 0, 14] усл. ед., существенно не отличаясь от дисбиотических изолятов. Анализ АЦА бифидобактерий в отношении противовоспалительного цитокина IL-10 показал, что для супернатантов эубиотических штаммов уровень ее был несколько выше показателей АЦА в отношении IFN-y, TNF-a, составляя 0,58 [0, 49 - 0, 66] усл. ед., и не отличался от значений АЦА для дисбиотических изолятов, за исключением штаммов, выделенных при 3 степени дис-биоза (0,33 [0, 26 - 0, 49] усл. ед., р=0,003). Таким образом, супернатанты облигатных анаэробных симбионтов толстого кишечника - бифидобактерий, изолированных от пациентов без микроэкологических нарушений, обладали выраженной способностью in vitro снижать концентрацию как провоспалительных цитокинов IFN-y и TNF-a, так и противовоспалительного цитокина IL-10. Изменения в состоянии микросимбиоценоза биотопа толстого кишечника способствуют снижению выраженности и распространенности данного биологического свойства у бифидобактерий как для про-, так и противоспалительных цитокинов. Исследование продукции цитокинов (ПЦ) нестимулированными мононуклеарами человека при взаимодействии с супернатантами штаммов бифидобактерий от пациентов, не имеющих нарушений микробиоценоза толстого кишечника, показало (рис. 1), что по отношению к контролю (мононуклеары без добавления экзометаболитов бифидобактерий) в культуральной жидкости отмечалось существенное снижение уровня IL-8 и IFN-y и, напротив, повышение IL-10, при этом изменений содержания TNF-a не выявляли. Супернатанты штаммов бифидобактерий от пациентов с дисбиозом 1 степени оказывали влияние на продукцию цитокинов мононуклеарами крови, сопоставимое с эубиотиче-скими изолятами. Наиболее выраженные отличия, как по сравнению с контролем, так и между эу- и дисбиотическими изолятами выявлялись у штаммов бифидобактерий от обследуемых со 2 и особенно 3 степенью микроэкологических нарушений толстого кишечника, что проявлялось в возрастании в культуральной среде уровня как про-, так и противовоспалительных цитокинов, наиболее значительное для TNF-a и IL-10. В целом, полученные результаты по изучению влияния экзометаболитов бифидобактерий на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека в системе in vitro свидетельствуют об определенных различиях в выраженности и направленности воздействия штаммов на эффекторы иммунитета с учетом степени нарушений микробиоценоза толстого кишечника - биотопа естественного места пребывания доминантных микросимбионтов человека. Исключительная роль бифидобактерий в микросимбиоценозе толстого кишечника человека дает основание рассматривать их как чувствительный индикатор состояния организма, описываемого посредством наиболее характерных биологических свойств. В этом качестве мы проанализировали ранее изученные свойства антилизоцимной активности (АЛА), показатель микробной обсемененности (ПМО), а также исследованные в этой работе продукцию мононуклеарами здорового человека про- (IL-8, TNF-a, IFN-y) и противовоспалительных (IL-10) цитокинов под влиянием супернатантов исследуемых бифидобактерий, включая антицитокиновую активность в отношении этих же цитокинов. Эти характеристики определялись для членов выборки из 37 штаммов пациентов, которые по данным предварительного бактериологического обследования были отнесены к одной из 4 групп, условно обозначенных как эубиоз, дисбиоз 1 степени (ДБЗ 1), 2 степени (ДБЗ 2), 3 степени (ДБЗ 3). Наличие эталонной выборки позволило применить аппарат дискриминантного анализа для проверки уже известного разделения по категориям больных, бактериологически обследованных для диагностики дисбиоза толстого кишечника на основе рекомендаций [4]. Мы исходили из того, что если заявленные межгрупповые отличия сохранятся в пространстве описанных выше количественных характеристик свойств бифидобактерий, то их диагностические возможности будут подтверждены. В результате дискриминантного анализа определились 2 канонических дискриминантных корня (ROOT 1 и ROOT 2), представляющие собой линейные комбинации исследуемых свойств бифидобактерий, характеризующих каждый случай эталонной выборки. Их проекция в координатах дискриминантных корней представлена на рис. 2 (вверху), где отчетливо наблюдается искомое разделение исследуемых штаммов бифидобактерий на 4 объективно существующие группы эубиоз-дисбиоз. Суммарный анализ дискриминантных функций, на основании которых анализировался вклад изученных признаков бифидобактерий, показал почти 100% совпадение всех случаев группировки штаммов, выделяемых из кишечного биотопа при различных состояниях микросимбиоценоза: эубиоз, дисбиоз 1, 2 и 3 степени. mvA i ‘/s. Яй4й.г Ratif 1 Affsbta RDtJTI ПЦФНО-4 ■1.0 ЛЦ ИЛ-0 ЛЦДОНО-а -0,1» АЛА ио.сгг Hj.iif? аш и№* 4.DB «Ц иЁИФ 1,*д 2.ЕЮ VurliiJla P/DDJ2 ГЦФНО-а -0.Ё7 Щ.КЯ1# ча.ёг 'ASIA H№r wO.CTT АЦА_&Н0^а ■--0,0* 0,07 АЛА rfUSblff D.ZZ rrni WIN o.iif ici.w О ЗУБНОЙ О ДИ1 А дю$ Ж дааа анатров ости со шка 1мма кодис- ЗОТ «сема кростик иоз- На рисунке 2 (внизу) представлена детальная интерпретация связей исследуемых характеристик, выполненная на основании структуры соответствующих дискриминантных корней (рис. 2, вверху). Согласно ей состояние эубиоза характеризуется проявлением у бифидобактерий высокой способности инактивировать лизоцим, системный провоспалительный цитокин TNF-a, значительным уровнем микробной массы (ПМО). Вклад каждого из перечисленных показателей составил соответственно 8,70; 25,0 и 66,3%. Для штаммов бифидобактерий в условиях ДБЗ 1 наиболее значимым признаком оказалась способность подавлять продукцию IL-8. Далее приводится вклад каждого из информативных параметров по отношению к суммарному вкладу всех значимых показателей по всем степеням дисбиоза. Для бифидобактерий, выделенных при ДБЗ 2, как и при дис-биозе 1 степени, была свойственна способность влиять на продукцию IL-8 (21,2%) и дополнительно - на секрецию TNF-a (32,4%). При тяжелой степени нарушений микробиоценоза (ДБЗ 3) бифидобактерии проявляли наиболее выраженную способность среди других групп штаммов влиять на продукцию ИНФ-у (46,4%). Дискриминантный анализ исследуемых характеристик бифидобактерий выявил параметры со стабильными значениями (продукция IL-10, АЦА в отношении IL-10 и IL-8), не зависящими от микроэкологического состояния биотопа толстого кишечника, поэтому при обработке результатов они не вошли в группу информативных показателей, представленных на рисунке 2 (внизу). Таким образом, использование дискриминантного анализа параметров, характеризующих способность бифидобактерий взаимодействовать с эффекторами врожденного (лизоцим) и адаптивного иммунитета (влияние на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека), позволило выявить информативные параметры, пригодные для оценки функционального состояния доминантной микрофлоры с учетом уровня дисбиотических нарушений. ОБСУЖДЕНИЕ Проведенные исследования позволили рассмотреть роль бифидобактерий в качестве микробного регулятора кишечного гомеостаза человека. При анализе исследуемых свойств бифидобактерий с использованием дискриминантного анализа определены информативные параметры, определяющие степень устойчивости кишечного гомеостаза в условиях эубиоза и дисбиотических нарушений от 1 до 3 степени. Следует отметить, что проведенный дискриминантный анализ исследуемых биологических свойств эубиотических и дисбиотических клинических штаммов бифидобактерий распределил все исследуемые изоляты на 4 группы с почти 100% точностью, отразив их принадлежность к биотопу толстого кишечника при физиологическом состоянии микробиоценоза и при дисбио-тических нарушениях 1, 2 и наиболее тяжелой 3 степени. Полученный результат подтверждает адекватность проведенного исследования с применением указанного математического анализа и важность изученных биологических свойств бифидобактерий для оценки состояния кишечного гомеостаза, реализуемого с участием метаболитов доминантных бактерий. Установлено, что в формировании состояния эубиоза толстого кишечника существенная роль среди всех анализируемых свойств бифидобактерий принадлежит уровню микробной обсемененности (66,3% от вклада исследуемых показателей для эубиотических штаммов), что согласуется с общепринятыми критериями микробиологической диагностики дисбиоза толстого кишечника [4]. Вторым по значимости (25,0%) оказался показатель, характеризующий способность бифидобактерий снижать концентрацию in vitro одного из ранних провоспалительных цитокинов системного действия TNF-a, что может указывать на потенциальную способность эубиотических клинических штаммов ограничивать уровень воспалительной реакции в кишечнике, минимизируя риск избыточной стимуляции иммунитета, способный нанести вред собственным клеткам хозяина. Указанное качество бифидобактерий изучалось многими авторами, преимущественно на пробиотических штаммах [12, 13], реже на клинических [5, 10], но без учета состояния микробиоценоза толстого кишечника. Существенная роль среди изученных свойств бифидобактерий в условиях эубиоза по результатам проведенного анализа принадлежит показателю, отражающему способность инактивировать лизоцим (8,75%) - универсальный фактор врожденного иммунитета [3]. Полученный результат подчеркивает значимость данного признака в адаптационных механизмах бифидофлоры, определяющих длительное выживание и доминирование этой микрофлоры в организме хозяина [1]. Следует отметить, что другие исследованные показатели (не отраженные на рис. 2, внизу) имели примерно равное значение в характеристике эубиотических штаммов, но в меньшей степени дифференцировали их от дисбиотических изолятов, по сравнению с выявленными информативными параметрами. При оценке информативных параметров, определяющих вклад бифидобактерий в формирование устойчивости кишечного гомеостаза в условиях измененного микроэкологического состояния (дисбиоз), обращает на себя внимание участие свойств, характеризующих способность доминантных бактерий влиять на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами человека: хемокина IL-8 (вклад 21,1%, информативен для дисбиоза 1 и 2 степени), TNF-a (32,4%, информативен для дисбиоза 2 степени) и IFN-y (46,4%, информативен для дисбиоза 3 степени). Полученные результаты свидетельствуют о способности бифидобактерий, основной доминантной флоры биотопа толстого кишечника, изменять продукцию провоспалительных цитокинов в большей мере в условиях нарушения микросимбиоценоза от легкой до тяжелой степени дисбиоза. Выявленная однонаправленность изменений показателей, характеризующих продукцию IL-10 и АЦА в отношении IL-10, IL-8, независимо от состояния микросимбиоце-ноза толстого кишечника, свидетельствует о высокой степени стабильности данных признаков у доминантов. Способность бифидобактерий усиливать продукцию IL-10 в сочетании с низкой антицитокиновой активностью в отношении данного цитокина и хемокина IL-8, вероятно, характеризует значительный адаптационный потенциал доминанта в противовоспалительном эффекте и поддержании иммунологической толерантности, реализуемый даже при глубоких микроэкологических нарушениях в биотопе толстого кишечника. Вот почему полученные результаты свидетельствуют о связи цитокинового статуса хозяина с характером его взаимодействия с нормофлорой (бифидобактериями). Таким образом, полученные материалы раскрывают механизмы иммунорегуляторного влияния метаболитов бифидофлоры в поддержании гомеостаза кишечной микробиоты через цитокиновый и антицитокиновый профиль хозяина.

About the authors

O. V. Bukharin

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

E. V Ivanova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

N. B Perunova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

I. N. Chainikova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

I. A Nikoforov

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

T. A Bondarenko

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

References

Supplementary files