MODERN METHODS APPLICATION OF GENOTYPING OF INFECTIOUS DISEASES PATHOGENS IN THE CONTEXT OF OPERATIONAL WORK OF SPECIALIZED ANTI-EPIDEMIC TEAM DURING THE XXII OLYMPIC WINTER GAMES AND XI PARALYMPIC WINTER GAMES

Full Text

При подготовке к международным массовым мероприятиям особое внимание уделяют анализу имеющегося риска, способного помешать их проведению, и разработке мер по предотвращению чрезвычайных ситуаций и реагированию на них. Среди эпидемиологического риска наибольшую значимость имеет возможность заноса различных инфекций с других территорий, а также совершение актов биотерроризма [3, 4, 7]. При проведении эпидрасследований чрезвычайных ситуаций биологического генеза крайне важно определить источник инфекции, установить происхождение штамма патогена и его эпидемическую значимость. Современные технологии молекулярно-генетического анализа позволяют решить эти задачи. В период проведения XXII Олимпийских зимних игр и XI Паралимпийских зимних игр 2014 года в г. Сочи (далее: Олимпийских игр) для усиления лабораторной базы региона была привлечена специализированная противоэпидемическая бригада (СПЭБ) Ставропольского противочумного института, усиленная отдельными специалистами РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов), ГНЦ ПМБ (пос. Оболенск) и других учреждений Роспотребнадзора. Согласно разработанным нормативно-методическим документам в задачи СПЭБ входило проведение исследований по идентификации, характеристике возбудителей особо опасных (ООИ) и тяжелых инфекций неустановленной этиологии [5, 6]. Для их решения, наряду с классическими методами, используются методы молекулярногенетического типирования, с помощью которых на основании сравнительного анализа геномных портретов возможно установить источник инфекции, дифференцировать эндемичные для определенной территории и заносные штаммы и т.д. Наибольшее распространение сегодня для генотипирования возбудителей инфекционных болезней получили следующие методы: мультилокусный анализ вариабельного числа тандемных повторов (MLVA), мультилокусное сиквенс-типирование (MLST), анализ отличающихся участков ДНК (DFR), фрагментарное секвенирование по Сэнгеру и др. С целью получения полной информации о генетической структуре возбудителя используют полногеномное секвенирование. В данной статье представлен опыт организации и проведения генотипирования штаммов патогенных биологических агентов (ПБА) непосредственно в лаборатории СПЭБ во время Олимпийских игр. На подготовительном этапе необходимо было решить ряд организационных вопросов: определение перечня возбудителей актуальных инфекций, генотипирование которых предполагается в условиях работы СПЭБ во время Олимпийских игр; выбор методик генотипирования для каждого вида патогена; определение необходимой приборной базы, подготовка рабочих мест; обеспечение взаимодействия с референс-центрами по инфекционным нозологиям. При подготовке учитывался имеющийся эпидемиологический риск, вероятность появления различных нозологических форм. В результате была обеспечена готовность СПЭБ к проведению генотипирования: возбудителей инфекций, проявление которых наиболее вероятно в период массового мероприятия - острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ), острые кишечные инфекции (ОКИ), легионеллез; возбудителей эндемичных для региона и других природно-очаговых вирусных инфекционных болезней - геморрагической лихорадки с почечным синдромом, Крымской геморрагической лихорадки, лихорадки Западного Нила; потенциальных агентов биотерроризма - Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Vibrio cholerae, Brucella spp. При выборе методик молекулярно-генетического типирования учитывали дифференцирующую способность метода, наличие доступных баз данных, содержащих информацию о генетических портретах патогена, скорость выполнения анализа. В итоге для характеристики штаммов возбудителей бактериальных ООИ был выбран метод MLVA, для возбудителей ОКИ бактериальной этиологии - анализ наличия специфических генов, для Legionella pneumophila - MLST, для возбудителей вирусных инфекций - секвенирование фрагментов генома по Сэнгеру. Также были определены алгоритмы биоинформационного анализа результатов молекулярно-генетических исследований. В случае обнаружения возбудителя ООИ бактериальной этиологии выделенные культуры и образцы ДНК должны были быть переданы в Ставропольский противочумный институт для проведения высокопроизводительного (полногеномного) секвенирова-ния. Сроки выдачи ответа по методам MLVA, MLST, секвенирования по Сэнгеру составляли 24 - 48 часов, по результатам полногеномного секвенирования - 5 - 8 суток. В рамках подготовки к Олимпийским играм были проведены учения СПЭБ на модели возбудителя чумы, в ходе которых для определения происхождения и оценки эпидемической значимости штамма в шифрованных пробах применялись методы генотипирования. Время исследования с момента доставки материала в СПЭБ до получения результатов генотипирования составило 36 часов [1]. Основной стационарной базой СПЭБ в период Олимпийских игр было Сочинское противочумное отделение Причерноморской противочумной станции, где был организован отдельный блок молекулярно-генетических исследований с необходимым набором помещений, соответствующих требованиям нормативно-методических документов по обеспечению безопасности и поточности работы [2]. Бригада была оснащена автоматическим генетическим анализатором ABI PRISM 3500 для проведения фрагментарного секвенирования и станцией микрокапилярного электрофореза «Experion System», позволяющей автоматизировать и ускорить MLVA. На период подготовки и проведения Олимпийских игр были заключены соглашения о взаимодействие между Ставропольским противочумным институтом и ведущими НИИ Роспотребнадзора, предусматривающие, в том числе, сотрудничество по молекулярногенетическому направлению работы. Налажено взаимодействие с референс-центрами по соответствующим нозологическим формам инфекций, в которые при необходимости должны были быть направлены выделенные штаммы: ЦНИИЭ, г. Москва - возбудители воздушно-капельных инфекций бактериальной и вирусной этиологии, ОКИ бактериальной этиологии; Санкт-Петербургский НИИЭМ им. Пастера - возбудители иерсиниозов, брюшного тифа; Новгородский НИИЭМ- возбудители энтеровирусных инфекций; ГНЦ ВБ «Вектор», р.п. Кольцово - возбудители геморрагических лихорадок Марбург, Эбола, Ласса, Хунин, Мачупо и др. особо опасных вирусных инфекций; ГНЦ ПМБ, п. Оболенск - при подозрении на генетически модифицированные микроорганизмы. За период работы СПЭБ проведено генетическое типирование 9 штаммов L. pneumophila, 4 - Escherichia coli, 7 - Staphylococcus aureus, 1 - вируса гриппа А субтипа H1-swine. При изучении легионелл, выделенных из воды горячего водоснабжения (7 штаммов относились к 1 серогруппе, 2 штамма - к 2 - 14), был определен аллельный профиль фрагментов генов flaA, pilE, asd, mip, mompS, proA, neuA и на основании его сиквенс-тип изолятов. У шести штаммов L. pneumophila серогруппы 1 был определен сиквенс-тип ST-1, наиболее часто встречающийся во всем мире. Еще один штамм имел сиквенс-тип ST-366, впервые выявленный на территории Российской Федерации. Это свидетельствует о генетической неоднородности возбудителя, циркулирующего в регионе г. Сочи. Полученные данные могут использоваться в дальнейшем при проведении молекулярно-эпидемиологических расследований случаев заболевания легионеллезом. При обнаружении E. coli в продуктах питания проводилось исследование на наличие генов, кодирующих синтез интимина - eaeA, шига-токсинов 1, 2 - stx1, 2 и характерного для серогруппы O157 гена rfb. В результате последовательности генов энтерогеморрагических E. coli обнаружены не были. Проведено генотипирование 7 штаммов S. aureus (4 штамма выделены из клинического материала, 3 - из продуктов питания) на наличие участков гена нуклеазы золотистого стафилококка, гена стафилококкового энтеротоксина А, гена токсина синдрома токсического шока. В итоге у всех исследованных штаммов выявлен участок гена нуклеазы золотистого стафилококка, у одного штамма, выделенного из пробы клинического материала, определена последовательность гена стафилококкового энтеротоксина А, у одного штамма, выделенного из пищевого продукта, обнаружены последовательности генов стафилококкового энтеротоксина А и токсина синдрома токсического шока. Полученные результаты позволили сделать заключение об эпидемическом потенциале возбудителя. Проведено мультилокусное секвенирование по Сэнгеру и филогенетический анализ фрагментов генома вируса гриппа А субтипа H1-swine, выявленного в материале от больного, прибывшего из страны Африканского континента. Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента гена NA (нейраминидазы) размером 393 п.н., тогда как ген HA (гемаглютинина) секвенировать не удалось. Полученные результаты проанализировали с использованием алгоритма nBLAST (NCBI). Для кластерного анализа использовали программу MEGA 5.0. Сравнение проводили с представленными в GeneBank последовательностями гена NA 99 штаммов гриппа АНШ1 swine 2009, циркулировавших в 2011 - 2013 гг. в США (63 штамма), России (12), Японии (10), Европе (8) и Китае (6). В результате филогенетического анализа установлено, что исследуемый образец входил в одну группу со штаммами A/Indiana/167/2012(H1N1) (наиболее близкий штамм), A/ Delaware/05/2010(H1N1), A/NorthDakota/05/2011, выявленными в США в 2010 - 2012 гг., и генетически не однороден с российскими штаммами, что позволило судить о вероятном заносе возбудителя с другой территории. В результате проведенной организационной работы и применения технологий геноти-пирования и секвенирования в условиях СПЭБ получен положительный опыт, который должен учитываться в дальнейшем. На подготовительном этапе обеспечена готовность к генетической характеристике штаммов возбудителей инфекций, эпидемиологический риск по которым наиболее высок во время проведения массовых мероприятий, а также эндемичных для региона г. Сочи, определен алгоритм взаимодействия с референс-центрами по соответствующим нозологиям. Впервые в практической работе СПЭБ использована автоматическая станция «Experion System», которая позволяет существенно ускорить проведение MLVA и других методик, где присутствует этап электрофореза. Всего за период Олимпийских игр проведено генотипирование 21 штамма ПБА различного происхождения (из клинического материала, продуктов питания, питьевой воды). Доказана эффективность использования технологий генотипирования в условиях СПЭБ. Следующим шагом может быть рассмотрение вопроса об их широком внедрении в практику в качестве рутинных методов в лаборатории Центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации, выполняющих ПЦР-исследования и имеющих необходимый кадровый потенциал. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

B. P Kuzkin

Federal Service of Surveillance for Protection of Consumers Rights and Human Welfare

Moscow, Russia

A. N Kulichenko

Stavrapol Plague Control Research Institute

Stavrapol, Russia

A. S Volynkina

Stavrapol Plague Control Research Institute

Stavrapol, Russia

D. V Efremenko

Stavrapol Plague Control Research Institute

Stavrapol, Russia

I. V Kuznetsova

Stavrapol Plague Control Research Institute

Stavrapol, Russia

E. S Kotenev

Stavrapol Plague Control Research Institute

Stavrapol, Russia

G. I Lyamkin

Stavrapol Plague Control Research Institute

Stavrapol, Russia

N. N Kartsev

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

V. P Klindukhov

Administration of Rospotrebnadzor in Krasnodar Territory

Krasnodar, Russia

References

Supplementary files