EFFECT OF POLYCOMPONENT PROBIOTICS ON THE COMPOSITION OF COLON MICROBIOCENOSIS DURING EXPERIMENTAL DYSBIOSIS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Микроэкологическая система организма - это сложный филогенетически сложившийся динамичный комплекс, включающий в себя разнообразные по количественному и качественному составу ассоциации микроорганизмов и продукты их биохимической активности в определенных условиях среды обитания [8, 11, 15]. Нормофлора человека выполняет различные жизненно важные функции, в том числе обеспечивает процессы переваривания и всасывания, синтез витаминов, ферментов, аминокислот, оказывает подавляющее действие на патогенную микрофлору, обеспечивает антиинфекционную защиту и иммунорегулирующую функцию, принимает участие в синтезе иммуноглобулинов и в морфогенезе иммунной системы [14, 16, 19]. Микрофлора толстого кишечника считается биогенным фактором, в значительной степени определяющим состояние организма [20]. По-прежнему актуальными остаются вопросы изменений количественного и качественного состава кишечной микрофлоры, причинами которых является воздействие на организм различных факторов экзогенного и эндогенного характера (возраста, образа жизни, сезона года, характера питания, в том числе и продолжительный неконтролируемый прием антибиотиков широкого спектра действия) [3, 18]. Многочисленные клинико-лабораторные исследования, направленные на изучение качественных и количественных характеристик изменений состава микрофлоры толстого кишечника при дисбиозе, позволили выдвинуть концепцию, согласно которой сообщество микроорганизмов в толстом кишечнике человека определяется индивидуальными характеристиками его организма, что фактически обусловливает индивидуализацию создания и применения лекарственных и профилактических препаратов для коррекции дисбиоза [1, 2, 7, 9, 17]. Для коррекции состава микрофлоры кишечника применяются пробиотики, в частности, такие как «РиоФлора Иммуно Нео», содержащий в своем составе Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus salivarium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, и «Бифиформ», в состав которого входят Bifidobacterium longum и Enterococcus faecium. Целью исследования была оценка влияния пробиотиков «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» на качественный и количественный состав мукозной микрофлоры толстого кишечника при экспериментальном дисбиозе у мышей. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследование проведено на 80 мышах линии BALB/c массой 18 - 20 грамм, которых содержали на обычном пищевом рационе в условиях вивария. Все животные были разделены на четыре группы по 20 особей в каждой. Первая (контрольная) группа состояла из интактных мышей. Во вторую группу входили животные, у которых моделировали лекарственный дисбиоз путем внутрибрюшинного введения в течение 5 дней раствора гентамицина в концентрации 80 мкг/мл в пересчете на массу тела животного (0,02 мл) [10]. Мышам третьей группы по окончанию введения антибиотика интрагастрально вводили пробиотик «РиоФлора Иммуно Нео» по 0,02 мл в течение 21 дня. Мыши четвертой группы после формирования дисбиоза интрагастрально получали пробиотик «Бифиформ» по 0,03 мл в течение 21 дня. У мышей контрольной группы, а также экспериментальных групп после окончания введения гентамицина (вторая группа) или пробиотиков (третья и четвертая группы) производили изучение состава мукозной микрофлоры толстого кишечника. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводилось по [6]. Биоптаты слизистой оболочки толстого кишечника освобождались от химуса и взвешивались в асептических условиях. После этого материал помещался в стерильный раствор фосфатного буфера в соотношении 1:10 и выдерживался в нем 2 часа для разжижения муцина. Затем готовились разведения материала до концентраций 10-2 - 10-4. По 0,1 мл каждого разведения взвеси засевали газоном на поверхность питательных сред (Эндо, Сабуро, SSA-агар, ЦПХ-агар, кровяной агар, желточно-солевой агар, висмутсульфит агар, лактоагар, бифидоагар) и инкубировали при температуре 37°C в аэробных и анаэробных условиях. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью микробиологического анализатора «Multiskan-Ascent» с использованием тест-систем ЭНТЕРОтест-16, СТАФИтест-16, Стрептотест-16, Эн-КОККУСтест-16, API 50 CHL для идентификации лактобацилл и бифидобактерий. Количество микроорганизмов в 1 г материала рассчитывали, исходя из числа выросших колоний микроорганизмов - КОЕ при посеве из максимального разведения, где отмечался рост не менее 10 колоний, учитывая при этом объем посевного материала. Для расчета использовали формулу: К=Е/к^*п, где К - колониеобразующая единица, Е - общее количество бактерий, к - количество внесенного материала, v - количество чашек Петри, n - разведение. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала [4, 5, 12]. Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых параметров с помощью программы Statistica 6.0 [13]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ При исследовании количественного и качественного состав мукозной нормофлоры толстого кишечника интактных животных было установлено, что в составе мукозной микрофлоры преобладали бифидобактерии (7,93±0,93), в несколько меньшем количестве обнаруживались E. coli c нормальной ферментативной активностью (6,77±0,78) и лактобациллы (6,15±0,70) (табл.). Кроме того, в составе микрофлоры обнаруживались представители рода Salmonella (5,65±0,66), а содержание кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью и бактерий родов Enterobacter, Citrobacter, Enterococcus составило 2,74±0,60; 4,47±0,79; 4,37±0,92 и 3,42±0,90 соответственно. Несколько ниже было число коагулазоотрицатель-ных стафилококков (2,74±0,60) и бактерий рода Streptococcus (2,93±0,60), а грибы рода Candida присутствовали в незначительном количестве (1,26±0,32). При этом в составе мукозной микрофлоры интактных мышей не определялись золотистые стафилококки и микроорганизмы рода Proteus. Экспериментальный дисбиоз кишечника, обусловленный введением гентамицина, характеризовался уменьшением численности доминантных представителей микрофлоры здоровых животных - содержание бифидобактерий снизилось в 1,9 раза, а кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью и лактобактерий - в 1,7 раза. При этом число эшерихий со сниженной ферментативной активностью увеличилось в 1,6 раза, а стрептококков в 2,1 раза по отношению к контролю. Содержание энтеробактерий уменьшилось в 1,9 раза и составило 2,37±0,56. В составе кишечного биоценоза данной экспериментальной группы не выявлялось микроорганизмов рода Citrobacter и Enterococcus, тогда как отмечалось появление золотистых стафилококков и бактерий рода Proteus (3,40±0,62 и 4,01±0,66 соответственно). На фоне применения гентамицина в составе микробиоценоза толстого кишечника мышей количество грибов рода Candida увеличилось в 3,9 раза. Что касается коагулазотрицательных стафилококков и сальмонелл, то изменения их численности были недостоверны по отношению к контролю. Применение «РиоФлора Иммуно Нео» оказало достоверное воздействие на содержание 10 из 13 определяемых в составе мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей микроорганизмов. При этом использование пробиотика привело к увеличению численности бифидобактерий, лактобацилл, эшерихий с нормальной ферментативной активно- Влияние пробиотиков «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» на состав мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей Выделенные микроорганизмы Количество микроорганизмов, lg KOE/г (M±m) Группы животных контроль дисбиоз «РиоФлора Иммуно Нео» «Бифиформ» E.coli c норм. фермент. акт. 6,77±0,78 3,95±0,53** 7,20±0,66ххх 6,51±0,64хх E.coli то сниж. фермент. акт. 4,37±0,76 7,03±0,95* 2,67±0,61ххх 2,38±0,64ххх Enterobacter spp. 4,47±0,79 2,37±0,56* 5,92±0,74ххх 6,42±0,94ххх Salmonella spp. 5,65±0,66 6,44±0,86 3,97±0,81х 2,97±0,44ххх*** Citrobacter spp. 4,37±0,92 0±0*** 3,78±0,79ххх 3,21±0,63ххх Enterococcus spp. 3,42±0,90 0±0*** 4,71±0,79ххх 5,14±0,69ххх Streptococcus spp. 2,93±0,60 6,17±1,09* 3,48±0,49х 3,10±0,48х Staphylococcus (коагулазоотр.) 2,74±0,60 4,10±0,75 3,02±0,70 2,91±0,56 Staphylococcus aureus 0 3,40±0,62*** 2,31±0,62*** 1,80±0,31х*** Proteus spp. 0 4,01±0,66*** 2,60±0,58*** 2,13±0,54х*** Candida spp. 1,26±0,32 4,94±0,74*** 1,06±0,38ххх 0±0ххх*** Lactobacillus spp. 6,15±0,70 3,73±0,77* 6,43±0,90х 6,16±0,78х Bifidobacterium spp. 7,93±0,93 4,24±0,72** 8,20±1,22хх 9,12±0,94ххх П римечание. * р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001 по сравнению с контрольной группой; х р<0,05, хх р<0,01, ххх р<0,001 по сравнению с группой «дисбиоз». стью и микроорганизмов рода Enterobacter, появлению представителей родов Citrobacter и Enterococcus, в результате чего их содержание достигло значений у интактных мышей. Количество кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, сальмонелл, стрептококков и грибов рода Candida на фоне терапии снизилось, в результате чего эти показатели нормализовались. Достоверных изменений содержания коагулазоотрицатель-ных и золотистых стафилококков, а также бактерий рода Proteus зарегистрировано не было, однако в результате применения пробиотика число коагулазоотрицательных стафилококков не отличалось от значений контрольной группы. В группе животных, получавших пробиотик «Бифиформ», количество эшерихий с нормальной и сниженной ферментативной активностью, бифидобактерий и лактобацилл достигло значений контрольной группы. Также нормализовалось содержание стрептококков и коагулазоотрицательных стафилококков. Микроорганизмы рода Citrobacter и Enterococcus, которые отсутствовали в группе мышей с экспериментальным дисбиозом, определялись в количестве 3,21±0,63 и 5,14±0,69 соответственно и не отличались от значений контроля. Стафилококки и бактерии рода Proteus по-прежнему определялись в составе мукозной микрофлоры животных. Число представителей рода Enterobacter достоверно увеличилось и превысило значение в контрольной группе, а сальмонелл - уменьшилось ниже значений контроля, грибы рода Candida не выявлялись. ОБСУЖДЕНИЕ Таким образом, при коррекции гентамицинового дисбиоза пробиотиками «РиоФлора Иммуно Нео» и «Бифиформ» отмечена коррекция содержания представителей мукозного микробиоценоза толстой кишки. При этом применение «Бифиформа» приводило к нормализации содержания 7 из 11 разбалансированных в результате применения гентамицина представителей микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл, кишечных палочек с нормальной и сниженной ферментативной активностью, энтерококков, стрептококков и бактерий рода Citrobacter). Использование пробиотика «РиоФлора Иммуно Нео» нормализовало 10 из 11 разбалансированных представителей микрофлоры (кроме выше перечисленных еще и бактерий рода Enterobacter, сальмонелл и грибов рода Candida). Выявленные различия в нормализации количественного состава микробиоты толстого кишечника, по нашему мнению, связаны с видовым составом микроорганизмов использованных пробиотиков. Это позволяет рекомендовать в клинической практике применение данных препаратов для избирательной коррекции дисбиоза после исследования качественного и количественного состава микробиоценоза толстого кишечника.

About the authors

A. V Ageichenko

Kursk State Medical University

P. V Kalutsky

Kursk State Medical University

O. A Medvedeva

Kursk State Medical University

V. A Korolev

Kursk State Medical University

References

Supplementary files