ANTIMICROBIAL COMPOUNDS OF ENTEROCOCCI

Full Text

Продукция бактериями антимикробных соединений является отражением конкурентного обитания первых в составе мультивидовых популяций и составляет, наряду с факторами врожденного и приобретенного иммунитета хозяина, основу механизма колонизационной резистентности биотопов. Одной из наиболее изучаемых групп микроорганизмов в рамках данной проблемы являются бактерии рода Enterococcus [1]. Ниже представлены основные группы антимикробных соединений энтерококков, наиболее исследованные на сегодняшний день. Бактериоцины. Бактериоцины - синтезируемые на рибосомах белки или пептиды бактерий, обладающие антимикробным действием в отношении родственных видов [29, 33]. Являясь одними из факторов микробного антагонизма, они обеспечивают колонизационную резистентность организма хозяина, регулируя популяции бактерий. Бактериоцины энтерококков обычно называют энтероцинами. Они отличаются значительным разнообразием [34]. В соответствии с классификацией Franz C.M. et al. [18], основанной на структуре бактериоцина и сходстве аминокислотных последовательностей, эти соединения энтерококков могут быть отнесены к четырем классам: лантибиотикам, семейству педиоцинов, циклическим антибактериальным пептидам и крупным белкам [18]. Хотя спектр антимикробной активности бактериоцина обычно ограничивается бактериями близкородственных видов, бактериоцины молочно-кислых бактерий, к которым относятся энтерококки, привлекли пристальное внимание из-за их активности в отношении грамположительных возбудителей пищевых отравлений - Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus и Clostridium botulinum (активны в отношении вегетативных клеток и спор данного микроорганизма) [9, 11, 15]. Убедительным примером широты спектра энтероцинов может служить один из наиболее хорошо изученных факторов патогенности Entercoccus faecalis - цитолизин [12]. Большинство исследованных штаммов микроорганизмов чувствительны к цитолизину, за исключением Streptococcus sobrinus, Bacillus polymyxa и двух штаммов грамотрицательных бактерий - Escherichia coli и Proteus vulgaris [8]. Позже спектр активности был расширен за счет стрептококков полости рта [12, 25]. Цитолитические штаммы способны численно преобладать над нецитолитическими культурами in vitro, даже когда начальная концентрация нецитолитического штамма в 100 раз выше [7]. Для энтерококков характерна большая распространенность внутри- и межродового антагонизма, что объясняет существенное значение бактерий этой группы в колонизационной резистентности кишечного биотопа организма хозяина. Так, при перекрестном исследовании 120 фекальных изолятов внутриродовой антагонизм обнаружен у 65% культур бактерий. Почти четверть (23,1%) бактериоциногенных штаммов подавляет рост более 50 культур энтерококков. Хотя данный признак отмечен у представителей 4 видов, большинство (77,8%) изолятов с широким спектром действия отнесено к виду E. faecium. В условиях in vitro эти культуры проявляют выраженное антилистериозное действие, у них нет экспрессии факторов патогенности [2]. Эффективные механизмы переноса генов могут объяснить большое разнообразие существующих бактериоцинов, продукцию множества бактериоцинов единичными штаммами, а также повторное выделение одних и тех же бактериоцинов разными исследовательскими группами [18]. Например, энтероцин AS-48, обнаруженный первоначально у клинического изолята E. faecalis S-48 [19], как оказалось (по данным ПЦР), широко распространен у штаммов E. faecalis и E. faecium [26]. По данным De Vuyst L. et al. [17], по меньшей мере один из генов, кодирующих бактериоцины EntA, EntB, EntL50A и B, Bac31 или цитолизин, обнаружен у 64 из 122 бактериоциногенных культур из разных экологических ниш. Часто встречается множественная продукция бактериоцинов. Более трети исследованных культур (39,1%) дали положительный ПЦР-сигнал по меньшей мере на один бактериоцин, 48,4% штаммов были положительными на два энтероцина, 10,9% - на три энтероцина и один штамм (1,6%) имел гены, кодирующие четыре разные бактериоцина [17]. Такое многообразие позволяет бактериям адаптироваться в условиях любого биотопа с большим видовым богатством микроорганизмов и высокой плотностью заселения. Важным вопросом при оценке значения продукции бактериоцинов является характер экспрессии соответствующих генов в конкретных условиях обитания. Учитывая анаэробную среду пищеварительного тракта, влияние парциального давления кислорода может быть одним из основных регулирующих факторов. Этот тезис подкрепляется данными о том, что продукция колицинов и микроцинов усиливается в анаэробных условиях [6, 31]. Более того, синтез лихенина штаммом Bacillus licheniformis 26L-10/3RA осуществляется только в анаэробных условиях [35]. В этом плане интерес представляют данные о том, что в условиях анаэробиоза происходит усиление экспрессии (в 8,6 раза) генов, кодирующих структурные субъединицы цитолизина E. faecalis - cylL(L) и cylL(S) [14]. Подобные факты свидетельствуют о важности продукции энтерококковых бактериоцинов in vivo. Органические кислоты. Для бактерий рода Enterococcus характерен метаболизм бродильного типа. Основной способ получения энергии - гомоферментативное образование L(+)-молочной кислоты из глюкозы при гликолизе (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса). В аэробных условиях глюкоза метаболизируется в уксусную кислоту, ацетоин и CO2. При значениях pH 5,0 - 6,0 клетки E. faecalis стехиометри-чески превращают пируват в лактат, но при нейтральных или слабощелочных значениях pH он преобразуется в формиат, этанол и ацетат в соотношении 2:1:1. При дефиците питательных веществ пируват превращается в этанол и ацетат. В средах с глицерином при аэрации клетки E. faecalis образуют, главным образом, уксусную кислоту и CO2 и ацетилметилкарбинол (последний - в следовых количествах). Бактерии E. faecium могут окислять глицерин до уксусной кислоты, CO2 и небольшого количества перекиси водорода [40]. Продукция органических кислот основными микроорганизмами-антагонистами в кишечнике играет существенную роль в обеспечении колонизационной резистентности биотопа. При этом к подавлению роста патогенов приводит не только снижение pH: молочная кислота, например, приводит к пермеабилизации наружной мембраны грамотрицательных бактерий, лишает микроорганизмы необходимых факторов роста (хелирующий агент) и даже специфически влияет на экспрессию ключевых факторов вирулентности возбудителя [16]. Для характеристики значения определенных кислот в антимикробной активности энтерококков можно воспользоваться результатами работы Tejero-Sarinena S. et al. [42]. Авторы показали, что повышение концентрации молочной кислоты, в отличие от уксусной, приводит как к существенному снижению pH, так и к увеличению антагонистической активности лактобацилл и бифидобактерий в отношении грамполо-жительных и грамотрицательных патогенов - Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Clostridium difficile. Активированные кислородные метаболиты. Около 90% потребляемого живыми организмами молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фос-форилирования, вместе с тем, постоянно протекают реакции с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ). Многие из этих соединений являются радикалами, то есть имеют неспаренный электрон, поэтому часто их называют свободными радикалами. Примером из группы активных форм кислорода (АФК) являются супероксидный анион-радикал O2- и гидроксильный радикал OH •. Нерадикальными видами АФК являются перекись водорода (H2O2) и синглетный кислород (1О2). Все активированные кислородные метаболиты обладают высокой цитотоксичностью в отношении любых типов клеток и клеточных образований за счет четырех основных механизмов: индукции процессов перекисного окисления липидов в биологических мембранах; повреждения мембрансвязанных белков; инактивации ферментов и повреждения ДНК клеток. Все основные классы биомолекул (белки, липиды, нуклеиновые кислоты) в живом организме могут стать критическим элементом повреждающего действия этих метаболитов [3]. Микроорганизмы, в частности энтерококки, принимают самое непосредственное участие в продукции активированных кислородных метаболитов. Хотя роль образования АФК в патогенезе инфекционного процесса изучена недостаточно, считают, что они повышают шансы в колонизации различных биотопов и в выживании в последних по сравнению с другой микробиотой и могут оказывать действие как на микрофлору, так и на клетки хозяина [41]. Присоединение одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии приводит к образованию супероксидного анион-радикала O2-. Так как анион O2-имеет заряд, он плохо мигрирует через мембраны. Будучи относительно слабым окислителем O2- во многих биологических системах может выступать в качестве донора электронов, восстанавливая ряд соединений. Основные источники его образования - ферментативные системы: НАДФН-оксидаза фагоцитирующих клеток, ксантиноксидоредуктаза, митохондриальная цитохром с-оксидаза и микросомальные монооксигеназы [3]. У E. faecalis O2- образуется за счет самоокисления, связанного с мембраной деметилменахинона (одновалентное восстановление кислорода восстановленным деметилменахиноном). Продукция внеклеточного супероксидного анион-радикала подавляется гематином (как незаменимым кофактором цитохрома bd) и фумаратом (субстратом фумаратредуктазы) [24]. Продукция внеклеточного супероксидного аниона (O2) - распространенный признак у энтерококков, особенно у вида E. faecalis. При исследовании фекальных и клинических изолятов, а также типовых культур (12 штаммов) установлено, что бактерии видов E. faecalis (87 из 91 изолята и штамм ATCC 19433), E. faecium (5 из 13 штаммов), E. casseliflavus ATCC 25778 и E. gallinarum ATCC 35038 продуцируют внеклеточный O2-. Штаммы E. faecalis, связанные с бактериемией или эндокардитом, продуцировали in vitro значительно больше внеклеточного O2- по сравнению с культурами из фекалий здоровых лиц (соответственно 2,4±0,2; 1,9±0,2 и 1,5±0,3 нмоль O^/мин/Ю9 КОЕ; p = 0,025). Два нецитолитических, бесплазмидных лабораторных штамма E. faecalis (JH2-2 и OGlRF) также продуцировали внеклеточный O2-; это означает, что данный признак не обязательно имеет плазмидную детерминацию [22]. В присутствии кислорода при 37°С штамм E. faecalis OG1RF образует 17,2±0,3 нмоль O^/мин/Ю9 клеток и 23 нмоль H202/мин/109 клеток [20]. На подкожной модели установлено, что продукция внеклеточного супероксидно-го аниона усиливает выживание in vivo E. faecalis при смешанной инфекции с Bacteroides fragilis [21]. Перенос двух электронов на молекулу кислорода или одного электрона на супе-роксидный анион-радикал O2- сопровождается образованием двухзарядного аниона O22-. В свободном состоянии такой анион не существует, так как энергия связывания атомов кислорода становится отрицательной. Присоединяя протоны, он переходит в гидроперекисный анион HO2- или H2O2, при этом при физиологических значениях pH вследствие высокого pKa преобладает H2O2. Перекись водорода относят к окислителям средней силы, при этом, не будучи радикалом, она взаимодействует с веществами как радикальным, так и нерадикальным путем. В водных растворах в отсутствие каталазы, пероксидаз и ионов металлов переменной валентности H2O2 относительно стабильна и будучи электростатически нейтральной молекулой (не имеет заряда) легко проникает сквозь гидрофобные мембраны и может мигрировать в клетки и ткани. Наличие нейтральных аддуктов H2O2 (например, гистидина) обеспечивает ее проникновение внутрь клеток даже в присутствии каталазы. В аэробных организмах главными эндогенными источниками H2O2 служат ферментативные реакции с оксидазами, переносящими два электрона на молекулу кислорода, а также реакция дисмутации, катализируемая СОД, около 80% H2O2, генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в реакции дисмутации O2- супероксиддисмутазой [3]. Ген, кодирующий НАДH-оксидазу (nox), присутствует в геноме E. faecalis [36]. Молочнокислые бактерии вырабатывают две формы этого фермента, одна образует воду, другая - перекись водорода, подавляющую рост бактерий в аэробных условиях in vitro [38]. Перекись водорода может образовываться при метаболизме глицерина [5]. Исследование показало, что один из двух путей обмена глицерина приводит к продукции перекиси водорода. Выбор пути метаболизма зависит от штамма. Некоторые штаммы E. faecalis образуют перекись водорода с участием глицерол-3-фосфатоксидазы, утилизирующей кислород. Другие штаммы никогда не используют этот путь и, таким образом, не продуцируют перекись водорода при метаболизме глицерина. На модели опосредованного E. faecium киллинга круглого червя-нематоды Caenorhabditis elegans как индикатора токсичности было продемонстрировано, что E. faecium продуцируют перекись водорода в концентрации, которая вызывает повреждение клеток. Использовались мутанты E. faecium с инсерцией транспозона со сниженной способностью вызывать гибель C. elegans; у этих мутантов также была нарушена продукция перекиси водорода. Мутация гена, кодирующего НАДН-оксидазу, элиминировала почти всю НАДН-оксидазную активность и снижала продукцию перекиси водорода. Мутация гена, кодирующего НАДН-пероксидазу, приводила к повышенному накоплению перекиси. Клетки E. faecium способны образовывать перекись водорода за счет использования глицерол-3-фосфатоксидазы; добавление глицерина в среду культивирования усиливало киллинг C. elegans. Наоборот, добавление глюкозы, которая приводила к даун-регуляции метаболизма глицерина, предотвращало как киллинг C. elegans, так и продукцию перекиси водорода. Наконец, детоксикация перекиси водорода либо добавлением экзогенной каталазы, либо трансгенным организмом C. elegans с гиперпродукцией каталазы предотвращала опосредованный E. faecium киллинг. Эти результаты свидетельствуют, что перекись водорода, образуемая E. faecium, оказывает цитотоксическое действие [32]. Гидроксильный радикал OH • является наиболее реакционным и «вредным» из АФК, с его образованием часто связывается цитотоксическое и мутагенное действие АФК в условиях окислительного стресса. OH-радикал может разрывать любую C-H-или C-C-связь, при этом скорость его взаимодействия с большинством органических соединений достигает величин, равных скорости диффузии. Другими словами, OH • реагирует с первой попавшейся молекулой. Основным источником OH-радикалов в большинстве биологических систем служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности (Fe2+, Cu+, Co2+, Mn2+, V2+, Cr4+), главным образом Fe2+ и Cu+ [3]. Для проверки образования in vivo свободных радикалов бактериями E. faecalis кишечник крыс колонизировали либо диким штаммом E. faecalis, либо мутантом с аттенуированной продукцией O2- [23]. Было показано, что образование гидроксили-рованных продуктов фенил^-трет-бутилнитрона (ФБН) и D-фенилаланина значительно повышено в кишечнике крыс, заселенных диким штаммом по сравнению с мутантным штаммом. Сходные результаты получены при инкубации in vitro этих бактерий с ароматическими мишенями. Таким образом, ароматическое гидроксили-рование является механизмом образования in vivo гидроксильного радикала клетками с участием E. faecalis, колонизирующих пищеварительный тракт [23]. Важным аспектом изучения бактериальных антимикробных факторов является исследование их взаимодействия при кооперативном киллинге патогенов. Синергидный эффект молочной кислоты и перекиси водорода в отношении возбудителей инфекций кишечника (Salmonella enterica серовар Typhimurium SL1344), мочевых путей (Escherichia coli CFT073) и бактериального вагиноза (Gardnerella vaginalis DSM 4944) показан при продукции этих соединений бактериями кишечной (Lactobacillus johnsonii NCC933) и вагинальной (Lactobacillus gasseri KS120.1) микрофлоры человека [4]. По-видимому, подобное усиление антимикробного действия можно ожидать у перекись-продуцирующих энтерококков. Взаимодействие антимикробных соединений может обусловливать влияние энтерококков даже на устойчивые грамотрицательные патогены, на которые бактерио-цины не оказывают существенного влияния. Так, у штамма E. faecium NCIM5363 с высокой липолитической активностью липаза по данным сканирующей электронной микроскопии деградирует клеточную стенку грамотрицательных бактерий и создает поры, через которые поступает энтероцин, приводящий к гибели клетки [37]. Спектр антимикробных субстанций, образуемых энтерококками, не ограничивается упомянутыми выше соединениями. Подтверждением этому служат результаты двух исследований. Штамм E. faecium подавляет образование биопленки у культуры Streptococcus mutans. Ингибирующее действие не связано с продукцией бактериоци-нов или низкими значениями pH после сокультивирования. Виновником предположительно считают неизвестный белок с молекулярной массой более 10 кДа [30]. Экзополисахарид (ЭПС) культуры E. faecium MC13 из кишечника лобана Mugil ce-phalus, самой крупной промысловой рыбы из серых кефалей, подавляет образование биопленки у бактерий S. typhi, P. aeruginosa, B. cereus, S. aureus и особенно сильно у L. monocytogenes [27]. По данным тонкослойной хроматографии ЭПС E. faecium MC13 представляет гетерополисахарид с молекулярной массой 200 кДа, состоящий из остатков галактозы и глюкозы. Полученные результаты свидетельствуют, что группа бактерийных антимикробных соединений может (и должна) быть дополнена секретируемыми продуктами и/или компонентами микробных клеток, которые не оказывают прямого действия на рост и размножение возбудителей, но снижают их патогенность - колонизацию, токси-нообразование, персистенцию и др. Такое направление исследований является весьма перспективным. Энтерококки способны не только сами продуцировать антимикробные вещества, но и за счет своей метаболической активности образовывать соединения с такими свойствами из различных неактивных предшественников, поступающих, например, с продуктами питания или другими источниками. Так, штамм E. faecium превращает дегидродиванилин в ванилиновую кислоту [10], которая обладает антимикробным действием [13]. Бактерии E. casseliflavus метаболизируют флавоноидный гликозид изокверцитрин в кверцетин [39], также имеющий антимикробную активность [28]. Возможность образования таких соединений in situ является важным механизмом защиты различных отделов пищеварительного тракта от избыточного размножения патогенов. Характеризуя в целом антимикробные соединения энтерококков, следует подчеркнуть, что им отводится важная роль в колонизационной резистентности биотопов организма человека, которая реализуется за счет тесного и разностороннего взаимодействия бактериальных факторов с механизмами врожденного и адаптивного иммунитета хозяина.

About the authors

A. V Valyshev

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

References

Supplementary files