MECHANISMS OF MICROORGANISM RESISTANCE TO β-LACTAM ANTIBIOTICS

Full Text

Антибиотики, в том числе Р-лактамные, остаются наиболее часто назначаемыми антибактериальными лекарственными препаратами в странах Европы, в том числе и в РФ [4]. В 2001 году ВОЗ приняла глобальную стратегию по сдерживанию устойчивости к противоми-кробным препаратам [48]. Для понимания формирования и распространения антибиотикоре-зистентности необходимы знания о механизмах устойчивости на молекулярном уровне. Устойчивость к Р-лактамным антибиотикам опосредуется следующими механизмами: 1. Появление пенициллинсвязывающих белков (ПСВ) со сниженной аффиностью к Р-лактамным антибиотикам (ПБС2а). 2. Продукция микроорганизмами ферментов (Р-лактамаз), гидролизующих Р-лактамное кольцо. 3. Нарушение проницаемости внешней мембраны микробной клетки. 4. Активное выведение антибиотиков из микробной клетки [19]. 1. Рассмотрим появление ПСБ со сниженной аффиностью к fi-лактамным антибиотикам на примере Staphylococcus aureus. Одной из причин резистентности к Р-лактамным антибиотикам является появление ПСБ2а, данные белки кодируются геном mecA. В результате даже в присутствии Р-лактамных антибиотиков синтез пептидогликана не нарушается и микроорганизм выживает. Транскрипция mecA гена находится под контролем регулятора-репрессора МecI. Он связывается с промоторной областью, предположительно, как димер и ингибирует транскрипцию гена. Когда поступает сигнал через трансмембранный индуктор (MecR1), его цитоплазматический домен расщепляется, что приводит к отсоединению репрессора mecI и запуску транскрипции гена [47]. Остается неясным весь механизм запуска, в настоящее время существует гипотеза, что Р-лактамные антибиотики связываются с тригерной частью рецептора MecR1, находящейся на внешней стороне мембраны, что запускает каскад реакций, приводящий к активации протеаз. Они же напрямую или с помощью вторичных мессенджеров (MecR2) инактивируют репрессор [42]. Ген mecA расположен на мобильном геномном элементе, называемом стафилококковая хромосомная кассета mec (Staphylococcal chromosomal cassette mec = SCCmec). В колониях S.aureus SCCmec элемент всегда интегрируется в определенную зону хромосомы бактерии - обозначающийся как attBscc (бактериальный хромосомный сайт прикрепления). Этот сайт распологается вблизи точки начала репликации orfX. Различные SCCmec элементы сходны по своему составу и представлены тремя основными комплексами, а именно (1) mec-комплекс, содержащий mecA ген; (2) ccr- комплекс, содержащий гены, кодирующие белки рекомбинации и (3) комплекс, содержащий три региона связывания (J) [22]. J-регионы обычно располагаются таким образом: j1-регион находится на правой стороне кассеты, j2-регион - между mec и ccr-комплексами и j3-регион - на левой стороне кассеты, примыкая к точке начала репликации orfX. Исключения составляют SCCmecVII и SCCmecIX элементы, где ссг комплекс расположен между j3- и j2-регионами, а mec комплекс - между j2- и j1-регионами [23]. Ccr комплекс содержит гены, кодирующие рекомбиназы. Данные рекомбиназы относятся к классу сериновых рекомбиназ и катализируют процессы специфической интеграции и вырезания SCCmec элемента в/из бактериальной хромосомы [25]. В настоящее время существует три филогенетически отдаленных ccr гена - это ccrA, ccrB и ccrC. Каждый из генов ccrA и ccrB представлен 4 аллотипами (ccrA1, ccrA2, ccrA3, ccrA4) и (ccrB1, ccrB2, ccrB3, ccrB4). Классификация генов в один аллотип проводится на основе нуклеотидной идентичности. Гены, имеющие сходство в нуклеотидной последовательности >85%, относятся к одному аллотипу, от 60 до 82% - к разным аллотипам. Все ранее изученные ccrC варианты генов показали аналогию более 87%, что позволило выделить только один аллотип - ccrC1. Cреди представителей рода Staphylococcus (за исключением S.aureus) встречаются другие аллотипы генов ccr: rerA5 у Staphylococcus pseudоintermedius, ccrB6 и ccrB7 у Staphylococcus saprophyticus. Основывaясь на аллельной вариации ccr генов было выделено 8 типов ccr-комплекса [22]. Mec-комплекс состоит из mecA-гена, регуляторных генов (mecR и mecI) и вставочных последовательностей (IS элементы). Mec-комплекс подразделяется на 6 классов (A, B, C1, C2, D, E). Класс А является прототипом и содержит mecA ген, регуляторные гены mecR и mecI, распологающиеся в противоположном направлении, гипервариабельный регион (hypervariable region - HVR) и вставочную последовательность IS431, располагающуюся в основном направлении (совпадающем с направлением mecA гена). Разница между классами (A-D) mec-комплекса объясняется влиянием вставочных последовательностей (IS431 и IS 1272). Встраиваясь в различные регионы комплекса, они вызывают делеции регуляторных генов, что приводит к изменению генетической организации и формированию нового класса mec-комплекса [22]. Недавно опубликованные данные геномной последовательности S.aureus изолята LGA251 позволили ообнаружить совершенно новый mec-комплекс. Данный комплекс именуется классом Е и несет ген blaZ, кодирующий Р-лактамазы. Этот ген входит в состав bla-оперона, широко распространенного среди грамположительных бактерий. Класс Е был обнаружен Garcia-Alvarez L. et al. [17] от изолята MRSA LGA251 (ST425). A.C.Shore et al. [45] опубликовали данные о выявлении класса Е у изолята MRSA (CC130). Впоследствии ген mecALGA251 был назван mecC, он имеет менее 70% гомологии с mecA геном. Генетическая организация mec-комплекса всех классов описана в [23]. J-регионы являются необязательной составляющей SCCmec касеты. Однако они могут быть мишенью для встраивания мобильных генетических элементов (плазмид и транспозонов), несущих дополнительные детерминанты (гены) резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам. Приобретение и аккумуляция таких генов на SCCmec кассете ведет к возникновению мультирезистентных клонов [23]. Первый SCCmec элемент был идентифицирован у S.aureus (N315) в 1999 году в Японии [21]. Вскоре появились данные об обнаружении еще двух новых SCCmec элементов. В 2011 году были опубликованы данные о идентификации совершенно нового SCCmec элемента, уже одинадцатого по счету. В связи с увеличением количества SCCmec элементов их субтипов и разнообразия описания, используемого в литературе, было принято решение о введении международных правил нумерологии и классификации [23]. В основе классификации SCCmec элементов лежит комбинация типов ccr-комплексов и классов mec-комплекса. SCCmec I (1B) одержит 1 тип ccr-комплекса и В класс mec-комплекса. Классификация субтипов внутри одного типа SCCmec кассеты основывается на полиморфизме или комбинации в j-регионах. Каждому новому субтипу присваивается буква латинского алфавита, например IVa, IVb и т.д. [22]. Описание всех классов представлено у Turlej A. et al. [47]. Оптимальным для изучения локальной эпидемиологии MRSA является использование комбинаций методов анализа множественных тандемных повторов: MLVA - Multilocus variable number tandem repeat (VNTR) analysis и SCCmec-типирования либо применение пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE - Pulsed field gel electrophoresis). Для изучения глобальной эпидемиологии и популяционной структуры могут быть рекомендованы такие методы как мультилокусное секвенирование-типирование (MLST - multilocus sequence typing) и spa-секвенирование-типирование, которые обеспечивают высокий уровень стандартизации исследования и возможность эффективного обмена данными между лабораториями во всем мире [2]. 2. Продукция в-лактамаз. Все известные к настоящему времени Р-лактамазы делятся на четыре класса, в пределах которых ферменты характеризуются общностью свойств и аминокислотной гомологией. Данная классификация была предложена Ambler в 1980 году. Классы А, C и D относятся к ферментам серинового типа (по аминокислоте, находящейся в активном центре). Ферменты класса В относятся к металло-энзимам, поскольку в качестве ко-фермента в них присутствует атом цинка [11]. Представители ферментов всех классов кратко рассмотрены в [19]. Номенклатура Р-лактамаз никогда не была особенно рациональной. Ферменты были названы в честь субстратa (CARB, FUR, IMP, ОХА), имени пациента (ТЕM, ROB), больницы (MIR, RHH), государства (штат OHIO), на основе биохимических свойств (SHV, NBC), по названию бактерии (AER, PSE) или по инициалам автора, который их открыл (HMS). Ввиду возрастающего количества публикаций о вновь открываемых Р-лактамазах была введена достаточно жесткая номенклатура. Для открытия нового фермента необходимо предоставить информацию о его уникальной аминокислотной структуре, а не только об измененной нуклеотидной последовательности в гене, который его кодирует, так как некоторые нуклеотидные замены могут быть «молчащими» и не влиять на структуру и функцию белка [24]. Несмотря на то, что структурная классификация, предложенная Ambler, очень проста и удобна в использовании, она не дает возможности оценить клиническую роль и отследить уровень резистентности к определенным классам антибиотиков, поэтому Bush K. и Jacoby G.A. [11] предложили функциональную классификацию Р-лактамаз. В ее основе лежит способность ферментов гидролизировать определенные классы Р-лактамных антибиотиков, а также по их отношению к Р-лактамным ингибиторам (клавулоновой кислоте, сульбактаму и тазобактаму). По данной классификации все ферменты принято подразделять на три группы, среди которых можно выделить несколько подгрупп. Группа 1 - цефалоспориназы, относящиеся к классу С. Ферменты данной группы кодируются генами, широкого распространенными в бактериальных хромосомах большинства представителей семейства Enterobacteriaceaе, примером служит ген AmpC. Плазмид-опосредованные гены резистентности (СMY, ACT, DHA, FOX, MIR) не имеют широкого распространения среди клинически значимых микроорганизмов. Группа 2 - сериновые Р-лактамазы, относящиеся к классу А и D, являются представителями самой большой группы среди всех Р-лактамаз. Большинство новых Р-лактамаз, открытых за последние 20 лет. относятся к этой группе, включая все известные к настоящему времени Р-лактамазы расширенного спектра (БЛРС). Группа 3 - металло-Р-лактамазы, относятся к классу В. Изначально они отличались от всех остальных Р-лактамаз своей способностью гидролизировать карбапенемы, но на данный момент известно несколько ферментов серинового класса, обладающих той же активностью [11]. Первый фермент Р-лактамаз, способный гидролизировать расширенный спектр Р-лактамных антибиотиков, включая цефалоспорины II - III поколения и частично IV, был SHV-2, обнаруженный у Klebsiella ozaenae [10]. Существует около 90 типов Р-лактамаз (TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, OXA, GES и серА и др.). Среди одного типа можно выделить десятки, а иногда и сотни белков-ферментов, но не все они по своему фенотипическому профилю относятся к БЛРС [8]. TEM-1 является наиболее распространенным ферментом грамотрицательных микроорганизмов и обеспечивает более 90% резистентности к ампициллину у Escherichia coli. Известно, что этот фермент ответственен за резистентность к ампициллину и пенициллину среди представителей Haemophilus influenzae и Neisseria gonorrhoeae. TEM-1 способен гидролизировать пенициллины и цефалоспорины первого поколения, такие как цефалофин и цефалоридин. TEM-2 является производным от TEM-1 и отличается от него одной аминокислотой, но при этом его фенотипический профиль остается тем же, что и у TEM-1. В 1989 году появились данные об обнаружении первого типа TEM Р-лактамаз с расширенным спектром действия -TEM-3. Его аминокислотная последовательность отличалась от TEM-1 наличием замены глутаминовой кислоты на лизин в позиции 104, глицина на серин в позиции 238 и глутамина на лизин в позиции 39. Определенное сочетание аминокислотных замен приводит к формированию новых вариантов ферментов, часть из них обладает свойствами, позволяющими отнести их к БЛРС [10, 37]. К настоящему моменту насчитывается более 200 вариантов TEM Р-лактамаз, среди них 96 являются БЛРС [8]. SHV-1 тип наиболее распространен среди Klebsiella pneumoniaе. Ген, кодирующий SHV-1, впервые был описан на бактериальной хромосоме и кодирует Р-лактазамы узкого спектра. Большинство вариантов БЛРС SHV типа характеризуются аминокислотной заменой серина на глицин в позиции 238 [10]. БЛРС SHV типа широко обнаруживают среди микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, но также они встречаются среди Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. и Burkholderia cepacia [37]. На данный момент БЛРС SHV типа насчитывается около 41 разновидности [8]. В Японии в 1986 году ученые открыли БЛРС-штамм, не принадлежащий к типам TEM и SHV, ему дали название FEC-1 (Fecal E.coli). В Германии в 1989 году ученые сообщили об обнаружении клинического штамма E.coli, резистентного к цефотаксиму и не принадлежащего к TEM и SHV типам, его назвали CTX-M (Active on cefotaxime, first isolated at Munich). В 1992 году во Франции был выделен новый штамм E. coli с фенотипом БЛРС, ему присвоили название MEN. Впоследствии на основе секвенирования нуклеотидной последовательности и определения гомологии между этими штаммами они были отнесены к одному типу, который назвали СТХ-М. На основе филогенетических исследований CTX-M можно подразделить на пять групп (представители одной группы имеют идентичность >94%): CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 и CTX-M-25 [9]. В природной популяции гены blacxx-м встречаются в составе бактериальной хромосомы Kluyvera cryocrescens (blaKLUC-1), Kluyvera ascorbata (blaKLUA) и Kluyvera georgiana (blaKLUG-1). У клинических штаммов микроорганизмов гены СТХ-М обычно расположены на плазмидах. Часто наблюдается носительство нескольких детерминант резистентности на одной плазмиде (blaCTX_M + blarEM-1, blaCTX_M + blarEM-2, blaCTX_M + blaSHV, blaCTX-M + blaoXA-1). Горизонтальный перенос генов резистентности осуществляется путем конъюгации, и его частота составляет от 10-7 до 10-2 в клетке донора. Это свойство объясняет быстрое распространение данных генов среди различных видов грамотрицательных бактерий. Возможный механизм приобретения генов blaCTX-M клиническими штаммами микроорганизмов - это мобилизация данных генов с бактериальной хромосомы природных носителей (Kluyvera ascorbata и Kluyvera georgiana) и перенос их на плазмиду. Доказательством является то, что генетические последовательности, лежащие справа и слева от гена blaCTX_M_8, схожи на 95 и 94% с окружением гена blaKLUG-1 на хромосоме K. georgiana [9]. OXA-тип назван так потому, что ферменты данного типа способны гидролизировать окса-циллин (oxacillin-hydrolyzing abilities). Р-лактамазы OXA типа принадлежат к классу D. Среди всех четырех классов Р-лактамаз этот класс является наиболее разнообразным по своим биохимическим свойствам и генетическому уровню организации. Первый OXA-12 ген был обнаружен в бактериальной хромосоме у Aeromonas jandaei. Резистентность к пинициллину и узкому спектру цефалоспоринов была выявлена у Ralstonia pickettii. Два вида ферментов было идентифицировано у данного представителя: OXA-22 и OXA-60. Среди многих видов микроорганизмов распространены хромосомные гены, кодирующие Р-лактамазы OXA типа: Campylobacter jejuni (OXA-61), Pandoarea pnomenusa (OXA-62), Burkholderia pseudomallei (OXA- 43, oXa-57, OXA-59), Legionella gormanii (OXA-29), Acinetobacter radioresistens (OXA-102, OXA-103, OXA-105) [37]. Большинство Р-лактазаз OXA-типа не гидролизируют цефолоспорины II - III поколения и относятся к ферментам с узким спектром действия. Примерами являются OXA-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 20, 21, 29, 46 и др. [39]. Но среди представителей OXA-типа также можно выделить БЛРС. Часть БЛРС является производными от OXA-типа с узким спектром действия вследствии точечных мутаций, а другая резко отличается от всех остальных по своей аминокислотной последовательности. К первой группе можно отнести OXA-15, OXA-32, которые произошли от OXA-2, а также OXA-11, OXA-14, OXA-16 и OXA-17, являющиеся производными от OXA-10; ко второй группе - OXA-18, OXA-45 и OXA-53. Гены, кодирующие БЛРС OXA-типа, часто находятся на мобильных генетических элементах (вставочных последовательностях, транспозонах и интегронах) [36, 37, 39]. Для определения БЛРС можно использовать следующие методы. Олиготипирование - метод основан на использовании наборов олигонуклеотидных зондов, позволяющих выявлять точечные мутации в генах известных Р-лактамаз. На использовании олигонуклеотидных зондов основаны технологии ДНК-чипов. ПЦР метод является наиболее практичным методом диагностики, который используется для выявления генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, включая гены Р-лактамаз. Для этой цели используют различные варианты ПЦР: метод одноцепочечного конформационного полиморфизма (PCR-SSCP), анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP), ПЦР в реальном времени (PCR-RT). Также возможно использование лигазной цепной реакции (ЛЦР). Метод секвенирования является «золотым стандартом» для идентификации неизвестных продуктов амплификации, что позволяет определять новые варианты ферментов [13]. 3. Нарушение проницаемости внешней мембраны микробной клетки. Грамотрицательные бактерии наряду с цитоплазматической имеют наружную мембрану (НМ). НМ состоит из фосфолипидов, а внешняя ее часть образована липополисахаридами (ЛПС). Именно этот факт служит объяснением аномально низкой проницаемости мембраны для липофильных веществ. Среди белков НМ бактерий доминируют интегральные P-структурированные белки, предназначенные для пассивной диффузии гидрофильных молекул с молекулярной массой не более 600 Да. Они образуют трансмембранные водонаполненные каналы (или поры), которые обеспечивают обмен низкомолекулярными веществами между клеткой и внешним окружением. Наиболее изученными на данный момент являются порины НМ E.coli - OmpF, OmpC и PhoE [1]. Проницаемость мембраны является важным свойством, определяющим чувствительность или резистентность микроорганизма к антибактериальным препаратам. Мелкие гидрофильные молекулы, такие как Р-лактамные антибиотики, используют поры для проникновения внутрь клетки. Гидрофобные вещества диффундируют через липидный бислой. Изменение проницаемости мембраны к Р-лактамным антибиотикам происходит двумя способами: потеря-обратимое уменьшение количества пор на поверхности мембраны либо замена одного вида пор на другой; изменение функции пор вследствии мутаций в генах [14]. Tran Q.T. et al. обнаружили, что для штаммов Providencia stuartii, резистентных к цефепиму, цефотаксиму и эрта-пенему, характерна пониженная экспрессия поринов OmpF и OmpC [46]. Среди 45 резистентных штаммов Enterobacter aerogenes у 44% наблюдалось уменьшение количества пор [12]. У клинических изолятов Serratia marcescens, устойчивых к меропенему, отсутствовали OmpF поры НМ [44]. В исследованиях Lou H. et al. выявлены три мутации OmpC20 и OmpC33, модулирующие способность транспортировки небольших молекул и антибиотиков через НМ. Особенно это четко прослеживалось для такого антибактериального препарата, как цефотак-сим [32]. Doumith M. et al. обнаружили, что у клинических изолятов K. pneumoniae и E. aerogenes с высоким уровнем эртапенем устойчивости отсутствовали поры OmpC и OmpF. В генах, кодирующих данные пориновые каналы, были обнаружены различные точечные мутации, а также наличие вставочных последовательностей [15]. Устойчивость к антибактериальным препаратам зачастую является результатом комбинации нескольких механизмов, например, выделение Р-лактамаз и снижение проницаемости мембраны и активное выведение антибиотиков (эффлюкс-система). Поэтому для точной верификации причины устойчивости необходимо комплексное исследование. 4. Активное выведение антибиотиков из микробной клетки (эффлюкс). Впервые о существовании системы активного выведения антибиотиков (эффлюкса) из микробной клетки начали говорить в конце 70-х. гг. на примере резистентности к тетрациклинам. Система активного выведения является примером класса транспортеров, задействованных в поглощении необходимых питательных веществ и ионов извне и выделении продуктов метаболизма, а также в процессе взаимодействия между клетками и окружающей средой. Бактериальная система эффлюкса подразделяется на пять семейств. Два из них наиболее обширные ABC (ATP-binding cassette) и MFS (major facilitator superfamily) - являются суперсемействами. Остальные три семейства меньше: MATE (multidrug and toxic compound extrusion), SMR (small multidrug resistance) и RND (resistance-nodulation cell division). C другой стороны, мы можем все семейства подразделить на две группы: однокомпонентные цитоплазматические транспортеры (ЦТ), осуществляющие эффлюкс через цитоплазматическую мембрану, и мультикомпонентные, состоящие не только из ЦТ, а также из протеинового канала внешней мембраны (ПКВМ) и мембранного белка слияния (МБС). Мультикомпонентные транспортные системы катализируют эффлюкс через цитоплазматическую и внешнюю мембраны [28, 29, 38]. Резистентность к Р-лактамным антибиотикам, в основном, обусловлена функционированием RND-эффлюкс системы, но среди представителей Lactococcus lactis встречается ABC система-эффлюкса [38]. Гграмотрицательные бактерии, использующие эффлюкс для выведения Р-лактамных антибиотиков, описаны Li X.Z. и Nikaido H. [29, 30]. К настоящему моменту наиболее изученной системой эффлюкса является AcrАВ-TolC у E.coli, где AcrB является ЦТ, AcrA - МБС и TolC - ПКВМ. Рассмотрим более подробно процессы регуляции на ее примере. Регуляция системы эффлюкса осуществляется на двух уровнях: локальном и общем. Экспрессия многих транспортеров контролируется локальными регуляторами, большинство из которых являются репрессорами. Например, у E.coli ген acrR кодирует соответствующий репрессор acrR, принадлежащий к семейству TetR репрессоров, acrR связывается с промоторами генов acrAB и acrR и тем самым подавляет транскрипцию ЦТ - acrB и МБС - acrA, а также свою собственную. За общий уровень регуляции ответственны, по крайне мере, три активатора транскрипции: MarA, SoxS, Rob [29]. SoxR является димером и содержит [2Fe±2S] кластер. При взаимодействии c супероксидом или оксидами азота происходит окисление кластера (Fe3+±Fe3+) и активация SoxR, а при отсоединении - восстановление кластера (Fe2+±Fe3+) и дезактивация [27]. SoxR активирует ген soxS путем промоторной деформации, данный способ регуляции имеет сходство с взаимодействием MerR и Hg2+[6]. Воздействие SoxS увеличивает транскрипцию acrAB оперона и таким образом опосредованно влияет на возрастание уровня резистентности. Mar-локус сотоит из двух дивергентных частей (marRAB и marC), экспрессирующихся от центрального промотора (marO). MarR и MarA являются репрессором и активатором соответственно, а функция MarB и MarC остается неизвестной. MarR имеет форму димера и осуществляет негативную регуляцию marRAB, связываясь с marO. Ингибирование MarR происходит при присоединении салицилатов. MarA контролирует экспрессию более 60 генов, в том числе, acrAB оперона, активация последнего приводит к увеличению эффлюкса антибиотиков [29]. В свою очередь, на данный момент существует, по крайней мере, 15 генов, которые влияют на MarA-опосредованную антибиотикорезистент-ность: это nikD, degP, recD, yibL, maoC, yniD, treC, crp, hns, cyaA, pcnB, acrA, acrB, tolC и damX. Такое разнообразие регуляторных генов может быть следствием многогранности действия антибиотиков, а также клеточного ответа на них. С другой стороны, такая система позволяет распознавать различные сигналы извне и, тем самым, лучше адаптироваться к окружающей среде [40]. Rob значительно отличается от вышеописанных регуляторов. Во-первых, вместо стресс-индуцированного синтеза de novo, характерного для MarA и SoxS, его уровень остается постоянным - около 5000 - 10 000 молекул на клетку. Во-вторых, в отличии от SoxS, MarA, состоящих из одного домена, Rob содержит второй домен CTD (C-terminal domain). В-третьих, он синтезируется в неактивной форме [26]. Как уже было сказано, концентрация Rob-белков остается постоянной втечение всего клеточного цикла, таким образом, его активность должна регулироваться на посттрансляционном уровне путем модификации или присоединения ко-фактора [7]. Griffith et al. предполагают, что внутриклеточная локализаци Rob обеспечивается механизмом «изолирования-рассеивания» (sequestration-dispersal). Благодаря CTD домену происходит формирование внутриклеточного фокуса, что изолирует Rob от транскрипционных факторов. При воздействии различных тригеров (жирные и желчные кислоты и дипиридил) Rob высвобождается из его «изолирования» и переходит в стадию «рассеивания», где он способен активировать трансляцию генов [26]. Известно, что Rob также способен влиять на acrAB оперон. Экспрессия гена TolC увеличивается при повышении продукции MarA, SoxS и Rob. Кроме того, MarA и SoxS уменьшают синтез белков пор OmpF путем индукции micF, который является антисмысловым РНК продуктом, взаимодействует с ompF мРНК и предотращает его трансляцию. Таким образом, повышенный синтез компонентов системы эффлюкса (AcrАВ-TolC) совместно с понижением экспрессии пор на поверхности цитоплазматической мембраны препятствует попаданию молекул антибиотиков внутрь клетки [29]. При сравнении патогенных и непатогенных микроорганизмов было выявлено, что количество мультирезистентных систем эффлюкса, кодируемых хромосомными генами, приблизительно одинаковое [43]. Гены системы эффлюкса присутствуют как у резистентных, так и у чувствительных штаммов. Таким образом, возникает вопрос: почему часть микроорганизмов является устойчивыми к антибактериальным препаратам, а другая нет? Было отмечено, что для большинства резистентных штаммов уровень экспресии генов, задействованных в системе эффлюкса, значительно выше, чем у представителей «дикого» типа [18]. Mazzariol А. et al. сообщают, что среди 10 клинически резистентных изолятов E.coli у 9 отмечается сверхэкспрессия гена acrA [34]. У 14 из 18 изолятов P.aeruginosa выявлена повышенная экспрессия MexAB-OprM системы эффлюкса [20]. Увеличение количества регуляторов marA и soxS приводит к усиленной экспрессии AcrAB-TolC комплекса у E.coli [5, 16]. Клинически значимая антибио-тикорезистентность, обусловленная сверхактивацией системы активного выведения антибиотиков, была также обнаружена у E. cloacae [31], P. mirabilis [41], K. pneumoniae [3], S. marcescens [33]. Механизмы, ответственные за сверхэкспрессию генов системы эффлюкса, можно подразделить на несколько групп: 1. мутации в гене локального регулятора; 2. мутации в генах общей регуляторной системы; 3. мутации в гене промоторного региона транспортеров; 4. включение IS в ген, кодирующий транспортер эффлюкс системы [14, 35]. Сверхэкспрессия генов может быть изучена двумя способами: измерением РНК с использованием ПЦР с обратной транскрипцией (reverve PCR) или методом вестерн-блоттинга (Western blotting) [14].

About the authors

V. S Dyachkova

Northern State Medical University, Arkhangelsk, Russia

T. A Bazhukova

Northern State Medical University, Arkhangelsk, Russia

References

Supplementary files