PROTEOMIC MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS OF FRESHLY ISOLATED ESCHERICHIA COLI STRAINS

Full Text

Изменение нормального состава микробиоценоза толстого кишечника, определяемое понятием дисбактериоз, является широко распространенным состоянием и, согласно современным данным, представляет патогенетическую основу разнообразных по локализации и проявлению патогенетических процессов, включая такие как липидный дистресс-синдром, сахарный диабет 2 типа, ожирение, атеросклероз, метаболический синдром [1, 2]. С целью ранней диагностики и выявления людей, составляющих группу риска развития подобных состояний, актуальной задачей является определение специфических особенностей состава микробиоценозов, позволяющих разработать методические критерии диагностики и прогнозирования различных заболеваний [3]. В предыдущих наших исследованиях было показано, что в этиологической структуре дисбактериозов толстого кишечника людей значительное место занимают дисбактериозы, обусловленные эндогенными факторами [6], одним из которых являются дисфункциональные нарушения желчевыделительной системы, а микробиологическим маркером этих состояний служит наличие гемолитических эшерихий в составе микробиоценоза толстого кишечника [7]. Коррекция функции желчного пузыря приводит к исчезновению гемолитического признака у эшерихий, что свидетельствует о его индуцибельности. В работе [3] подчеркнуто, что в основе бактериально-гостальных отношений лежит полиморфизм клонов кишечной палочки. При этом выделено четыре кластера эшерихий (мутуалисты, коменсалы, паразиты, случайные симбионты человека), в связи с чем предложен поиск маркеров, способных обеспечить их дифференциальную характеристику. Поиск маркеров протеома у различных кластеров эшерихий, в частности, у гемолитических и негемолитических форм является актуальной проблемой, расширяющей перспективы дифференциальной диагностики, анализа происхождения факторов патогенности эшерихий и совершенствования подходов к коррекции дисбиотических состояний. Наше внимание привлек метод масс-спектрометрии на основе матричноактивированной лазерной десорбции (MALDI) в комплексе с анализатором TOF (Time of Flight). Принцип метода основан на детекции прибором белковых спектров молекул, которые в случае характеристики микроорганизмов составляют комплекс константных рибосомальных белков, характерных для изучаемого микроорганизма, что открывает перспективы протеомного анализа штаммов определенного вида и поиска сходств и отличий в их белковых профилях. В связи с изложенным, целью нашего исследования явилась идентификация про-теомных маркеров, характерных для гемолитических и негемолитических эшерихий, а также эшерихий-ассоциантов условно патогенных энтеробактерий путем масс-спектрометрического анализа свежевыделенных от человека штаммов кишечной палочки. Популяции кишечной палочки выделяли и идентифицировали бактериологическим методом в соответствии с ОСТ 2003 г. от людей, проходивших обследование на дисбактериоз толстого кишечника в Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии. УЗИ людей на наличие дисфункциональных нарушений желчного пузыря (ДЖВП) осуществляли в медицинском лечебно-диагностическом центре ООО «Альянс-2000». Для масс-спектрометрического анализа было взято 135 свежевыделенных штаммов кишечной палочки, из них 20 штаммов гемолитических эшерихий (монопопуляция), выделенных от одного человека с ДЖВП; 100 штаммов негемолитических эшерихий (монопопуляция) от одного человека; 15 штаммов негемолитических вариантов, выделенных из ассоциации с условно патогенными энтеробактериями (клебсиеллой, энтеробактером) от одного человека. Исследования проводили с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF MS Autoflex «Bruker Daltonik» (Германия). Пробоподготовку осуществляли с применением в качестве матрицы а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (HCCA, Bruker Daltonik). Все образцы штаммов проводили через процедуру экстракции трифторуксусной кислотой (80% ТФУ) для создания репрезентативных спектров. Супернатант штаммов в количестве 0,5 мкл помещали на ячейки MSP-чипа и после полного высыхания наслаивали 0,5 мкл раствора матрицы. В программе Flex control проводили обстрел лазером в ручном режиме. В качестве стандарта калибровки использовали коммерческий препарат DH5-alpha Escherichia coli (Bruker bacteria test standart). В качестве контроля использовали масс-пик-листы (MSP-peak-list) и графики масс-спектров референтных штаммов: E.coli ATCC 25922 CHB; E.coli ATCC 35218 CHB; E.coli ATCC 25922 TH4; E.coli B 421 UF4; E.coli DH5-alpha BR4; E.coli DSMS 300 83 THAM; E.coli ESB4-EA-RSS-1528TCHB базы данных Biotyper. Для визуализации, постобработки и анализа полученных спектров, в частности, масс-пик-листов штаммов, использовали программу Flex analysis. Измерения осуществлялись в автоматическом режиме с контролем мерцания, частотой измерения лазера от 50 до 60 Гц, излучения лазера 1:25 кВ, с использованием источника ионов № 1 со значением 19,52 кВ и источника № 2 со значением 18,26 кВ и коэффициентом усиления детектора 27272 В. В процессе сравнительного анализа спектров представителей разных популяций E.coli сравнивали такие параметры, как положение пиков, их частота и интенсивность. Графическое изображение спектра, состоящее из пиков разной интенсивности (коротких и длинных), является отображением масс-пик-листа, который представляет собой таблицу с числовыми значениями основного белкового спектра каждого штамма, где в первом столбце - молекулярная масса белков (их масс-заряд - m/z), во втором - количество белков с конкретной молекулярной массой, выражающееся в интенсивности пика (в %), на графике в высоте пика [5]. Нами выявлены общие закономерности строения протеома, характерные для всех популяций вида E.coli : наличие у всех штаммов 70 пиков; наличие одного пика со 100% интенсивностью; минимальное количество высокомолекулярных пиков, имеющих m/z >10 000 Da; низкомолекулярные белки представлены спектром от 3000 до 4000 Da, практически равное количество пиков с m/z 3000 - 4000 Da у всех штаммов низкой интенсивности; отсутствие у всех штаммов пептидов с m/z до 2500 Da, что также соотносится с характеристикой референтных профилей E.coli из базы данных Biotyper. В качестве маркеров, дифференцирующих монопопуляции, выявлены характерные признаки. Популяция гемолитических эшерихий отличалась тем, что у всех без исключения штаммов самый высокий пик со 100% интенсивностью имел m/z 9063 - 9066 Da. У негемолитических штаммов пик со 100% интенсивностью имел m/z в диапазоне 5381 - 5410 Da и только у 10% m/z составлял 9713 - 9745 Da. Популяция негемолитических эшерихий-ассоциантов была гетерогенна по данному признаку - у 25% штаммов 100% пик имел m/z 5382 - 5383 Da (как у негемолитических), у 42 % - m/z 100% пика составлял 9740 - 9743 Dа (как у гемолитических), а 6% обнаруживали 100% пик с m/z 6258 Da. Для негемолитической монопопуляции характерно наличие двух высокомолекулярных пиков с интенсивностью до 10% m/z 10 140 Da и 10 280 Da, что соотносится с данными референтных штаммов, имеющих такие же пики. Монопопуляция гемолитических эшерихий имеет один высокомолекулярный пик m/z 10 500 Da низкой интенсивности, составляющей 15%. Однако у некоторых гемолитических штаммов появляются белки с молекулярной массой m/z 14 000 Da, что отсутствует как у гемолитической популяции, так и у референтных образцов. Масс-спектры негемолитической популяции в целом интенсивнее, что выражается наличием преимущественно высоких пиков (интенсивностью 40 - 90%), большим количеством низкомолекулярных белков с m/z 3000 - 4000 Da с высокой интенсивностью. Весь спектр гемолитических штаммов отмечает наличие преимущественно коротких пиков низкой интенсивности (до 30%) и только двух пиков высокой интенсивности (70 - 100 %). Применение MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа для идентификации различных патогенов бактериального и грибкового происхождения на основе базы данных Biotyper, включающей 5000 референтных профилей микроорганизмов, является практически рутинным методом, широко освещенным в мировой литературе [4, 9]. Однако программное обеспечение Biotyper 3.0 позволяет получать персональные виртуальные коллекции спектров изучаемых популяций, а программа Flex analysis - анализировать сходство и отличие вновь появляющихся и исчезающих протеомных признаков [5], что обеспечивает не только видовую идентификацию, но и получение новых данных об изменчивости видов. E. coli является тем микроорганизмом, изучение которого лежало в основе идентификации MALDY, так как первые работы были посвящены рутинной идентификации эшерихий и использованию кишечной палочки в качестве бактериального стандарта калибровки для масс-спектром етрии [8]. Большинство современных статей посвящено препаративной идентификации отдельных белков E. coli, предварительно выделенных посредством двумерного электрофореза. Изучение межпопуляционных отличий с помощью анализа спектров коллекций кишечной палочки, выделенных от людей, в литературе не описаны. Нами установлено, что один пик самой высокой интенсивности (100%) может служить дифференциальным протеомным таксономическим признаком, по которому можно определить наличие у штаммов E. coli гемолитических свойств, так как только у гемолитических эшерихий пик со 100 % интенсивностью имеет m/z 9063 - 9066 Да, в отличие от негемолитической популяции, имеющей данный пик с m/z 5381 - 4100 Да. Популяция эшерихий-ассоциантов гетерогенна по данному признаку, хотя и относится к негемолитической группе. Молекулярные массы 100% пика представлены масс-зарядами 9000, 5000, 6000 Да. Референтные штаммы E. coli базы данных Biotyper имеют 100% пик с m/z 5000 Да, что характерно для негемолитической популяции. Данные факты являются косвенным подтверждением версии изменчивости негемолитических эшерихий в условиях организма хозяина и индуцибельности гемолитического признака. В целом спектр белков гемолитических вариантов отличается меньшей интенсивностью (высота пиков до 30%) и наличием только двух пиков высокой интенсивности (70 - 100%). Проведенные нами исследования позволяют конкретизировать данные масс-спектрометрической идентификации, дифференцируя гемолитические варианты от негемолитических по 100% пику, тогда как программа Biotyper не позволяет проводить идентификацию гемолитических вариантов и определяет только принадлежность к виду Escherichia. Проведенные ранее исследования позволили установить, что в составе микробиоценозов толстого кишечника людей с дисфункциональными нарушениями желчевыделительной системы гемолитические эшерихии встречаются достоверно чаще, чем у условно здоровых людей, что позволяет полагать, что нарушение поступления желчи в просвет кишечника, наблюдаемое при ДЖВП, возможно, является одним из факторов, способствующих вегетированию гемолитических эшерихий в микробиоценозах толстого кишечника. Однако данный вид патологии, вероятно, является далеко не единственной причиной, приводящей к появлению в составе микрофлоры кишечника гемолитических эшерихий. Возможно, что на их вегетиро-вание оказывают влияние и другие изменения в желчеобразующих и желчевыделительных органах, что требует дальнейшего изучения. Очевидно, что появление гемолитических эшерихий в составе полостной микрофлоры толстой кишки можно рассматривать как индикатор, реагирующий на изменения гомеостаза хозяина. С этих позиций, ранняя и быстрая идентификация гемолитических эшерихий с помощью таксономических протеомных маркеров является экспресс-методом выявления группы риска формирования заболеваний желчевыводящих путей и пищеварительной системы среди условно здоровых людей.

About the authors

M. N Gapon

Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology

Rostov-on-Don, Russia

N. R Telesmanich

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

L. N Ternovskaya

Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology

Rostov-on-Don, Russia

S. O Chaika

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

I. A Chaika

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

Z. I Mikashinovich

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

T. B Chernukhina

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

T. I Tverdokhlebova

Rostov Research Institute of Microbiology and Parasitology

Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files