ACID-BASE MODULATION OF LYSOZYME ACTIVITY IN MEDIUM FOR CULTIVATION OF ENTEROBACTERIA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Устойчивость бактерий к лизоциму может быть обеспечена специфическими и неспецифическим механизмами, существующими как в форме, связанной с оболочкой бактериальной клетки, так и в виде секретируемых веществ. Дистантные механизмы обезвреживания лизоцима описаны как антилизоцимная активность (АЛА). Известно, что специфическая инактивация лизоцима обусловлена белками-ингибиторами [2], тогда как неспецифические механизмы АЛА обусловлены факторами разнообразной химической природы. Будучи ферментом, лизоцим может быть легко инактивирован изменением кислотно-основного состояния среды [7] или поверхностно-активными веществами [9] . Лизоцим также снижает свою активность в присутствии индола и его производных [10] . Синтезируемые микроорганизмами и растениями алкилоксибензолы способны модулировать не только активность, но и специфичность в зависимости от дозы и химического строения [5]. Среди этих механизмов особый интерес с точки зрения инфектологии вызывает роль каждого из указанных механизмов, за исключением необратимой денатурации лизоцима, вызываемой поверхностно-активными веществами. Среди биотопов организма хозяина единственными мощными детергентами могут служить только свободные желчные кислоты, в значимых количествах присутствующие в тонком отделе кишечника, тогда как наиболее населенные микробиоценозы организма человека локализованы в толстом кишечнике. Напротив, сдвиг кислотно-основного состояния реакционной среды от точки оптимума инактивирует ферменты обратимо в широком диапазоне значений, и биотопы пищеварительного тракта существенно различаются по этому показателю. Кроме того, известные ингибиторы лизоцима выявлены среди гамма-протеобактерий и их типового семейства - энтеробактерий, многие из которых способны также продуцировать индол как один из продуктов своего катаболизма. В то же время, распространенность двух известных специфических факторов антилизоцимной активности среди этого семейства не охватывает всех случаев фенотипического обнаружения антилизоцимного признака. В связи с изложенным, целью настоящей работы стало определение модулирующего воздействия кислотно-основного состояния среды культивирования энтеробактерий на активность лизоцима С-типа. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом для исследования послужили 6 штаммов энтеробактерий: 2 модельных штамма: Escherichia coli BL21(DE3) для экспрессии белков и Escherichia coli K12 MG1655; типовой штамм Salmonella enterica ATCC 14028 и 3 штамма из коллекции лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований ИКВС УрО РАН, выделенные у амбулаторных пациентов при клинико-лабораторном исследовании кишечного микробиоценоза: Escherichia coli №242, Klebsiella pneumoniae №268 и Klebsiella pneumoniae №278, содержащий плазмидный гомолог гена периплазматического ингибитора лизоцима pliC. Кроме того, в качестве контроля метаболической неспецифичности модуляции анти-лизоцимного признака был использован штамм Micrococcus luteus ATCC 15307, применяемый в качестве индикатора ферментативной активности лизоцима. У всех исследуемых штаммов определено наличие генетических детерминант секретируемых белков-ингибиторов лизоцима [4] и проведен тест на образование индола с помощью реагента Ковача [8] («LaChema», Латвия) (табл.). Все исследуемые штаммы инкубировали в 2 мл LB-бульона в течение 24 часов в орбитальном шейкер-инкубаторе ES-20 («Biosan», Латвия) при 37°С и 250 об./мин. По завершению инкубации культуральную среду центрифугировали в течение 10 мин. при 4000 g. Антилизоцимный профиль штаммов, использованных в работе Виды энтеробактерий Специфические ингибиторы лизоцима Образование ivyC pliC индола Escherichia coli BL21(DE3) + - + Escherichia coli K12 MG1655 + - + Escherichia coli № 242 + - + Klebsiella pneumoniae № 268 + - - Klebsiella pneumoniae № 278 + + - Salmonella enterica ATCC 14028 - + - Micrococcus luteus ATCC 15307 - - - Примечание. ivyC - гомологи гена ингибитора лизоцима позвоночных типа C; pliC - гомологи гена периплазма-тического ингибитора лизоцима типа С. ,2 (контроль) и в 0,9 растворе хлорида натрия с pH 7,0 проводились в четырех повторах. В полученных супернатантах измеряли pH при помощи pH-метра Checker HI 1270 («Hanna», Румыния) и проводили определение антилизоцимной активности фотонефелометроическим методом по [3] с изменениями: концентрация лизоцима была повышена до 4 мкг/мл, взвесь микрококка готовилась в 60 mM натрий-фосфатном буфере с pH 6 (опыт). Измерения каждой пробы РЕЗУЛ ЬТАТЫ При определении кислотно-основного состояния культуральной среды установлено, что все исследуемые микроорганизмы, включая M. luteus ATCC 15307, при указанных условиях через 24 часов культивирования изменяли pH жидкой питательной среды LB с исходного значения 6,6±0,1 до 8,2±0,2 ед. Измерение антилизоцимной активности фотометрическим методом с использованием 0,9% раствора хлорида натрия (pH 7,0) вместо натрий-фосфатного буфера для приготовления взвеси индикаторного тест-штамма с целью сохранения уровня кислотности исходной культуральной жидкости показало ингибирование активности лизоцима на 85 - 90% по сравнению с контролем во всех исследуемых пробах, в результате чего различия в антилизоцимной активности между исследуемыми штаммами оказались недостоверными. Проведение контрольного фотонефелометрического анализа антилизоцимной активности по стандартной методике с 60 mM натрий-фосфатным буфером (pH 6,2) выявило межродовые различия в уровне антилизоцимной активности между энтеробактериями (1,5±0,2 мкг/мл х ОП у кишечных палочек и 2,2±0,3 мкг/мл х ОП у бесплазмидного штамма клебсиеллы) и между штаммами, отличающимися по присутствию гена специфического секретируемого ингибитора лизоцима pliC (у штаммов-носителей гена pliC уровень АЛА составил 3,8±0,4 мкг/мл х ОП). Полученные значения находятся в согласии с ранее опубликованными данными [4]. Внутривидовые различия между исследуемыми штаммами E.coli не выявлены. Собственная антилизоцимная активность индикаторного тестштамма M. luteus №2665 в этом случае также не выявлялась. ОБСУЖДЕНИЕ Несмотря на то, что параметры сред, определяющие эффективность ферментативных реакций, хорошо изучены, в том числе на лизоциме типа C, который является модельным ферментом класса гидролаз [6], многообразие этих условий и их сочетаний, возможных in vivo, зачастую не позволяет построить адекватную модель взаимодействия микроорганизма с каким-либо биохимически активным белком. Тем большее значение приобретает сравнительная оценка вклада каждого из возможных компонентов и тщательность подбора инвариантных условий in vitro. Наиболее наглядным неспецифическим параметром среды взаимодействия ферментмикроорганизм является кислотно-основное состояние. Полученные нами данные о снижении на порядок активности лизоцима от оптимальной в среде с pH>8,0 полностью согласуются с кривой зависимости ферментативной активности лизоцима от pH реакционной среды [7]. Из экспериментальных данных, полученных в этой работе, не удалось выявить роль индола как ингибитора лизоцима, но базы данных аннотированных геномов показывают высокую вариабельность распределения не только специфических ингибиторов лизоцима, но и гена, кодирующего триптофаназу (фермент продукции индола) среди разных родов энтеробактерий. Дополнительно обращает на себя внимание тот факт, что M. luteus, являясь индикаторным штаммом для определения антилизоцимной активности, при культивировании изменяет pH среды в том же направлении и в той же степени, что и филогенетически отдаленные от него энтеробактерии. Что приводит к снижению активности лизоцима в среде с микрококком в той же мере, что и в культуральной жидкости энтеробактерий. Это совпадение может объясняться реализацией сходных путей катаболизма в богатой среде с высоким содержанием аминокислот, к числу которых относится не только среда Лурия (LB-бульон). Кроме того, данный факт может служить объяснением существенно более низкого уровня антилизоцимной активности, измеряемой фотонефелометрическим методом по сравнению со значениями данного признака, выявляемыми при использовании чашечного метода [1] или при сопоставлении измеренного уровня АЛА высокоперсистентных штаммов не только грамнегативных, но и грампозитивных микроорганизмов (без защитного эффекта наружной мембраны) с реальной концентрацией лизоцима в биотопе. В то же время, в случае ряда иных микроорганизмов из различных биотопов организма хозяина направление изменения pH различных сред может быть противоположным. Прежде всего, это касается продуцентов молочной, уксусной, масляной и других органических кислот с короткой цепью - таких, как представители родов Lactobacterium, Bifidobacterium и Propionibacterium [11]. Что же касается возможности экстраполяции получаемых in vitro данных на биотопы организма человека, прежде всего - биотопа слизистой толстой кишки, то необходимо учитывать следующие параметры: емкость буферных систем хозяина, суммарную продукцию конечных метаболитов того или иного типа наиболее многочисленными представителями микросимбиоценза, а также важность локальных изменений микроокружения клеток исследуемого микроорганизма. Принимая во внимание все вышеизложенное, следует признать: модели микросим-биоценотических взаимодействий in vitro требуют тщательной доработки с учетом как множества химических параметров биотопа, так и симбиотического окружения исследуемого микроорганизма.

About the authors

S. V Andryuschenko

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

N. B Perunova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

References

Supplementary files