ULTRASTRUCTURE OF MICROBIAL BIOFILMS DURING INTERCELLULAR INTERACTIONS OF BACTERIA IN COMMUNITIES

Full Text

В настоящее время показана способность условно патогенных бактерий к образованию микробных биопленок при воспалительных процессах в офтальмологии, оториноларингологии, гастроэнтерологии, урологии и гинекологии. Сформированные биопленки представляют собой однородные или смешанные микробные сообщества, выстилающие поверхность слизистых оболочек желудочно-кишечного и урогенитального трактов человека. Инфекции, ассоциированные с образованием возбудителем микробной биопленки, становятся все более опасными из-за развития хронических форм течения воспалительных процессов [1, 8, 9]. Образование биопленок связано с коммуникативным проявлением чувства кворума (Quorum Sensing - QS) бактерий в сообществах, характеризующихся большой плотностью популяции и высокой физиологической активностью составляющих его особей [20]. Показано, что после завершения этапов адгезии и колонизации возбудителем поверхности слизистой оболочки бактерии начинают активно выделять белковые и полисахаридные субстанции, заполняющие межклеточное пространство [15]. В случае условно патогенных бактерий (УПБ) их концентрация в очаге инфекции достигает плотности 106 - 109 клеток/см2, что указывает на возможное формирование микробной биопленки. Указанная численность возбудителя имеет важное значение для синтеза возбудителем биомолекул, ассоциированных с проявлением вирулентности. Можно полагать, что формируется своего рода ассоциативный патологическмй мезомикробиоценоз. Образование микробных сообществ подобного типа имеет важный биологический смысл, так как клетки возбудителя, находясь в составе биопленок, лучше защищены от факторов врожденного иммунитета и действия этиотропных препаратов [15, 19]. При дисбиозах кишечного и урогенитального трактов колонизация слизистых оболочек УПБ может выглядеть наподобие бактериального «газона», т.е. биопленки, выстилающей поражаемую поверхность, при этом клетки возбудителя, входящие в состав биопленок, способны к транслокации из просвета биотопа в системный кровоток и метастазированию [1, 3]. Дисбиозы кишечника и бактериальные вагинозы. В открытых биотопах может наблюдаться смещение равновесия в составе микробиоценоза и формирование на слизистой оболочке бактериальной биопленки, основой которой являются ассоциации определенных видов УПМ. С нашей точки зрения, микробиоценоз - это всегда ассоциация микроорганизмов. При дисбиозах кишечника образуется ассоциативный патомикробиоценоз, который выявляется при липидном дистресс-синдроме, обострении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, болезни Крона, миокардитах, бронхиальной астме, диабете 2 типа, ожирении, атеросклерозе, бактериальном вагинозе и других соматических заболеваниях [1, 5, 6, 19]. Проблема дисбактериоза кишечника не нуждается в конкретизации и широко представлена в литературе [3, 24]. Что касается микробиома вагинального тракта женщин и бактериального вагиноза, то новая информация буквально перевернула наши представления о них [4]. Оригинальные работы отражены в зарубежных публикациях [16, 17, 21, 25], включая выдвинутую новую концепцию бактериального вагиноза [23]. В ходе реализации международного проекта «Микробиом человека» было установлено, что влагалище здоровой женщины могут колонизировать до 20 видов различных представителей лактофлоры. При этом для нормоценоза характерно доминирование одного вида Lactobacillus spp., лишь только в 8% случаев наблюдений регистрировали наличие более одного вида лактобацилл в вагинальном биотопе. Ранее в качестве превалирующего вида вагинальной микроэкосистемы здоровой женщины рассматривали L.acidophilus. В соответствии с современной таксономической классификацией комплекс L.acidophilus включает в себя несколько видов, в том числе собственно L.acidophilus, а также Lxrispatus, L.gasseri, L.jensenii, L.iners, L.johnsoni, L.amylovorus, L.amylolyticus, L.gallinarium. Авторы указывают на явное доминирование вида Lxrispatus в вагинальном биотопе здоровых женщин (32%). Наряду с Lxrispatus в условиях нормофлоры с различной частотой выделяются L.gasseri (5%), L.jensenii (23%) и L.iners (15%) [17]. Частота нарушения микробиоценоза вагинального биотопа среди небеременных женщин репродуктивного возраста составляет 15 - 25%. Во время беременности в группах повышенного риска она возрастает до 30 - 38% [21]. Недавно молекулярно-генетическими методами при бактериальном вагинозе выявлены микробные ассоциации, которые, с нашей точки зрения, можно отнести к ассоциативному патологическому микробиоценозу, включающему Atopobium vaginae, Gardnerella vaginalis, Bacterial Vaginosis Associated Bacteria (BVAB-1, BVAB-2 и BVAB-3), Megasphaera type 1, Megasphaera type 2, Mycoplasma hominis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisi, Eggerthella spp., Leptotrichia amnionii, Sneathia sanguinegens, Peptostreptococcus ssp., Prevotella buccalis-like и Prevotella spp. [23, 25]. Можно полагать, что переход состояния патомикробиоценоза в хронический воспалительный процесс связан с формированием полимикробной бактериальной биопленки определенного состава. Так как для условно патогенных микроорганизмов нет нозологической специфичности и локализации инфекционного процесса, то активизация синтеза дисбиозной микрофлорой, входящей в состав формированного патомикробиоценоза, токсических субстанций и специфических протеаз сопровождается повреждением клеток организма хозяина в месте локализации инфекционного очага. Электронно-микроскопические исследования биопленок микроорганизмов различных таксономических групп. С помощью методов трансмиссионной (ТЭМ) и сканирующей (СЭМ) электронной микроскопии выявлена сложная ультратонкая организация микробных биопленок, одним из основных компонентов которых является комплекс защитных структур [9, 11]. На ультратонких срезах биопленки однородных и смешанных микробных сообществ бифидобактерий, лактобацилл, лактококков, энтерококков, стафилококков, псевдомонад, различных видов энтеробактерий и грибов рода Candida, выращенные на соответствующих плотных средах, со стороны воздуха защищены комплексом оригинальных поверхностных структур, объединяющих все клетки в единую систему [9, 11]. Структура, находящаяся с наружной стороны биопленки - поверхностная пленка, одновременно выполняет и защитную, и объединяющую микробное сообщество функцию. Основным элементом поверхностной пленки является трехслойная мембрана, ультра-тонкое строение которой соответствует универсальной плазматической мембране. Поверхностная пленка, наряду с трехслойной мембраной, включает дополнительные структуры в виде аморфных полисахаридных слоев, образующихся с внутренней или с внешней, а в некоторых случаях и с обеих сторон одновременно. Поверхностная пленка служит универсальной защитной структурой в микробных сообществах различного типа и обнаруживается в составе биопленок бактерий различных таксономических групп [7 - 9, 11]. Повышенная устойчивость бактерий к действию различных повреждающих факторов ассоциируется также с экранированием клеток в биопленке белковыми слоями у золотистых стафилококков и полисахаридными слоями межклеточного матрикса у эшерихий, заполняющими толщу микробного сообщества. Роль антибиотикоподобных субстанций при антагонистических взаимоотношениях. С проблемой организации и регуляции процесса образования биопленок напрямую связан вопрос активного синтеза бактериальными клетками различных биологически активных веществ, в частности, антибиотикоподобных субстанций - бактериоцинов. Так, например, образование in situ представителями нормальной микрофлоры субстанций, ответственных за антагонистическую активность (а возбудителями - факторов патогенности), происходит, как правило, при достижении определенной плотности микробных популяций. В связи с этим, важной задачей представляется регуляция стимуляции образования биопленок пробиотическими бактериями и подавление развития биопленок в случае адгезии и колонизации УПБ. При профилактике и комплексной терапии дисбиозов существенным моментом является уровень и спектр антагонистической активности вводимых в организм пробиотических бактерий, в частности лактобацилл [2, 18]. Показано, что при перораль-ном применении пробиотиков в кишечнике значительно дольше сохраняются те пробиотические интродуценты, которые синтезируют различные антимикробные пептиды, в частности, бактериоцины и бактериоциноподобные вещества [12, 22, 24]. С целью выявления подавляющего воздействия бактериоцинов на развитие биопленок исследованы ультраструктурные изменения в клетках различных видов УПБ при их взаимодействии с бактериоциногенными лактобациллами L.acidophilus D75, L.fermentum 97 и L.plantarum 8PA-3 [10, 11, 13]. Установлено, что ультраструктурные изменения в клетках Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Escherichia coli O157 и Candida albicans при их совместном выращивании с лактобациллами проявлялись как на клеточном, так и на популяционном уровне. Морфометрический анализ клеток УПБ свидетельствовал о существовании нескольких механизмов их повреждения. На популяционном уровне изменялось соотношение различных морфологических типов клеток тест-культур, что проявлялось в увеличении доли инволюционных, лизированных и покоящихся форм бактериальных клеток. Интенсивность выявленных ультраструктурных изменений в клетках УПБ коррелировала с продолжительностью воздействия бактериоцинов. Деструктивные изменения в клетках тест-культур выражались в расширении периплазматического пространства, образовании фестончатых форм, разрежении цитоплазмы и разрушении белково-рибосомального комплекса. Во всех случаях in vitro отмечали подавление образования биопленок УПБ бактериоцинами. Подавление биопленкообразования E. coli М-17 и Staphylococcus aureus 12 антибиотиками. Проведенный нами in vitro сравнительный анализ действия аугментина (ингибиторзащи-щенный синтетический аминопенициллин) на развитие биопленок лактобацилл, кишечных палочек и золотистых стафилококков показал, что препарат подавляет биопленки эшерихий и стафилококков и не ингибирует рост и развитие биопленок лактобацилл, что было подтверждено при использовании электронной микроскопии [14]. В модельных условиях in vitro действие аугментина на биопленки Exoli М-17 сопровождалось выраженными деструктивными изменениями практически всех клеток микробной популяции. На электронограммах выявлены полностью лизированные клетки кишечных палочек, фрагменты их цитоплазматических мембран и клеточных стенок с агрегатами белково-рибосомального комплекса, при этом целостность поверхностной пленки сохранялась. Ультраструктурные изменения в биопленках стафилококков in vitro были практически идентичны таковым, наблюдаемым у кишечных палочек, выращенных в присутствии аугментина. Вследствие особенностей строения клеточных стенок грампо-ложительных стафилококков в толще деструктурированных биопленок отмечали фрагменты пептидогликановых слоев их клеточных стенок. Интерес представляли исследования по воздействию ингибиторзащищенного синтетического аминопенициллина в опытах in vivo. Электронно-микроскопическими методами у контрольных мышей удалось обнаружить смешанные микробные биопленки на поверхности колоноцитов. Одновременно при бактериологическом анализе и электронно-микроскопическими методами у мышей, обработанных аугментином, выявлено значительное снижение в содержимом толстой кишки численности грамотрицательных бактерий при доминировании грамположительной микрофлоры, включая представителей рода Lactobacillus. При электронной микроскопии удалось выявить подавление развития бактериальных биопленок грамотрицательных энтеробактерий и грамположительных кокков аугментином, в то время как наличие внутрибиопленочных резистентных к данному препарату грамположитель-ных палочек, включая предположительно и лактобациллы, обеспечивало сохранение последних в условиях in vivo [14]. Таким образом, к настоящему времени накопилось значительное количество данных о том, что микроорганизмы in vivo существуют преимущественно в виде целостных и сложно организованных микробных сообществ - микроколоний и биопленок. Микробные сообщества представляют собой социальные системы, характеризующиеся определенной кооперацией и функциональной специализацией входящих в их состав клеток, что обеспечивает им ряд преимуществ [7, 8, 15, 19]. Следует отметить, что нормальная микрофлора кишечника и урогенитального тракта, также как и местный инфекционный очаг, образованный УПБ, представляют собой смешанное микробное сообщество, функционирующее в составе ассоциативной «неслучайной» биопленки, распределенной по поверхности слизистой оболочки. Благодаря особой ультраструктурной организации микробных сообществ подобного типа, а именно наличию поверхностной пленки и активно развитому межклеточному матриксу, бактерии в биопленках характеризуются большей устойчивостью к действию химиотерапевтических препаратов и лучше защищены от фагоцитоза, действия лизоцима, белков системы комплемента, антител и цитокинов [8, 9, 15]. Помимо дисбиозов желудочно-кишечного и урогенитального трактов, при которых наблюдается развитие воспалительных процессов, вызванных ассоциациями УПБ, можно привести многочисленные примеры, когда причиной одного и того же заболевания, склонного к рецидивирующему течению патологического процесса, могут выступать различные представители условно патогенной микрофлоры того или иного микробного биотопа, в том числе, кожи, полости рта, репродуктивного тракта женщин и др. В ряде случаев констатируют развитие инфекционного процесса при наличии в патологическом очаге того или иного ведущего патогенного агента на фоне увеличенной концентрации клеток различных видов УПБ и мощной местной воспалительной реакции. Пока не удается установить, на каких этапах развития инфекционного процесса идет формирование биопленки возбудителем, как долго она сохраняется, когда дезорганизуется и под воздействием каких факторов. По-видимому, может иметь место синергизм патогенетического действия сформированного ассоциативного патомикробиоценоза, состав микробного сообщества которого регулируется QS-системой. В заключение следует отметить, что выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфофизиологические изменения бактериальных биопленок отражают ультра-структурную картину проявления взаимоотношений микроорганизмов во внутривидовых и межвидовых сообществах. Полученные данные свидетельствуют о разнохарактерном ответе бактериальных клеток в биопленках при симбиотических или антагонистических взаимоотношениях, отражающих особое социальное поведение микроорганизмов на популяционном и клеточном уровне. Электронно-микроскопический анализ архитектоники и ультраструктуры микробных популяций позволяет расширить понимание сложной проблемы биопленкообразования симбионтными и условно патогенными микроорганизмами.

About the authors

O. V Rybalchenko

St. Petersburg State University, Moscow, Russia

V. M Bondarenko

Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

O. G Orlova

St. Petersburg State University, Moscow, Russia

References

Supplementary files