METAGENOMIC STUDIES AND INFECTIOUS DISEASES DIAGNOSTICS

Full Text

Золотым стандартом секвенирования нуклеиновых кислот является метод Сэн-гера, в основе которого лежит терминирование растущей цепи ДНК дидезоксирибо-нуклеозидтрифосфатами [44]. В основе принципа массового параллельного секвенирования лежит метод «shotgun-sequencing» (метод «дробовика»), заключающийся в фрагментировании ДНК на короткие участки и последующем определении их нуклеотидной последовательности. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей осуществляется с помощью компьютерных биоинформационных программ [29, 32, 40, 50]. Высокая производительность платформ NGS обеспечивается возможностью одновременного секвенирования десятков образцов ДНК. Основные этапы секвенирования представлены на рис. 1. Рис. 1. Этапы секвенирования на платформах NGS. Таблица 1. Основные методы метагеномных исследований и биоинформационные программы, используемые для анализа результатов секвенирования Методы метагеномных исследований Основная характеристика метода Основные базы данных нуклеотидных последовательностей Используемые биоинформационные программы Преимущества Недостатки Секвенирование Метод основан NCBI, QIIME Наиболее простой Не всегда позволяет фрагментов на исследовании Greengenes (quantitaи недорогой метод проводить видовую ДНК, кодируюэволюционно [16], tive insights идентификации, идентификацию. щих эволюционконсервативных Ribosomal into microпозволяющий Наличие избирано консервативгенов - маркеров Database bial ecoохватить широкий тельности «bias» не ные гены (168рРНК) Project logy) [9], круг бактерий [10, дает достоверной с использованием [14], SILVA Mothur 32, 56] информаии универсальных [41] [36] о структуре сообпраймеров щества [10, 15, 32, [10, 22, 32, 35, 50, 56]. В качестве 53, 56] дополнения могут быть использованы гены rpo-B и cpn-60 [15, 32, 56] Секвенирование Метод основан на NCBI, IMG/M Дает возможность Дорогостоящий, суммарной ДНК/ случайной фраг- KEGG [11], MGвыявить широкий высокая степень РНК сообщементации общей [24], RAST [20], спектр микрооргаконтаминации ства путем ее ДНК/РНК, нахоeggNOG CAMERA низмов (бактерии, ДНК человека, случайного фрагдящейся в образце, [36], [47], вирусы, грибы и большой процент ментирования и одновременном COG [49], MEGAN простейшие) и неидентифициро- (wholemetagenome определении SEED [17] [23] провести анализ ванных нуклеотидshotgun sequenнуклеотидной пометаболических и ных последовательcing) следовательности филогенетических ностей, сложный всех полученных взаимосвязей [15, биоинформационфрагментов [15, 22, 22, 32, 50] ный анализ [15, 22, 32, 50] 32, 50] Все существующие платформы NGS основаны на секвенировании путем синтеза с использованием ДНК-полимеразы и секвенировании путем лигирования с помощью ДНК-лигазы [29, 40, 53]. Секвенирование путем синтеза применяется на платформах, выпускаемых фирмами Roche (Швейцария) (http://www.454.com/), Illumina (США) (http://www.illumina. com), IonTorrent/LifeTechnologies (США) (http://www.iontorrent.com/). Пиросеквена-торы 454 фирмы Roche основаны на детекции хемилюминесцентного сигнала, формирующегося в результате высвобождения пирофосфата при присоединении соответствующего дезоксирибонуклеозидтрифосфата (дНТФ) ДНК-полимеразой, для получения разобщенных фрагментов используется эмульсионная ПЦР (эПЦР) на микрошариках [29, 40, 53]. Секвенаторы, выпускаемые фирмой Illumina, основаны на регистрации флуоресцентного сигнала при присоединении ДНК-полимеразой одного из четырех дНТФ, помеченного определенным флуорофором, фрагменты ДНК фиксируются на поверхности стеклянного чипа проточной ячейки и амплифициру-ются методом «bridge amplification» (амплификация мостом) [29, 40, 53]. Принцип технологии, используемой полупроводниковыми секвенаторами IonTorrent производителя LifeTechnologies, основан на детекции изменения рН при выделении одного протона водорода в результате встраивания дНТФ ДНК-полимеразой в реальном времени, фрагменты ДНК присоединяются к поверхности микрошариков и ампли-фицируются с использованием эПЦР [29, 40]. Отличительной особенностью секвенирования нуклеиновых кислот путем лигирования является использование ДНК-лигазы - фермента, образующего ковалентную связь между 5'-фосфатом и 3'-гидроксилом в одноцепочечном разрыве ДНК-дуплекса. Данная технология используется платформами SOLiD производителя Applied Biosystem (http://www.appliedbiosystems.com). В процессе лигирования к цепи ДНК присоединяется соответствующий динуклеотид, входящий в состав олигонуклеотидного зонда и несущий определенную флуоресцентную метку. Разделение и амплификация фрагментов ДНК проводится с использованием эПЦР на микрошариках [29, 40, 53]. Метагеномика - это один из разделов геномики, посвященный изучению суммарного генетического материала (метагенома) с целью определения видового состава и метаболических взаимосвязей между представителями микробиоценоза исследуемого образца [2, 15, 35]. Важнейшей особенностью метагеномных исследований является отсутствие необходимости выделения и культивирования микроорганизмов и возможность индикации и идентификации широкого спектра бактерий, вирусов, грибов и простейших [15, 35]. Основные методы метагеномных исследований, базы данных нуклеотидных последовательностей и биоинформационные программы, используемые для анализа результатов, представлены в табл. 1. Одним из важнейших объектов изучения метагеномики является симбиотический микробиом человека. Высокая производительность платформ NGS позволила проводить изучение как отдельных биотопов (респираторного тракта, толстого кишечника, ротовой полости, кожи, вагины), так и крупномасштабные комплексные исследования микробиома здоровых людей, а также вирома человека. Примеры таких исследований представлены в табл. 2. Поскольку ферментативная и биохимическая активность микробиоты прямо или косвенно связана с патогенезом множества заболеваний, то немалый интерес вызывает изучение динамического изменения структуры микробиоценозов биотопов тела человека при различных соматических и инфекционных заболеваниях (табл. 3). В настоящее время все большее значение в лабораторной диагностике придается молекулярно-генетическим методам исследования [22, 32, 53]. Методы, основанные Таблица 2. Изучение микробиома и вирома здорового человека с использованием платформ NGS Объект исследования, число обследованных Метод метагеномного исследования, платформа NGS Автор, год, страна HMP Consortium., 2012 (США, Канада) [49] Бельгия) Li К. et al., 2012 (США) [27] Ravel J. et al., 2011 (США) [43] Charlson E.S. et al., 2010 (США) [11] Bogaert D. et al, 2011 (Нидерланды) [7] Alcaraz L.D. et al., 2012 (Испания) [5] Tyakht A.V et al., 2013 (Россия) [52] Kim M. et al., 2011 (Южная Корея) [25] Minot S. et al., 2011 (США) [33] Образцы 15-18 различных биотопов тела человека, 242 здоровых взрослых человека Образцы 15-18 различных биотопов тела человека, 200 здоровых взрослых человек Вагинальный микробиом, 396 здоровых женщин, относящихся к различным этническим группам: белые, черные, латиноамериканки, азиатки Респираторный тракт (носоглотка и ротоглотка), 29 курящих и 33 некурящих взрослых человека Респираторный тракт (носоглотка), 96 здоровых детей (возраст 18 месяцев) Ротовая полость (зубной налет), 8 человек с различным уровнем состояния здоровья ротовой полости Толстый кишечник (кал), 96 здоровых взрослых человек из различных регионов России Виром толстого кишечника (кал), 5 здоровых взрослых человек Виром толстого кишечника (кал), 6 здоровых человек Секвенирование гена 16S рРНК, 454 GS FLX titanium (Roche) и метагеномной ДНК, GAIIx (Illumina) Секвенирование гена 16S рРНК, 454 GS FLX titanium (Roche) Секвенирование региона V1-V2 гена 16S рРНК на платформе 454 GS FLX (Roche) Секвенирование региона V1-V2 гена 16S рРНК, 454 GS FLX (Roche) Секвенирование региона V5-V6 гена 16S рРНК, 454 GS FLX (Roche) Секвенирование метагеномной ДНК, 454 GS FLX titanium (Roche) Секвенирование метагеномной ДНК, SOLiD4, Ion Torrent PGM (Life Technologies), GS FLX+(Roche), HiSeq 2000 (Illumina) Секвенирование метагеномной вии-русной ДНК, 454 GS FLX titanium (Roche) Секвенирование метагеномной ДНК, 454 GS FLX titanium (Roche) Респираторный тракт больных туберкулезом (мокрота), 22 больных и 14 здоровых Объект исследования, число обследуемых Метод метагеномного исследования, платформа Авторы, год, страна Секвенирование участа^1-У2 гена 16S рРНК,454 GS FLX-Titanium (Roche) Cheung M. K. et al., 2013 (Китай) [13] Секвенирование метагеномной ДНК, 454 GS FLX (Roche) Willner D. et al., 2009 (США) [55] Секвенирование метагеномной ДНК и РНК(кДНК), 454 GS 20 и 454 GS FLX (Roche) Lysholm F. et al., 2012 (Швеция) [31] Секвенирование метагеномной ДНК, Genome Analyzer IIx (Illumina) Wei X. et al., 2013 (Китай) [54] Секвенирование региона V3-V4 гена 16S рРНК, 454- GS FLX (Roche) Fahle'n A. et al., 2012 (Швеция, Англия) [18] Секвенирование участка V1-V2 гена 16S рРНК, 454 GS FLX (Roche) Koren O. et al., 2011, (США) [26] Секвенирование всего гена 16S рРНК на платформе ABI 3730xl (Applied Biosistems); регионов V2, V6 гена 16S рРНК и метагеномной ДНК на платформе 454 GS FLX (Roche) Turnbaugh PJ. et al., 2009 (США, Франция) [51] Секвенирование гена 16S рРНК на платформе 454 GS FLX (Roche) и метагеномное секвенирование на платформе GAII (Illumina) Liu B. et al., 2012 (США) [28] Респираторный тракт 5 больных муко-висцидозом (мокрота) и 5 человек не больных муковисцидозом Респираторный тракт у людей с различными инфекционными заболеваниями нижних дыхательных путей (аспираты), 210 человек (70% дети до 7 лет и 30% 8-92 лет) Толстый кишечник больных гепатитом В (кал), 120 больных и 120 здоровых Кожа при псориазе (биопсия), 10 больных и 12 здоровых Толстый кишечник (кал), ротовая полость (смывы с десен) и атеросклеротические бляшки (эндартерэктомия участка) при атеросклерозе, 15 больных и 15 здоровых Толстый кишечник (кал), 31 пара однояйцевых близнецов, 23 пары разнояйцевых близнецов, их матери (46). Структура микробиома кишечника при ожирении Ротовая полость при заболеваниях па-родонта (зубной налет), 2 больных и 3 здоровых на секвенировании нуклеиновых кислот, позволяют выявлять генетическую структуру как новых, так уже известных инфекционных агентов, осуществлять мониторинг их генетической вариабельности и распространенности. В последние годы в связи с усилением миграции населения, ослаблением санитарного контроля, возникновением атипичных штаммов бактерий и новых вариантов вирусов происходит рост числа случаев инфекционных заболеваний, не имеющих типичной клинической картины [1]. При этиологической диагностике подобных инфекций использование метагеномного подхода приобретает особую актуальность [15, 22, 32, 53]. Метагеномика, по мнению Жебруна А.Б., дает уникальный шанс освоить один универсальный подход взамен многих разнородных методов индикации, идентификации и генотипирования патогенов [3]. Алгоритм детекции патогенов с использованием метагеномного подхода включает многоступенчатый процесс подготовки библиотеки ДНК/РНК, собственно секве-нирование и биоинформационный анализ результатов (рис. 2). В работах зарубежных исследователей описаны примеры выявления ранее неизвестных инфекционных агентов с использованием метагеномного секвенирования на платформах NGS, например, новых штаммов аренавируса, возбудителей лихорадки [8] и менингита [39]; штамма астровируса - возбудителя энцефалита [42]; нового боньявируса, вызвавшего вспышку лихорадки, сопровождающейся тромбоцитопе-нией и лейкопенией [57]; вируса Sosuga семейства Paramyxoviridae - возбудителя острой геморрагической лихорадки [4] и др. Возможность метагеномного секвенирования получать почти полные нуклеотидные последовательности геномов используется для обнаружения новых геновариантов высоко дивергентных вирусов, таких как вирус гриппа [21], вирус папилломы человека [34], ортореовирус [46]. MWVHOfiMJi □ЙрбЗОЦ ■* [тй ноиму дым -* £1н с И1т jYljtifj ftfi |тМ|-IB пгапфйрыш; -* fctHHiftwmaiMHiHH Л шшллэ -* С ТЗЧЗШЫ] ' rUlri цмнчвамм SVWfe-: Рис. 2. Алгоритм детекции патогенов с использованием метагеномного подхода. FastQC - Fast Quality Control; PRINSEQ - Preprocessing and Information of Sequences tool; BMTagger - Best Match Tagger; RefSeq - Reference Sequence Database; IMG - Integrated Microbial Genomic; MetaVelvet - программное обеспечение Velvet для метагеномных данных; SOAP de novo - Shot Oligonucleotide Analysis Package; BLAST - Basic Local Alignment Search Tool. В ряде зарубежных работ метагеномный подход был использован для индикации бактериальных инфекционных агентов. Так, в исследовании Nakamura S. et al. [37] метагеномное секвенирование позволило обнаружить Campylobacter jejuni в образцах кала у больных диареей. Loman N.J. et al. [30] при ретроспективном исследовании образцов фекалий от больных диареей во время вспышки эшерихиоза в 2011 году в Германии получили нуклеотидные последовательности генома нового штамма Escherichia coli O104:H4, позволившие провести генотипирование. Кроме того, в некоторых образцах были обнаружены нуклеотидные последовательности других возбудителей: Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter concisus, Salmonella enterica, наличие которых было подтверждено культуральным методом. Полученные результаты свидетельствуют, что метагеномное секвенирование наряду с традиционными методами культивирования и генотипирования патогенов может применяться при эпидемиологических расследованиях вспышек инфекционных заболеваний. Метагеномные исследования с использованием платформ NGS позволяют установить случаи ко-инфицирования патогенами, для выявления которых отсутствуют коммерческие ПЦР тест-системы. Например, Yang J. еt al. [58] при анализе образцов смывов со слизистой носоглотки у детей с инфекцией нижних дыхательных путей обнаружили в одном образце наличие ассоциации энтеровируса с риновирусом. Nakamura S. еt al. [38] в образцах аспиратов из носоглотки и образцах кала, собранных у детей во время сезонной вспышки гриппа и норовирусной инфекции, обнаружили кроме вируса гриппа наличие полиомавируса WU (Washington University) и корона-вируса человека HCoV-HKU1 в двух образцах аспиратов, а в одном образце кала - эндогенный ретровирус HCML-ARV. Таким образом, метагеномные исследования с использованием технологий массового параллельного секвенирования позволяют решать широкий спектр задач диагностики и эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями, связанных с открытием новых вирусов и бактерий, выявлением известных инфекционных агентов с измененной генетической структурой, изучением динамических изменений микробиоты и определением роли присутствующих в ассоциациях патогенов в развитии актуальных инфекций. Кроме того, результаты метагеномного сек-венирования могут быть использованы как для создания новых, так и для совершенствования существующих диагностических ПЦР тест-систем.

About the authors

A. E Alekseeva

Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Nizhny Novgorod, Russia

N. F Brusnigina

Blokhina Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Nizhny Novgorod, Russia

References

Supplementary files