INTRA-ERYTHROCYTE INVASION OF ESCHERICHIA COLI STRAINS WITH VARIOUS LEVELS OF ANTIHEMOGLOBIN ACTIVITY IN EXPERIMENT

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Одним из типов взаимодействия бактерий с эукариотическими клетками является внутриклеточная персистенция микроорганизмов [11]. Инвазия бактерий в эритроциты как вариант таких взаимодействий описан при некоторых инфекционных процессах [8]. Также известно, что бартонеллы способны к длительной внутриэритроцитарной перси-стенции при бактериемии, приводящей к развитию гемолитической анемии с летальным исходом [10]. Экспериментально установлено, что штаммы Staphylococcus epidermidis, обладающие высокой антигемоглобиновой активностью, способны проникать в эритроциты [1]. Однако механизмы этого явления изучены недостаточно. Один из важнейших этиологических агентов инфекций кровеносного русла Escherichia coli может обладать гемолитической и антигемоглобиновой активностью [3], однако вопрос о возможности внутриэрицитарной инвазии E. coli и роли указанных свойств в этом процессе остается открытым. Целью работы явилось исследование внутриэритроцитарной инвазии штаммов E. coli с различным уровнем антигемоглобиновой активности на модели генерализованной инфекции. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали штаммы E. coli №№ 214-1, 214-18 и 214-23, выделенные из клинического материала, отличающиеся по уровню гемолитической (ГА) и антигемоглобиновой (АнтиНЬА) активности, определенных фотометрическими методами [1, 3]. Эксперименты in vivo проводили на 72 мышах-самцах массой 18 - 20 г с использованием модели генерализованной инфекции [1]. Были выделены 3 опытных и одна контрольная группы животных по 18 особей в каждой. Заражение осуществляли введением в хвостовую вену 0,1 мл взвеси (на 0,9% растворе хлорида натрия) суточной агаровой культуры бактерий в концентрации 85 млн микробных клеток на 1 мл, животным контрольной группы вводили 0,1 мл стерильного 0,9% раствора хлорида натрия. Для инфицирования животных первой группы использовали штамм E. coli № 214-1, обладающий высокой АнтиHbA (6,2 г/л) и низкой ГА (26,1% гемолиза), второй группы - штамм E. coli № 214-18 с низкой АнтиHbA (1,7 г/л), но высокой ГА (73,6% гемолиза), для инфицирования животных третьей группы использовали штамм E. coli № 214-23, характеризующийся низкими значениями АнтиHbA (0,5 г/л) и ГА (10,5% гемолиза). При наблюдении за состоянием животных обращали внимание на появление учащенного дыхания, снижения двигательной активности, отказа от еды, повышения температуры тела, избыточного потребления воды, общего вида животного. Через 24 часа после инфицирования забирали у животных кровь из хвостовой вены для определения уровня гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом [7], выявления бактериемии стандартным бактериологическим методом [5] и для изучения эритроцитов с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ). Из прижизненно полученных образцов крови подготавливали микропрепараты для ЛСКМ по следующей методике. В пластиковую чашку Петри помещали круглое покровное стекло (диаметр 23 мм), на поверхность стекла наносили 2 мл среды культивирования RMPI-1640 (ООО «Биолот», Россия) и 0,02 мл крови опытного животного, параллельно готовили препарат крови контрольного животного. После инкубации в течение 10 мин при 4°C и осаждения взвеси клеток на покровное стекло из чашки пипеткой удаляли среду культивирования RMPI-1640, добавляли 4% раствор параформальдегида и инкубировали 30 мин при 4°C. После удаления параформальдегида на покровное стекло наносили 1 мл 96% этанола для инкубации при 25°C в течение 7 мин. Затем клетки крови отмывали фосфатно-солевым буфером [4] и обрабатывали специфической сывороткой эшерихиозной группы ОКА (ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова), 4 мкл в течение 60 мин при 4°C. После промывания покровного стекла фосфатно-солевым буфером препараты обрабатывали антиглобулиновой сывороткой, меченной флуоресцеин изотиоцианатом («Имтек», Россия), 20 мкл в течение 60 мин при 4°C. Для визуализации эритроцитов использовали синьку Эванса. В каждом микропрепарате было исследовано по 10 полей зрения, каждое поле просканировано в 9 параллельных плоскостях, толщина оптического среза 0,36 - 0,37 мкм (микроскоп Axiovert 200M, конфокальная сканирующая приставка LSM510META, Carl Zeiss, Германия). При сравнительной оценке взаимодействия с эритроцитами штаммов бактерий, отличающихся уровнем ГА и АнтиНbA, определяли адгезивную активность кишечной палочки к эритроцитам, долю (процент) микробных клеток, проникших внутрь эритроцита, от общего числа обнаруженных бактерий, а также долю эритроцитов, внутри которых находились микроорганизмы, по отношению к общему числу эритроцитов. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке c вычислением средней арифметической и стандартной ошибки. Для установления доказательности различий использовали критерий t Стьюдента, различия считались значимыми при р<0,05 [4]. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Через 24 часа после заражения у всех опытных животных появлялись следующие признаки развития генерализованного процесса: снижение двигательной активности, отказ от еды и избыточное потребление воды, учащенное дыхание, повышение температуры тела, шерсть животных была мокрой и взъерошенной. При бактериологическом исследовании крови у всех опытных животных были выделены штаммы E.coli, идентичные по свойствам культурам бактерий, использованным для инфицирования. Состояние животных контрольной группы было идентично изначальному удовлетворительному, ни у одной из контрольных особей не было выявлено бактериемии. При оценке динамики уровня гемоглобина в крови у животных при экспериментальной инфекции было установлено, что у мышей контрольной группы значения этого показателя (от 90,3±2,0 г/л до 96±2,1 г/л) существенно не отличались от нормы (96 г/л) [6]. У животных третьей группы, инфицированных штаммом с низкими ГА и АнтиНЬА, через 24 часа от начала эксперимента и в последующие сроки наблюдалось незначительное снижение гемоглобина крови (p>0,05). У мышей первой и второй групп, инфицированных штаммами с высокими уровнями АнтиHbA или ГА, наблюдали существенное снижение уровня гемоглобина через 24 часа и, особенно, через 48 часов (58,3±0,6 г/л и 69,7±1,1 г/л) от начала эксперимента (p<0,05). Таким образом, наибольшее снижение уровня гемоглобина крови было выявлено у животных, инфицированных штаммами Е.соИ с высоким уровнем АнтиНЬА или ГА. Для проведения сравнительной оценки взаимодействия с эритроцитами штаммов E. coli, отличающихся уровнем экспрессии ГА и АнтиНЬА, были изучены с помощью ЛСКМ 72 образца крови, полученных из хвостовой вены экспериментальных животных. В образцах крови мышей, зараженных штаммом № 214-1 с высоким уровнем АнтиНЬА (I группа), выявлена адгезия кишечной палочки к поверхности 98,5±0,9% эритроцитов. В крови второй группы животных, зараженных штаммом № 214-18 с низким уровнем АнтиНЬА, адгезия E.coli к эритроцитам наблюдалась реже (р<0,05), в 83,3±2,7% случаях. У мышей третьей опытной группы, зараженных штаммом № 214-23 с низким уровнем как ГА, так и АнтиНЬА, адгезию кишечной палочки на эритроцитах не обнаружили. При исследовании образцов крови контрольной группы животных микробные клетки не были обнаружены. Полученные результаты демонстрируют, что адгезия бактерий к эритроцитам чаще наблюдалась при инфицировании животных штаммами E. coli с высоким уровнем антиге-моглобиновой активности. При изучении внутриэритроцитарного расположения кишечной палочки было выявлено, что в образцах крови мышей первой группы, инфицированных E. coli с высокой АнтиНЬА, инвазия бактерий в эритроцит (рис.) наблюдалась в 13 раз чаще, чем при инфицировании животных штаммами с низкой АнтиНЬА и высокой ГА (70±3,4% против 5,5±1,7% пораженных эритроцитов соответственно, р<0,05). Следует отметить, что в образцах крови животных первой группы внутри эритроцитов находилось 15,9±2,6% микробных клеток (от общего количества визуализированных бактерий во всех срезах и плоскостях), а в крови животных второй группы - только 7,2±1,8% (p<0,05). В крови контрольных животных и экспериментальных мышей третьей группы случаев инвазии кишечной палочки внутрь эритроцитов не было обнаружено. Таким образом, в условиях экспериментальной генерализованной инфекции штаммы E. coli с высоким уровнем антигемоглобиновой активности чаще, чем с низким, выявлялись внутри эритроцитов. Взаимодействие E.coli с эритроцитами. ЛСКМ. Ув. 100. Изображения получены с каналов, детектирующих сигнал от ФИТЦ и синьки Эванса. Стрелки указывают на сигнал от ФИТЦ в срединных срезах эритроцита, подтверждая внутриэритроцитарную локализацию E. coli. ОБСУЖДЕНИЕ Развитие генерализованного инфекционного процесса подразумевает взаимодействие микроорганизмов не только с иммунокомпетентными клетками крови, но и с эритроцитами. Одним из вариантов взаимодействия эритроцитов с бактериями может быть внутриэритроцитарная инвазия микроорганизмов [1, 8, 10]. Ранее было показано, что штаммы E. coli проникали внутрь эритроцитов [2], а у детей с гнойно-воспалительными заболеваниями, сопровождавшимися развитием анемии, чаще выделялись возбудители с высоким уровнем антигемоглобиновой активности [2]. Наши исследования подтвердили вышеуказанные результаты и выявили изменения уровня гемоглобина у мышей, зараженных штаммами E. coli с разными показателями ГА и АнтиНЬА Причем, у животных, инфицированных штаммами Е.ссИ с высоким уровнем AninHbA или ГА, чаще наблюдали внутриэритроцитарную инвазию и большее снижение уровня гемоглобина крови, чем у мышей, зараженных штаммом Е.ссИ с низким уровнем AffmHbA и ГА. Возможно, при инвазии в эритроциты наиболее вероятной мишенью E. coli может быть гемоглобин, причем как гемовое железо, так и протеиновая часть гемоглобина [9]. Представленные результаты свидетельствуют, что наряду с гемолитической активностью бактериальных патогенов еще и антигемоглобиновая активность может способствовать снижению уровня гемоглобина крови. Полученные данные расширяют представление о вариантах эритроцитарно-бактериальных взаимодействий при инфекционном процессе [1, 2, 8]. Применительно к условиям экспериментальной инфекции внутриэритроцитарное расположение микроорганизмов может расцениваться как феномен «укрытия» от факторов неспецифической бактерицидной защиты крови макроорганизма. С другой стороны, в клинической практике внутриэритроцитарная инвазия бактерий может способствовать снижению эффективности антибиотикотерапии. В итоге острый инфекционный процесс может принять черты хронического, рецидивирующего заболевания. Вопрос о природе антигемоглобинового фактора и способах его регуляции диктует необходимость продолжения исследований в этом направлении.

About the authors

E. A Schuplova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

S. B Fadeev

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

O. V Bukharin

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis

References

Supplementary files