CHARACTERISTICS OF FORMATION, INHIBITION AND DESTRUCTION OF YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS BIOFILMS FORMING ON ABIOTIC SURFACES

Full Text

Большинство видов бактерий существуют в природе не в виде свободно живущих клеток, а в виде специфически организованных биопленок. Бактериальная биопленка - сообщество одного или нескольких видов бактерий, прикрепленных к поверхности или друг к другу и заключенных в матрикс из синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ [5]. В состав внеклеточного матрикса биопленки входят экзополисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества [8]. Биопленка защищает бактерии от неблагоприятных абиотических факторов внешней среды, а также от факторов специфической и неспецифической защиты иммунной системы хозяина. Исследование биопленок вызывает огромный интерес, поскольку микроорганизмы способны образовывать биопленки на любых биотических и абиотических поверхностях. Большой экономический ущерб приносят микробные обрастания разных водных объектов. В медицине проблемы связаны с образованием биопленок на протезах, катетерах, шунтах, контактных линзах [5]. Особое значение имеет изучение образования биопленки патогенными бактериями, поскольку многие хронические инфекции вызываются микроорганизмами, растущими в виде биопленок. Устойчивость бактерий в биопленке к антибиотикам в 1000 раз больше, чем у планктонных форм [5]. Возбудитель псевдотуберкулеза человека - Y. pseudotuberculosis - широко распространен в окружающей среде. Он выделяется из органов и фекалий многих видов млекопитающих, птиц, земноводных, рыб, членистоногих, а также из почвы, воды и растительных субстратов [4]. Эти бактерии способны образовывать биопленку, которая защищает их от неблагоприятных экологических условий и от поедания беспозвоночными хищниками [2]. Цель настоящего исследования - выявление условий формирования Y pseudotuberculosis биопленок для их количественного тестирования и исследование влияния различных веществ на этот процесс. В качестве основных параметров, влияющих на образование биопленки, определяли начальную (исходную) концентрацию бактерий, температуру и время инкубации В работе использованы: штаммы Y. pseudotuberculosis из коллекции НИИЭМ (Владивосток), изолированные от больного (512 рVM82МД и pYV48MД, 01 серовар), из внешней среды (696 pVM82МД, pYV48МД, 0I серовар) и 2517 pYV-, 03 серовар (Институт Пастера, Франция); питательные среды для культивирования бактерий - питательный агар и бульон рН 7,2 [3]. Количественное определение способности Y pseudotuberculosis образовывать биопленки проводили в стандартных 96-луночных полистероловых планшетах. Бактерии выращивали в бульоне в течение 18 - 24 ч при температуре 22°С. Затем микроорганизмы в дозе 107 мк/мл (стандарт мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича) разносили по 200 мкл в лунки планшета. Для каждого опыта обычно использовали 4 - 8 дублирующих лунок. Инкубировали планшет в течение 18 - 24 ч при 37°С или нескольких суток при температуре 20 - 22°С. В соответствующие сроки удаляли среду из лунок, промывали их 2 - 4 раза стерильным 0,85% раствором NaCl для удаления неприкрепившихся клеток и компонентов среды. В каждую лунку вносили по 200 мкл 0,5% водного раствора кристаллического фиолетового (CV) и инкубировали планшет при комнатной температуре 15 мин. После удаления несвязанного красителя лунки промывали водой 3 - 4 раза до исчезновения окраски и подсушивали на воздухе в течение нескольких часов или оставляли на ночь. Для количественного определения биопленки в каждую лунку планшета добавляли 200 мкл 96% этанола, содержащего 2% уксусной кислоты (объем/ объем), инкубировали планшет при комнатной температуре в течение 15 мин для растворения красителя. Количество биопленки оценивали в планшет-ридере по оптической плотности при 600 нм. Ингибирование образования биопленки тестировали по методу [15]. Различные соединения, воздействующие на биопленку, вносили в лунки одновременно с Y. pseudotuberculosis. Инкубировали планшет при 20 - 22°С в течение времени, необходимого для развития биопленки. Для выявления разрушения биопленки различные концентрации исследуемых соединений добавляли в лунки после формирования биопленки при 20 - 22°С. Затем систему инкубировали дополнительно в течение 1 ч при 37°С. Дальнейшую обработку лунок планшета и окраску биопленки проводили, как описано выше. Определение внеклеточной ДНК в матриксе Y. pseudotuberculosis проводили по методу [13]. Бактерии выращивали в течение 4 суток при температуре 20 - 22°С в чашках Петри в 2 мл питательного бульона, среду с бактериями осторожно удаляли, добавляли 1 мл ТЕ-буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Затем бактерии снимали со стенок и дна чашек Петри, переносили их в прoбирки и центрифугировали 25 сек при 13 000 об/мин. Супернатант удаляли, осадки ресуспендировали в 200 мкл ТЕ-буфера и рецентрифугировали. Проводили электрофорез супернатанта в 1% агарозном геле, ДНК визуализировали путем окрашивания бромистым этидием. Для определения КОЕ/мл в исходной культуре Y. pseudotuberculosis (10 ед по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича) готовили серию разведений, высевали бактерии в объеме 0,1 мл на дифференциально-диагностическую среду-67 [3]. Инкубировали посевы в течение 18 - 24 ч при 37°С, затем 18 - 24 ч при 20 - 22°С и подсчитывали число выросших колоний. Для определения числа КОЕ Y. pseudotuberculosis в составе биопленки из лунок планшета удаляли среду с неприкрепленными клетками и трижды промывали их стерильным 0,85% раствором NaCl. В каждую лунку вносили по 200 мкл раствора и тщательно ресуспендировали клетки бактерий, прикрепленные ко дну и стенкам лунки. Из полученной взвеси готовили серию разведений и высевали материал по 0,1мл на среду-67. После инкубирования посевов подсчитывали число КОЕ/ мл. Все определения проводили в четырехкратной повторности, результаты статистически обрабатывали. Исследования повторяли от 2 до 4 раз, и во всех случаях были выявлены наблюдаемые закономерности формирования и ингибирования биопленки. При определении условий образования биопленки Y pseudotuberculosis прежде всего было выявлено время, необходимое для ее формирования, температура инкубации и начальная концентрация бактерий. Результаты спектрофотометрии образцов показали стабильное образование биопленки Y pseudotuberculosis при температуре 20 - 22°С. Выращивание бактерий при 37°С в течение 24 ч приводило к неустойчивому прикреплению биопленки и нестабильному окрашиванию CV, поэтому дальнейшие исследования проведены при температуре 20 - 22°С. Определяли количество биопленки у Y pseudotuberculosis при разных условиях выращивания. Все три исследованных штамма бактерий формировали хорошо выраженную биопленку на абиотической поверхности плашек. Обнаружено, что количество образовавшейся биопленки различается в зависимости от штамма Y. pseudotuberculosis, концентрации микроорганизмов и времени культивирования в плашках. Меньше всего биопленки формировали бактерии штамма 512 pYV+, выделенного от больного псевдотуберкулезом. Максимальное количество биопленки у каждого из штаммов отмечено при выращивании бактерий в объеме 200 мкл на лунку планшета при исходной концентрации бактерий ~107 КОЕ/мл и времени культивирования в пределах 4 - 6 суток при температуре 22°С. Таким образом, нами были подобраны условия роста Y. pseudotuberculosis, позволяющие количественно тестировать формируемые ими биопленки. Бактерии в составе биопленки могут представлять собой как активно функционирующие клетки, так и находящиеся в состоянии покоя или некультивируемые формы. Нами было проведено определение числа КОЕ/мл в составе биопленки у исследуемых штаммов Y. pseudotuberculosis. Установлено, что количество биопленки, образуемой бактериями штамма 2517, утратившего плазмиду вирулентности, возрастало при культивировании их в течение 10 суток. В случае штамма 512, несущего плазмиду вирулентности, после 4 суток количество биопленки оставалось на одном уровне. Максимальный рост количества образующейся биопленки (до 7 сут) отмечен у штамма 696pYV, несущего плазмиду вирулентности, изолированного из внешней среды, дальнейшая инкубация приводила к уменьшению биопленки. Такая же зависимость от времени инкубации выявлена при определении числа колониеобразующих единиц Y. pseudotuberculosis (штамм 696pYV+). У других штаммов этот показатель снижался к 10 суткам, однако у них не отмечено резкого увеличения КОЕ через 7 суток инкубации. Нами установлено также, что в процессе культивирования бактерии не утрачивали плазмиду вирулентности. В литературе имеются сведения о том, что бактериальные биопленки могут разрушаться при обработке деградирующими матрикс ферментами - ДНКазами [15, 16], протеазами [9], полисахарид деградирующими ферментами [14]. При выращивании биопленки Y pseudotuberculosis 2517 pYV- в течение 4 суток в присутствии ДНКазы I (20 мкг/мл) мы наблюдали уменьшение количества образующейся биопленки примерно в два раза. Ингибирующее действие ДНКазы на формирование биопленки было проверено при концентрациях фермента от 1 до 40 мкг/мл. Показано, что с увеличением количества ДНКазы количество биопленки снижалось. При 20 мкг/мл ДНКазы ингибирование составило 50%. Уменьшение образования биопленки в присутствии ДНКазы наблюдалось и для штаммов Y. pseudotuberculosis 512pYV+ и 696pYV+. Исследование действия ДНКазы на зрелую биопленку показало, что этот фермент в концентрации 20 мкг/мл разрушал около 30% биопленки, образованной Y. pseudotuberculosis (Штамм 2517pYV-). Ингибирующее действие ДНКазы на образование биопленки может свидетельствовать о наличии ДНК во внеклеточном матриксе. Электрофорез внеклеточного матрикса Y. pseudotuberculosis позволил выявить наличие полосы ДНК размером более 10 кб. Интенсивность полос ДНК в образцах, выращиваемых в присутствии ДНКазы I, была значительно меньше. Таким образом, во внеклеточном матриксе биопленки Y. pseudotuberculosis присутствует ДНК, и разрушение ее ДНКазой приводит к уменьшению количества образующейся биопленки. О том же свидетельствуют и результаты экспериментов по разрушению уже образовавшейся биопленки Y. pseudotuberculosis этим ферментом. В литературе есть сведения об образовании биопленок патогенными бактериями рода Yersinia: Y. enterocolitica [12], Y. pseudotuberculosis и Y. pestis [1, 2, 7]. Выявлено, что образование биопленки зависит от штамма иерсиний. Некоторые из них образуют биопленки только на нематоде, но не на абиотических полистерольных покрытиях, а другие - наоборот [6]. Два патогенных вида Y. pseudotuberculosis и Y. pestis формируют сложные по строению биопленки, которые защищают их от неблагоприятных экологических условий и факторов иммунной защиты хозяина [11]. Однако роль биопленки в жизнедеятельности этих двух видов близкородственных бактерий имеет существенные различия. Для Y. pseudotuberculosis образование биопленки необходимо для защиты от различных факторов окружающей среды и от поедания мелкими беспозвоночными хищниками, а Y. pestis использует это свойство для размножения в желудочно-кишечном тракте насекомого-переносчика [1]. Нами была показана способность Y. pseudotuberculosis образовывать биопленку на абиотической поверхности, и подобраны условия роста бактерий в лунках полистирольных планшетов, дающие возможность количественного тестирования формируемых биопленок. Инкубацию бактерий проводили при температуре 20 - 22°С в течение 4 - 7 суток. При температуре 37°С наблюдали образование биопленки не только на стенках и дне лунок, но и в среде культивирования, что приводило к нестабильной окраске кристалл-виолетом. Есть данные об образовании хорошо видимой биопленки Y. pestis и Y. pseudotuberculosis при выращивание бактерий в течение 48 ч при 28°С на абиотической поверхности [2]. Авторы сообщили, что в этих условиях большинство штаммов Y. pestis и все пять исследованных штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения формировали биопленку. В отличие от Y pestis штаммы Y. pseudotuberculosis не образовывали пигментированных колоний на среде с красителем [2]. В настоящее время установлено, что биопленки являются одним из патогенетических факторов формирования хронических инфекционных процессов, поэтому ингибирование образования биопленок либо их разрушение является главной задачей клиницистов [5]. Микрофлора биопленки более устойчива к воздействию неблагоприятных факторов физической, химической и биологической природы по сравнению со свободно плавающими бактериями. Биопленки резистентны к воздействию ультрафиолетового излучения, дегидратации, антибиотикам и факторам иммунной защиты. Они оказались способными выдерживать концентрации антибиотиков в 100 - 1000 раз больше терапевтических доз, подавляющих одиночные бактериальные клетки. Установлено, что в основе повышенной выживаемости лежат свойства бактериальных клеток и внеклеточного матрикса. Матрикс биопленки может связывать или не пропускать, и/или инактивировать антибиотики. Резистентность биопленочных микроорганизмов к антибиотикам может быть связана и с тем, что в биопленке бактерии трансформируются в метаболически инертные формы, на которые плохо действуют антибиотики [5]. Внеклеточный матрикс состоит из белков, полисахаридов, липидов и нуклеиновых кислот [8]. Исследования показали, что деградация внеклеточной ДНК ДНКазой уменьшала формирование и рост биопленок [10, 15]. Действительно, внеклеточная ДНК играет важную роль в развитии биопленки, обеспечивая структурную стабильность [11] и защиту от антимикробных агентов. Мы показали наличие ДНК во внеклеточном матриксе биопленки, образованной Y. pseudotuberculosis. Есть данные об изучении роли внеклеточной ДНК в формировании биопленок грамположительных и грамотрицательных бактерий [16]. Результаты свидетельствуют о наличии в матриксе биопленок внеклеточной ДНК со средним размером 30 кб. Результаты исследования внеклеточной ДНК биопленок Staphylococcus aureus показали, что она играет важную роль в структуре матрикса. Использование ферментов рестрикции продемонстрировало, что размер фрагментов внеклеточной ДНК должен составлять не менее 11 кб для поддержания целостности биопленки. В присутствии ДНКазы происходит ряд изменений в количестве, архитектуре, морфологии биопленок, а также в количестве КОЕ различных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Расщепление внеклеточной ДНК приводит к изменению биопленки, что дает возможность для проникновения антибиотиков. Таким образом, добавление ДНКазы усиливает действие антибиотиков, что приводит к снижению биомассы биопленки и числу КОЕ [16]. Количество биопленки, образованной Y. pseudotuberculosis в присутствии ДНКазы I, снижалось вдвое при концентрации фермента 20 мкг/мл. Внеклеточная ДНКаза (NucB) Bacillus licheniformis ингибировала формирование и разрушала биопленки как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, включая B. licheniformis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Pseudomonas [15]. ДНКаза I уменьшала образование биопленки Rhodococcus ruber (C208) на ранней стадии формирования на 20 - 25%, но не оказывала существенного влияния на зрелые биопленки. В то же время, добавление ДНК значительно увеличивало образование биопленки ранней стадии (на 50 - 100%) [10]. В наших исследованиях ДНКаза I в концентрации 20 мкг/мл разрушала около 30% образовавшейся биопленки Y. pseudotuberculosis. Уменьшение биомассы биопленки в присутствии ДНКазы I наблюдалось у различных грамположительных и грамотрицательных бактерий [16]. Этот эффект зависел от концентрации фермента и приводил к сокращению биомассы от 28% до 70% при изменении концентрации ДНКазы I от 0. 5.до 1000 мкг/мл. Уменьшение биомассы биопленки может быть обусловлено уменьшением количества внеклеточного матрикса или образованием более слабо связанной биопленки. Разрушение внеклеточной ДНК ДНКазой I приводило к уменьшению внеклеточного матрикса, и в результате антибактериальные агенты действовали более эффективно, уменьшая биомассу биопленки и количество КОЕ. Таким образом, новые представления о биопленках требуют изменения подходов к диагностике и лечению инфекций в самых различных областях медицины. Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы первоначальной адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно может сочетаться с собственно бактерицидными агентами. Подобное лечение, действующее на структуру или функции биопленок, может оказаться более эффективным, чем стандартная антибактериальная терапия.

About the authors

N. A Terentieva

Pacific Ocean Institute of Bioorganic Chemistry

Vladivostok, Russia

N. F Timchenko

Research Institute of Epidemiology and Microbiology

Vladivostok, Russia

L. A Balabanova

Pacific Ocean Institute of Bioorganic Chemistry,Far Eastern Federal University

Vladivostok, Russia

V. A Rasskazov

Pacific Ocean Institute of Bioorganic Chemistry

Vladivostok, Russia

References

Supplementary files