EFFECT OF FLUCONAZOLE ON TEMPORAL ORGANIZATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF CANDIDA ALBICANS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В связи с выраженной тенденцией к распространению кандидоза особую важность приобретает проблема его лечения. Сейчас традиционная медицина на своем вооружении имеет широкий спектр различных антимикотических препаратов. Механизм их фунгицидного и фунгистатического действия заключен в нарушении синтеза эргостерола, в результате чего повышается проницаемость мембран клеток грибов и ингибируется их рост. С 1991 года в России широко используется флуконазол [10], который обладает высокой специфичностью и низкой частотой нежелательных эффектов [6]. По мнению клиницистов [15, 16] предупредить развитие антибиотикорезистентности у микромицетов практически невозможно. Поэтому изучение активности антимикотиков в течение суток открывает новые возможности для дальнейших исследований в направлении рациональной антибиотикотерапии. Цель исследования - изучить влияние флуконазола на временную организацию биологических свойств C. albicans. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Для изучения активности грибов в течение суток использовали клинические изоляты С. albicans, выделенные из кишечника при кандидозе. Контролем служил депонированный эталонный штамм того же вида, полученный из американской коллекции типовых культур (АТСС) № 24433. Видовую идентификацию грибов проводили по комплексу признаков: изучению внешнего вида колоний, хламидоспорообразованию, тесту на образование ростовых трубок, определению чувствительности дрожжевых организмов к антифунгальным препаратам методом дисков, ассимиляционной способности штамма [4]. Все изоляты выращивали на бульоне Сабуро. Для работы использовали 24-часовую культуру. Исследования проводились в течение суток с 4-часовым интервалом. Каждая временная точка включала 3 пробы. Экспериментально определяли пролиферативную [9], адгезивную [1], протеазную [11], каталазную [2], фосфолипазную активность [13] и морфологическую трансформацию из дрожжевой формы в мицелярную [4]. Музейный штамм перед исследованием инкубировали на кровяном агаре в течение суток в термостате при 37°C. Регулирующее действие флуконазола на биоритмы грибов исследовали диско-диффузионным методом и методом серийных разведений [5]. Выбор препарата обусловлен терапевтическим интересом к нему в медицинской практике. Максимальное разведение препарата, при котором наблюдалось отсутствие роста культуры, принималось как минимальная подавляющая концентрация (МПК). Субфунгиостатическая концентрация препарата равнялась 1/2 МПК. Экспериментально готовили 3 пробы: 1) опытная - в бульон Сабуро вносили рабочую концентрацию грибов (106 КОЕ/мл), добавляли водный раствор антимикотика в концентрации 0,25 мкг/мл для музейного штамма и 0,5 мкг/мл для культур, выделенных от больных людей, инкубировали в термостате при температуре 37°C в течение 18-20 часов; 2) контроль № 1 - бульон Сабуро и рабочая концентрация грибов (106 КОЕ/мл). Пробу использовали для определения исходного уровня биологических свойств исследуемых штаммов, в отношении которых изучали динамику свойств; 3) контроль № 2 - проверка стерильности питательного бульона. Все результаты исследований обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента [3] и метода наименьших квадратов с целью поиска ритмов, оценивающих такие параметры как мезор - уровень среднего значения показателей изучаемого процесса; амплитуда - наибольшее отклонение показателя от мезора; акрофаза - точка времени в периоде, когда отмечалось максимальное значение исследуемого параметра [18]. Для выявления степени межиндивидуальной синхронизации ритмов использован популяционный косинор-анализ. Статистическая обработка проведена с использованием программ «Cosinor Ellipse 2006» [7] и «Косинор-анализ», адаптированной к микробиологическим исследованиям [14]. Анализируемые данные считали достоверными при значениях 95%. РЕЗУЛ ЬТАТЫ На первом этапе исследований выявлена чувствительность изучаемых культур к препарату. Диско-диффузионный метод позволил лишь косвенно судить о величине минимальной подавляющей концентрации, по которой можно отнести микроорганизм к одной из категорий чувствительности [5]. Методом серийных разведений как более чувствительным выявили различные периоды резистентности C. albicans к флуконазолу в течение суток. В ходе проведенного исследования установили, что максимальная чувствительность музейного штамма (минимальные значения подавляющей концентрации) зарегистрирована в дневное время: 12.00 - 16.00 часов (МПК=0,5 мкг/мл). Умеренная чувствительность к препарату наблюдалась в 08.00 и 20.00 часов (МПК=8 мкг/мл). Для подавления жизнедеятельности клинических изолятов грибов требовалась большая концентрация анти-микотика (МПК=1,0 мкг/мл). Патогенные штаммы проявляли максимальную чувствительность к флуконазолу в вечернее и ночное время, а в дневные часы зафиксирована резистентность к препарату (МПК=32 мкг/мл). Во второй серии экспериментов флуконазол использовали в концентрации 1/2 МПК как стрессовый фактор, влияющий на биологические свойства грибов. Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств музейного штамма (вверху) и клинических изолятов C. albicans (внизу) до (слева) и после (справа) воздействия флуконазола. 1) адгезия, 2) пролиферация, 3) морфогенез, 4) фосфолипаза, 5) протеаза, 6) каталаза. По окружности - время суток, часы. Сопоставление основных ритмометрических параметров различного уровня интеграции позволило выявить амплитудно-фазовую стабильность биологических свойств микроорганизмов. Результаты для музейного варианта C. albicans представлены по времени максимальной патогенной активности с периодом равным суткам (рис. вверху). После воздействия антимикотика у данной культуры изменились вклады ритмов всех изучаемых показателей с циркадианных (околосуточные) на ультрадианные (около 12-час). Такая ритмичность характерна для клинических изолятов, выделенных из биотопов больных кандидозом пациентов. Флуконазол у C. albicans АТСС изменял ритмометрические показатели адгезии и пролиферации. В ходе исследований зарегистрирована инверсия ритма адгезии, то есть в период максимальной активности в контроле фиксировались минимальные значения в опыте. Экспериментально установлено снижение амплитуды и среднесуточных значений в 2,5 - 4 раза (р<0,05) как скорости роста и размножения, так и скорости прикрепления к поверхности. Однако препарат не влиял на хроноинфраструктуру морфогенеза и ферментов агрессии. Полученные результаты могут свидетельствовать о лабильности факторов адгезии и колонизации у музейной культуры, которые первыми реагировали на стресс, факторы инвазии были более стабильные. Временные ряды биологической активности патогенных изолятов С. albicans после инкубации с флуконазолом характеризовались синхронизацией всех свойств (рис. внизу). У грибов сохранялись ультрадианные вклады ритмов всех показателей (р<0,05). Максимальная физиологическая активность регистрировалась только в утренние часы с 07.00 до 11.00 или в вечернее время с 16.00 до 23.00. Отмечены значительные временные интервалы отсутствия проявления биологических свойств (00.00 - 07.00 и 12.00 - 18.00). У грибов отмечено нивелирование суточной динамики адгезивной, пролиферативной, морфологической, протеазной и каталазной активности. Достоверно снижался мезор и амплитуда в 5,3 - 6,6 раза (р<0,05). Примечательно, что низкие концентрации препарата стимулировали фосфолипазную активность грибов, среднесуточные значения увеличились в 1,9 раза, а амплитуда в 3,4 раза по сравнению с контрольными показателями. Полученные результаты согласуются с данными некоторых авторов, обнаруживших ростостимулирующий эффект при воздействии низких концентраций химиотерапевтических препаратов [12]. ОБСУЖДЕНИЕ Экспериментально установленные временные интервалы чувствительности и резистентности культур к антимикотикам открывают перспективы разработки рациональной антибиотикотерапии кандидозов. В ходе исследования доказано, что при воздействии флуко-назола вклад ритма и амплитудно-фазовая характеристика изучаемых свойств не являются стационарными, что свидетельствует о высокой адаптационной способности микроорганизмов. У клинических изолятов C. albicans наблюдалась четкая синхронизация во времени всех факторов патогенности, так как происходит экономия материальных и энергетических ресурсов в определенный временной период [8]. Взаимная синхронизация ритмов функциональных структур на фоне высокой лабильности процесса является универсальным механизмом адаптационного процесса, с помощью которого организм поддерживает гомеостаз в меняющихся условиях среды [17]. Естественная вариабельность параметров ритма позволяет лучше понять, каким образом в остающейся прежней структуре возникает новое содержание. Отличие и сходство нового и старого циклов ритма делят процесс развития биологической системы на отдельные отрезки, или кванты, и тем самым делают развитие квантовым, обеспечивая в нем единство непрерывности и дискретности при однонаправленном течении времени [8].

About the authors

M. V Nikolenko

Tyumen State Medical Academy

T. Kh Timokhina

Tyumen State Medical Academy

Ya. I Paromova

Tyumen State Medical Academy

References

Supplementary files