EVALUATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS ISOLATED FROM PATIENTS WITH STERNUM AND RIB OSTEOMYELITIS

Full Text

Наиболее вероятными возбудителями остеомиелита грудины и ребер при открытых операциях на сердце являются грамположительные микроорганизмы (до 70%), главным образом, Staphylococcus aureus [1, 13]. В настоящее время, в том числе и за счет антистафилококковой профилактики, в этиологии гнойно-септических осложнений при кардиохирургических вмешательствах возрастает роль грамотрицательных бактерий, из которых наиболее значимым является P. aeruginosa [9]. При этом подобные осложнения, в частности, медиастинит, вызванный P. aeruginosa, чаще заканчивается летально, чем аналогичные заболевания, обусловленные иными микроорганизмами [10]. Прежде всего, это связано с особенностью биологических свойств данного вида бактерий, продукцией многочисленных факторов вирулентности и природной антибиотикоустойчивостью P. aeruginosa [2, 3]. Наибольшую опасность представляет инфицирование больных полирезистентными внутрибольничными штаммами P. aeruginosa, циркулирующими в отделении, когда источником является медицинский персонал, что нередко приводит к вспышкам синегнойной инфекции [8, 12]. Отличаясь политропизмом, P. aeruginosae могут колонизировать внутренние органы, кожные и слизистые покровы, индуцируя развитие гнойно-воспалительных заболеваний различной локализации [14]. В то же время, их роль в развитии гнойносептических осложнений после кардиохирургических вмешательств, в частности, остеомиелита грудины, остается недостаточно исследованной. Самостоятельный интерес представляет и изучение биологических свойств штаммов синегнойных бактерий, изолированных от таких больных, их факторов персистенции, вирулентности, а также антибиотикочувствительности. При этом анализ фенотипов изолятов позволяет, с одной стороны, использовать их в качестве маркеров для изучения эпидемиологических аспектов, с другой - оценивать степень выраженности факторов вирулентности P. aeruginosa при данной патологии. Цель работы - изучение роли P. aeruginosa в развитии остеомиелита грудины и ребер у кардиохирургических больных, анализ основных биологических свойств изолированных штаммов бактерий. В течение 2007 - 2013 гг. проведено бактериологическое обследование 83 больных с остеомиелитом грудины и ребер, развившимся после операционных вмешательств у кардиохирургических больных. Подобные осложнения у 47 (56,6%) пациентов возникли спустя 2 - 4 месяца после оперативного вмешательства. Материалом для исследования служило отделяемое ран. Забор, посев и идентификацию выделенных культур проводили в соответствии с положениями, регламентированными приказом № 535 МЗ СССР от 22.04.1985 г. Использовали соответствующие тест-системы: Энтеро-, Стафило-, Стрепто- и Неферм-тест 24 («Эрба Лахема», Чехия). Результаты учитывали с помощью бактериологического анализатора Multiscan-Ascent фирмы «TERMO-Labsystems» (Финляндия) и компьютерной программы «Микроб-автомат», осуществляющей автоматическое считывание коммерческих идентификационных тест-систем. Антибиотикочувствительность изучали диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Определение металло-беталактамаз у штаммов P. aeruginosa, резистентных к карбапенемам, осуществляли в соответствии с [6] методом радиальной диффузии, нагружая один из дисков с антибиотиком 0,5 М ЭДТА. У положительных в тесте штаммов проводили детекцию генов металло-беталактамаз (blaVIM-2) с использованием праймеров YIM2f/VIM2r (фрагмент 801 п.н.), предложенных в [11]. Способность к пленкообразованию изолированных культур P. aeruginosa изучали в соответствии с [5]. В качестве факторов вирулентности определяли наличие гемолитической (ГА) и фосфолипазной активности (ФЛА). ГА определяли на 5% кровяном агаре, ФЛА - на 10% желточном агаре. Степень выраженности признаков оценивали по коэффициентам, которые определяли на основании расчета отношения диаметра зоны гемолиза к диаметру колоний и соответственно отношения диаметра зоны «опалесцирующего венчика» к диаметру колоний. Способность к слизеобразованию оценивали при посеве на плотные питательные среды, изучая макроскопически свойства колоний. Генетическое типи-рование штаммов P. aeruginosa осуществляли посредством полимеразной цепной реакции с праймером М13 (RAPD-ПЦР) [7]. ДНК получали согласно Stone G.G. et al. (1999) методом кипячения. Амплификацию проводили на термоциклере Т3 («Biometra», Германия). Олигонуклеотидные праймеры были синтезированы ООО «Синтол» (Москва). Режим для RAPD-ПЦР включал: начальный цикл денатурации - 1 мин при 94°C - 20 сек; отжиг 45°C - 20 сек; синтез 72°C - 60 сек; завершающий цикл 5 мин при 72°C. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2% агарозном геле при напряжении электрического поля 6 В/см. Визуализацию полос и документирование данных осуществляли с помощью системы гель-документации Gel-Doc XR («Bio-Rad», США). Для определения достоверности различий между изучаемыми показателями использовали t-критерий Стьюдента. Взаимосвязь признаков определяли по коэффициенту линейной корреляции (R) Спирмана. В подавляющем большинстве случаев (79,52%) из гнойного отделяемого, полученного от 83 больных, были изолированы микроорганизмы различной видовой принадлежности. Всего выделено 132 бактериальные культуры, в том числе, 41 культура (31,06%) представителей семейства Enterobacteriaceae и 67 культур грамположи-тельных кокков (50,76%). Что касается P. aeruginosa, то было изолировано 14 таких культур (10,61%), причем 9 из них в монокультуре, остальные в виде двухкомпонентных ассоциаций с Klebsiella pneumoniaе и Staphylococcus spр. Все изучаемые культуры на жидкой питательной среде образовывали характерный сине-зеленый пигмент, что является видовым признаком P. aeruginosa. Тринадцать из них лизировали бараньи эритроциты. Степень выраженности гемолитической активности колебалась в широких пределах от 0,5 до 4,5 усл. ед. и в среднем составила 1,99±0,53. В десяти случаях зафиксирована фосфолипазная активность, ее интенсивность также значительно варьировала - от 0,3 до 4,0 усл. ед. Средние значения этого показателя были равны 2,04±0,55. Следует отметить, что в большинстве случаев эти факторы вирулентности были сопряжены и присущи одним и тем же штаммам P. aeruginosa. Так, между ФЛА и ГА установлена прямая сильная коррелятивная связь (R=0 ,846, p=0,000132). В то же время, степень выраженности этих признаков у изученных культур была сравнительно невысокой. Еще одним фактором вирулентности этих микроорганизмов является способность продуцировать мукоид (альгинат), который входит в состав экзополисахаридов [4]. Такие микроорганизмы за счет выделения слизи на твердых питательных средах образуют вязкие блестящие незначительно выступающие над поверхностью агара колонии. Способность к слизеобразованию регистрировали у 57,14% изучаемых культур. Что касается пленкообразующей активности, то как и в предыдущих наблюдениях (при изучении ФЛА и ГА), степень ее выраженности в значительной мере варьировала от 0,122 до 1,412 ед. ОП, средние значения составили 0,903±0,535. Высоко пленкообразующими вариантами были 64,28% изученных штаммов. Статистически значимой связи между ФЛА или ГА и пленкообразованием не выявлено. Высоко пленкообразующими были культуры как с выраженным слизеобразованием, так и без него. Далее была изучена антибиотикочувствительность выделенных штаммов P. aeruginosa. Протестированы препараты, обычно рекомендуемые для лечения таких больных, в их числе цефалоспорины III поколения (цефтазидим), карбапенемы (меропенем, имипенем), фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин), амино-гликозиды (амикацин), а также полимиксины (полимиксин В). Все изученные штаммы P. aeruginosa были чувствительны к полимиксину В. Эффективными были цефтазидим и карбапенемы, но при этом четыре культуры, устойчивые и к имипе-нему, и к меропенему, характеризовались наличием металло-беталактамаз (наблюдалось увеличение диаметра зоны подавления роста вокруг диска, пропитанного антибиотиком и ЭДТА). Молекулярно-генетический анализ подтвердил присутствие в этих штаммах металло-беталактамаз VIM2 типа. Следует подчеркнуть, что эти культуры отличались полирезистентностью, они были устойчивы к антибиотическим препаратам трех классов. При сопоставлении и анализе всех исследованных фенотипических характеристик изолированных штаммов P. aeruginosa установлено, что четыре из них имели сходные биологические свойства, остальные десять отличались друг от друга по каким-либо признакам, чаще всего по антибиотикограммам. Учитывая эти обстоятельства для определения эпидемиологических параллелей мы ретроспективно проанализировали истории развития заболевания у этих 14 больных. Оказалось, что 9 пациентов после оперативного кардиохирургического вмешательства были выписаны в удовлетворительном состоянии. Однако спустя 4 - 8 недель они были вновь госпитализированы в кардиохирургический стационар для прохождения специализированного лечения по поводу возникших различных осложнений. До этого времени эти пациенты находились на стационарном лечении в других лечебных учреждениях города. Возможно, что во время пребывания именно в этих стационарах они инфицировались P. aeruginosa. В пользу этого положения свидетельствует и разнообразие изученных фенотипических свойств у данных изолятов. Что касается других 4 штаммов P. aeruginosa, близких друг к другу по биологическим характеристикам, то, скорее всего, это были госпитальные штаммы кардиохирургического стационара. Они отличались полиантибиотикорезистентностью (и продуцировали металло-беталактамазы VIM2 типа), высоким уровнем биопленкообразования, наличием ряда изученных факторов вирулентности. Следует подчеркнуть, что эти штаммы P. aeruginosa были изолированы в течение короткого периода времени. Следовательно, развитие гнойно-септических осложнений, обусловленных P. aeruginosa у послеоперационных больных кардиохирургического профиля, может быть связано как с госпитальным штаммом кардиохирургического стационара, так и с инфицированием пациентов, находившихся на предшествующем стационарном лечении в других медицинских учреждениях. Высказанное предположение о возможных источниках заражения таких больных нашло подтверждение в результатах проведенных молекулярно-генетических исследований. Из 14 протестированных культур P. aeruginosa у 4 были выявлены идентичные RAPD-профили, что позволило оценить их как близкородственные. Остальные штаммы отнесены к индивидуальным геномовариантам. Следует подчеркнуть, что культуры, принадлежащие к одной геномогруппе, были изолированы в короткий промежуток времени, что подтверждает высказанную гипотезу о циркуляции госпитального штамма с формированием короткой эпидемической цепочки в стационаре. Выявленные остальные случаи инфицирования P. aeruginosa, очевидно, между собой не связаны. Известно, что вероятность инфекции, обусловленной P. aeruginosa, значительно повышается у ослабленных лиц, на фоне влияния стрессовых факторов, сопровождающих различные хирургические вмешательства. Послеоперационный период кардиохирургических больных, перенесших продолжительную операцию с обширной травматизацией тканей, обычно сопровождается иммунодепрессией или иммунодефицитом, что создает благоприятные условия для инфицирования.

About the authors

A. V Kasatov

Perm State Medical Academy, Perm Regional Clinical Hospital

E. S Gorovits

Perm State Medical Academy

M. V Kuznetsova

Perm State Medical Academy, Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms

O. A Timasheva

Research Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms

S. G Sukhanov

Perm State Medical Academy, Federal Centre of Cardiovascular Surgery

References

Supplementary files