IMMUNOGENIC PROPERTIES OF EXPERIMENTAL PRODUCTION SERIES OF STAPHYLOVAC-2 VACCINE

Full Text

В настоящее время в практике здравоохранения для профилактики и лечения стафилококковой инфекции отсутствуют эффективные коммерческие иммунопрепараты [3]. Еще в 90-е годы прошлого столетия была разработана сухая бесклеточная стафилококковая вакцина «Стафиловак-1», представляющая собой протективный комплекс антигенов клеточной стенки стафилококков, которая была разрешена к применению в 1996 г. при комплексной терапии хронических стафилококковых инфекций [2]. В последующем был расширен штаммовый состав продуцентов антигенного комплекса и разработан современный способ получения препарата, включающий реакторное культивирование вакцинных штаммов Staphylococcus aureus и мембранные методы выделения и очистки. В рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 г. и дальнейшую перспективу» был выполнен комплекс доклинических исследований модифицированной вакцины «Стафиловак-2», включающий приготовление экспериментально производственных серий стафилококковой вакцины. Цель работы - изучение безопасности и иммуно-генных свойств новых экспериментально производственных серий вакцины «Стафиловак-2». Проведено исследование опытно производственных образцов «Стафиловак-2» серий У1, У2 и У3, изготовленных в Уфимском филиале НПО «Микроген» Минздрава России, предназначенных для проведения доклинических исследований. Серии были отконтролированы после получения и установлено их соответствие нормативным требованиям качества. В качестве препарата сравнения использованы экспериментальные серии №№ 49 и 51, соответствующие нормативным требованиям. В работе использованы мыши линии BALB/с массой 12 - 14 г (самцы) и 18 - 20 г, морские свинки (самки и самцы) массой 240 - 260 г. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили по разработанным схемам иммунизаций - трехкратной (1 подкожная + 2 внутрибрюшинных) и шестикратной (3 подкожных +3 внутрибрюшинных) с интервалом 7 дней по 0,5 мг препарата [2]. В качестве иммунизирующих препаратов использовали вакцины серий У2 и 51 (препарат сравнения). Сыворотки изучали с помощью непрямого твердофазного метода ИФА на плоскодонных планшетах с сорбцией антигена 0,1 мкг/лунка [1]. Процесс сорбции проводили последовательно в двух температурных режимах: 2 часа при температуре 37°С, а далее 12 часов - при 8°C. Перед внесением сывороток ячейки планшетов трехкратно промывали 0,02М фосфатно-солевым буфером (рН 7,4), содержащим Твин-20. Объем вносимой сыворотки в рабочем разведении - 100 мкл в лунку, время инкубации при 20 - 22°С - 1 час. После инкубации содержимое лунок вытряхивали, а несвязавшиеся антитела удаляли отмывочным буферным расвором трехкратно, затем ячейки заполняли раствором конъюгата (100 мкл/лунка) - антитела диагностические против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена (Медгамал, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи). В предварительных экспериментах были подобраны рабочие разведения сывороток крови мышей - 1:100 и конъюгата - 1:200, позволяющие выявить наибольшие отличия от сывороток интактных животных. После удаления раствора несвязавшийся конъюгат тщательно отмывали трехкратно тем же буферным раствором. Проявление ферментативной активности пероксидазы в связавшемся конъюгате проводили с использованием субстратной смеси, содержащей тетраметилбензидин (НПО «Био Тест Системы») в объеме 100 мкл/лунка. Время инкубации при 20 - 22°С - 15 мин. Реакцию останавливали внесением в лунку планшета по 50 мкл 0,2М раствора серной кислоты. Оптическую плотность определяли на ИФА-ридере («Mark», Япония) при длине волны 450 нм. Результаты оценивали по разнице оптической плотности сывороток иммунизированных животных и фона. Изучение безопасности опытно промышленной серии «Стафиловак-2» предпринято в рамках общей программы изучения безопасности препарата на стадии доклинического исследования в соответствии с требованиями Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», согласно Правилам лабораторной практики в РФ (Приказ Минздрава РФ № 708н от 23.08.2010 г.). Изучение острой токсичности проводили на двух видах животных: мыши (самки и самцы) массой 18 - 20 г линии BALB/с и морских свинках (самки и самцы) массой от 250 до 350 г. Серии вакцины мышам вводили двумя методами - внутрибрюшинно и подкожно (метод, рекомендуемый для человека) в дозах (40, 200, 1000, 5000 мкг) в объеме 0,5 мл. Контрольным животным вводили 0,9% раствор натрия хлорида. Морским свинкам опытный образец стафилококковой вакцины вводили только подкожно в дозе 200 мкг (доза, рекомендуемая для человека) в объеме 0,5 мл. Наблюдение за животными (регистрация возможной гибели, масса животных, наличие возможных клинических симптомов интоксикации) проводили в течение 14 суток после введения препарата. Для патоморфологического и гистологического исследования использованы мыши через 24 ч, 4 - 7 - 14 суток после подкожного введения 200 мкг препарата. Изучение хронической токсичности проводили на мышах (самки и самцы) массой 18 - 20 г. Вакцины вводили подкожно ежедневно в течение 20 дней в эквивалентной дозе (ЭД), предлагаемой для человека при пересчете на 1 кг массы тела: 0,5 мкг (10 ЭД) и 5 мкг (100 ЭД). Наблюдение за животными проводили в течение периода введения препарата и последующих 14 суток. Гематологические (определение уровня гемоглобина, количества эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов со счетом лейкоцитарной формулы) и биохимические исследования (определение общего белка, глюкозы, мочевины, холестерина, билирубина, креатинина) проводили на 21 и 35 дни наблюдения. Для патоморфологического исследования животных подвергали эвтаназии на следующие сутки после последнего введения препарата и в день окончания наблюдения. Изучение влияния «Стафиловак-2» на центральную нервную систему проводили на мышах в тесте ориентировочной реакции и в судорожной пробе с тиосемикарбозидом за 1 сутки до введения препарата и на следующий день после ежедневного 20-дневного введения препарата в дозах 10 и 100 ЭД. Реакцию мышей в «норковом рефлексе» оценивали по числу совершаемых заглядываний в отверстия площадки в течение 2 мин, «стойки» ориентировочного рефлекса подсчитывали в течение 2 мин наблюдения. При постановке судорожной пробы с тиосемикарбозидом его вводили в объеме 0,2 мл (35 мг/кг) через 24 ч после введения препаратов. Результат оценивали по времени гибели каждого животного. Патоморфологические исследования осуществляли с использованием стандартных методов, в том числе с приготовлением гистологических препаратов. Статистическую обработку данных проводили с использованием программ Biostat D, Statistica ver. 7.0. Одним из показателей, свидетельствующих о влиянии «Стафиловак-2» на систему адаптивного иммунитета, является уровень специфических IgG в сыворотках иммунизированных мышей, который определяли в ИФА. При определении в ИФА выявлено статистически значимое (в 2,6 - 3,0 раза) увеличение уровня IgG в сыворотках иммунизированных животных по сравнению с контролем. При этом различий, связанных со схемой иммунизации, не отмечено (при 6-кратной серией 51 по сравнению с 3-кратной наблюдается незначимое увеличение оптической плотности - р=0,414). При трехкратной и шестикратной иммунизации вакциной У2-ДОП, соответственно, 0,580+0,03 и 0,568+0,03. Для определения в ИФА титра специфических IgG в сыворотках иммунизированных мышей сыворотки разводили двукратно от разведения 1:50 до 1:6400. Полученные результаты подтвердили однотипность иммунного ответа, полученного при 3- и 6-кратных иммунизациях образцом вакцины (серия У2) и экспериментальной серией вакцины (серия 51). Титр сывороток, определяемый как ДОП <0,2 >0,1, составлял для иммунных сывороток 1:400 - 1:800 при 1:100 - 1:200 для сывороток интактных мышей. Результаты изучения острой токсичности, полученные при определении средней массы тела и прироста массы тела мышей после внутрибрюшинного введения вакцины серии У2, показали отсутствие статистически значимых различий между животными, получавшими тестируемый препарат, и контрольными животными вне зависимости от исследуемых доз и пола животных. Такие же исследования проведены с использованием серии № 49, и получены аналогичные результаты. При подкожном введении опытного образца вакцины также не было выявлено различий между вакцинированными и интактными животными. Проведенное исследование показало отсутствие макро- и микроскопических патоморфологических изменений в органах (печень, почки, надпочечники, сердце, легкое, тимус, селезенка) как у мышей, так и у морских свинок. При оценке местного действия определено, что изучаемая вакцина серии У2 не обладала выраженным воспалительным эффектом: при подкожном введении морским свинкам ее действие не отличалось от уровня воспалительной реакции у животных контрольной группы. При изучении хронической токсичности во всех группах наблюдали увеличение массы тела животных. Прирост массы животных, которым вводили препараты «Стафиловак-2», ни в одном сроке наблюдения достоверно не отличался от прироста массы контрольных животных. В результате патоморфологического исследования не отмечено снижения массы внутренних органов, образования воспалительных изменений в месте введения, гибели животных, что свидетельствует об отсутствии токсического действия препарата на системы и органы лабораторных животных или снижения их активности и физиологических функций. Проведение гематологических (определение уровня гемоглобина, количества эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов со счетом лейкоцитарной формулы) и биохимических исследований (определение общего белка, глюкозы, мочевины, холестерина, билирубина, креатинина) при многократном введении двух серий вакцины мышам в дозах 10 ЭД и 100 ЭД не выявило различий с контрольными животными. Достоверных различий в ориентировочных реакциях между дозами «Стафиловак-2» (10 и 100 ЭД) и контролем не выявлено. «Норковый рефлекс»: до введения вакцины 11,3 - 10,7 - 10,7; на 21 сутки - 9,4 -9,8 - 9,9 соответственно. «Стойка»: до введения вакцины 12,9 - 12,5 - 12,6, на 21 сутки - 12,8 -11,8 - 11,9 соответственно. При постановке судорожной пробы с тиосемикарбозидом полученные результаты свидетельствовали о том, что введение «Стафиловак-2» не оказывает влияния на продолжительность жизни мышей. Таким образом, при исследовании влияния «Стафиловак-2» на активацию адаптивного иммунитета было показано увеличение (в 2,6 - 3,0 раза) специфических IgG в сыворотках крови мышей в ИФА при иммунизации опытно производственной и экспериментальной сериями вакцин. При изучении токсичности «Стафиловак-2» выявлено отсутствие таковой: максимальная из испытанных доз для мышей (5 000 мкг) превышала дозу, рекомендуемую для человека (200 мкг) в 25 раз, не вызывая гибели животных, снижения массы их тела и симптомов интоксикации. Для морских свинок при подкожном введении хорошо переносится доза 200 мкг. При исследовании хронической токсичности с использованием 100 эквивалентных доз для человека не обнаружено патоморфологических изменений во внутренних органах мышей, гематологических показателях, влияния на процессы торможения и возбуждения центральной нервной системы. Следовательно, рекомендуемая для подкожного введения человеку доза 200 мкг является экспериментально обоснованной. Полученные результаты показали, что экспериментально производственные серии вакцины «Стафиловак-2» иммуногенны и безопасны и могут быть рекомендованы для проведения клинического исследования вакцины на людях.

About the authors

L. S Cherkasova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

N. G Plekhanova

Volgograd Institute of Plague Control, Russia

O. E Tarasova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

E. A Astashkina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

N. V Melnikov

Ufa Branch of Scientific Production Association «Microgen», Russia

I. M Gruber

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

N. B Egorova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

N. A Mikhailova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Moscow, Russia

References

Supplementary files