DETERMINATION OF CRITICAL CONCENTRATION OF CHEMOTHERAPY DRUGS FOR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS SENSITIVITY EVALUATION USING Sensititre MycoTB TEST SYSTEM


Cite item

Full Text

Abstract

Aim. Determination of critical concentration for chemotherapy drugs, widely used for tuberculosis treatment, for use in Mycobacterium tuberculosis drug sensitivity results evaluation by Sensititre MycoTB test-system. Materials and methods. Minimal inhibiting concentration (MIC) of isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol, amikacin, kanamycin, ofloxacin and moxi-floxacin against conditionally sensitive and conditionally resistant strains of tuberculosis mycobacteria (TBM), isolated from various diagnostic material, obtained from patients with various forms of lung tuberculosis being treated in MCSPCTC hospital and dispensaries for tuberculosis control of Moscow, were studied in Sensititre MycoTB test system. Results. Critical concentration of chemotherapy drugs for MycoTB test system was determined as a result of the obtained MIC values analysis as the minimal concentration that suppressed growth of 95% of sensitive strains and does not obstruct growth of 95% of resistant. The following MIC values were established: streptomycin - 1.0, isoniazid - 0.25, rifampicin - 1.0, ethambutol - 4.0, ofloxacin - 2.0, moxifloxacin - 0.25, kanamycin - 2.5 and amikacin - 1.0 pg/ml. Conclusion. The developed critical concentration of the mentioned preparations is currently used for evaluation of sensitivity/ resistance of TBM clinical isolates from MCSPCTC.

Full Text

По данным мультицентровых исследований и оценкам ВОЗ, частота развития туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя (МЛУ-ТБ) к двум основным противотуберкулезным препаратам (изониазиду и рифампицину) во всем мире прогрессивно увеличивается, что создает серьезные проблемы в лечении этого заболевания. Еще более опасным является увеличение частоты развития широкой лекарственной устойчивости (МЛУ + устойчивость к фторхинолонам и амино-гликозидам) [2, 8 - 10]. В этих ситуациях отсутствие быстрого и надежного метода определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) ограничивает возможность назначения для лечения туберкулеза эффективного сочетания препаратов. Основными применяющимися в широкой практике микробиологическими методами определения ЛЧ M. tuberculosis in vitro являются: Метод абсолютной концентрации на среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й) (используется, главным образом, в России), срок получения результата - 21 день, из-за длительной инкубации происходит частичная инактивация лекарственного препарата в среде. Метод пропорций на агаровой среде - «золотой стандарт» (широко используется в США и Европе), получение результата - 21 день, трудоемкий, та же основная проблема, что и при применении метода абсолютной концентрации. Определение ЛЧ в жидких средах в автоматизированных системах (VersaTREK, BACTEC MGIT 960), длительность получения результата - 5 - 14 дней, дорогостоящее оборудование, технически трудоемкий. Для оценки результатов культурального определения ЛЧ используют следующие интерпретационные категории: Критическая концентрация (КК) - наименьшая концентрация лекарственного препарата, которая ингибирует рост 95% «диких» штаммов МБТ, не встречавшихся с данным препаратом, и не препятствующая росту штаммов, выделенных от больных, «не отвечающих» на лечение данным препаратом. Основным параметром, необходимым для эффективного использования метода определения ЛЧ, является разработка КК каждого препарата, поскольку этот показатель позволяет разделить исследуемые штаммы на чувствительные и устойчивые. Значения КК существенно различаются при использовании разных методов определения лекарственной чувствительности (соответственно, питательных сред). Чувствительный штамм (при использовании КК) имеет уровень чувствительности, который соответствует или незначительно отличается от уровня чувствительности «диких» штаммов - КК полностью подавляет его рост. Устойчивый штамм (при использовании КК) обладает измененной (сниженной) чувствительностью, по сравнению с «дикими» штаммами - растет в присутствии КК. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) - концентрация лекарственного препарата, полностью подавляющая рост данного микроорганизма. Применяется для количественной оценки уровня чувствительности/устойчивости штамма. Чувствительный штамм (при определении МИК) - рост штамма ингибируется концентрацией антимикробного препарата, которая ниже концентрации, достигаемой в местах локализации возбудителя в организме, при приеме рекомендованных для лечения данной инфекции доз препарата. Устойчивый штамм (при определении МИК) - рост штамма ингибируется концентрацией лекарственного препарата, которая превышает обычно достигаемую в местах локализации возбудителя в организме, при приеме рекомендованных для лечения данной инфекции доз препарата. Недостатками всех широко применяющихся до настоящего времени методов определения ЛЧ является то, что они - качественные: определение производится к одной (критической), иногда к высокой концентрации препарата, что не дает в полном объеме представления о степени устойчивости/чувствительности исследуемого штамма. В настоящее время появилась тест-система Sensititre MycoTB (MycoTB), разработанная компанией TREK Diagnostic Systems и предназначенная для количественного определения ЛЧ изолятов M. tuberculosis (определение МИК) к 12 химиопрепаратам. В литературе имеется лишь небольшое число работ, в которых авторы для определения ЛЧ изолятов M. tuberculosis применяли тест-систему MycoTB. Оценку результатов проводили с использованием значений КК препаратов, разработанных для методов пропорций в агаре и в Bactec MGIT 960 [1, 3 - 7]. Целью настоящего исследования было определение КК химиопрепаратов для использования в оценке результатов ЛЧ M. tuberculosis с помощью тест-системы Sensititre MycoTB. В работе были изучены 99 штаммов МБТ, выделенных в жидкой (Bactec MGIT 960) и на плотной (Л-Й) питательных средах из различного диагностического материала (мокрота, бронхиальный смыв, БАЛ, экссудат, резекционный материал - содержимое туберкулем и каверн), полученного от 99 больных туберкулезом легких, находившихся на лечении в стационаре МНПЦБТ и противотуберкулезных диспансерах Москвы. Принадлежность выделенных культур к МБТ подтверждали микробиологическими (микроскопия мазка, окрашенного по Ziehl-Neelsen, морфология колоний, биохимические свойства, иммунохроматографический тест «BD MGIT TBc ID») и молекулярно-генетическим (ТБ-БИОЧИП, ООО «БИОЧИП-ИМБ») методами. Для определения КК изониазида, рифампицина, стрептомицина, этамбутола, офлоксацина, моксифлоксацина, канамицина, амикацина в Sensititre MycoTB были сформированы панели из чувствительных и устойчивых к каждому препарату штаммов МБТ Предварительными критериями включения штаммов в группу чувствительных (условно) являлись: выделение МБТ из диагностического материала пациентов с подозрением на наличие туберкулезной инфекции или впервые выявленных больных туберкулезом легких, ранее не получавших противотуберкулезной химиотерапии. Предварительными критериями включения штаммов в группу устойчивых (условно) являлись: выделение штаммов МБТ из диагностического материала пациентов с подозрением на рецидив или хроническим течением туберкулеза, ранее леченных, в том числе вышеуказанными препаратами. МИК препаратов для условно чувствительных и условно устойчивых штаммов МБТ в тест-системе Sensititre MycoTB определяли согласно инструкции производителя. Суспензию из исследуемой культуры МБТ, приготовленную по 0,5 стандарту мутности McFarland, в количестве 100 мкл переносили в пробирку с обогащенной жидкой питательной средой Миддлбрук 7Н9 и засевали по 100 мкл в лунки планшета, содержащие лиофилизированные химиопрепараты в двукратной концентрации. Планшеты инкубировали при 37°C. Рост МБТ оценивали визуально с помощью зеркала через 10 - 14 дней, в зависимости от скорости роста микобактерий в контрольной лунке без препарата. МИК препарата считали наименьшую его концентрацию, подавляющую видимый рост микроорганизма в лунке. Все микробиологические исследования проводили с параллельной постановкой контрольных исследований со стандартным штаммом M. tuberculosis ffi7Rv - АТСС® 25618 из музея ЦБЛ МНПЦБТ. Определяли МИК каждого препарата в отношении чувствительных и устойчивых штаммов в тест-системе Sensititre MycoTB. Критическая концентрация химиопрепаратов для тест-системы MycoTB была определена в результате математического анализа полученных значений МИК как наименьшая концентрация, подавляющая рост 95% чувствительных штаммов и не препятствующая росту 95% устойчивых. Установлено, что для условно чувствительных штаммов МИК стрептомицина составила <1,0 мкг/мл, изониазида <0,25 мкг/мл, рифампицина <0,5 мкг/мл, этамбуто-ла <4,0 мкг/мл (исключение - 1 штамм МБТ с МИК 8,0 мкг/мл); для условно устойчивых - стрептомицина >0,5 мкг/мл, изониазида >0,125 мкг/мл, рифампицина >1,0 мкг/мл, этамбутола >2,0 мкг/мл. Для всех чувствительных штаммов МБТ МИК офлоксацина составила <2,0 мкг/ мл, моксифлоксацина <0,5 мкг/мл, канамицина <5,0 мкг/мл и амикацина <1,0 мкг/ мл; для всех устойчивых - офлоксацина >2,0 мкг/мл, моксифлоксацина >0,25 мкг/ мл, канамицина >2,5 мкг/мл, амикацина >2,0 мкг/мл. Согласно данным, полученным при анализе МИК химиопрепаратов, установлена следующая их критическая концентрация для тест-системы MycoTB: стрептомицина - 1,0, изониазида - 0,25, рифампицина - 1,0, этамбутола - 4,0, офлоксацина - 2,0, моксифлоксацина - 0,25, канамицина - 2,5 и амикацина - 1,0 мкг/мл. Для контрольного чувствительного штамма M. tuberculosis H37Rv значения МИК стрептомицина (STR), изониазида (INH), рифампицина (RIF), этамбутола (EMB), офлоксацина (OFX), моксифлоксацина (MOX), канамицина (KAN) и амикацина (AM) составили 1,0; 0,06; 0,125; 2,0; 0,25; 2,5; 1,0 мкг/мл. Значения КК большинства противотуберкулезных препаратов разработаны для метода пропорций в агаре и для системы Bactec MGIT 960. Они приведены в работах ряда авторов, в том числе в материалах ВОЗ [8 - 10]. В вышеуказанных исследованиях по использованию тест-системы Sensititre MycoTB были использованы именно эти значения КК. Данные о разработке КК специально для тест-системы Sensititre MycoTB отсутствуют. Мы сравнили данные значений КК, полученных в МНПЦБТ (для тест-системы Sensititre MycoTB), и использованных в работах других исследователей (для Bactec MGIT 960 [7] и метода пропорций в агаре [5]). Результаты таковы (по [5], [7] и МНПЦБТ соответственно): INH - 0,2; 0,25; 0,25; RIF - 1,0; 1,0; 1,0; AM - 5,0; 1,0; 1,0; KAN - 5,0; 5,0; 2,5; OFX - 2,0; 2,0; 2,0; MOX - 2,0; 0,25; 0,25; STR - 2,0; 2,0; 1,0; EMB - 5,0; 4,0; 4,0. Мы видим, в ряде случаев КК препаратов для разных тест-систем совпадают, а в других нет, что зависит от физико-химических свойств среды, метода определения ЛЧ и т.д., а также от территориальных особенностей возбудителя.
×

About the authors

M. V Makarova

Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control

Moscow, Russia

S. G Safonova

Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control

Moscow, Russia

Yu. D Isaeva

Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control

Moscow, Russia

L. Yu Krylova

Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control

Moscow, Russia

E. Yu Nosova

Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control

Moscow, Russia

V. I Litvinov

Moscow City Scientific-Practical Centre of Tuberculosis Control

Moscow, Russia

References

  1. Abuali M. M., Katariwala R., LaBombardi VJ. A comparison of the Sensititre® MYCOTB panel and the agar proportion method for the susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2011, 31 (5): 835-839.
  2. Ahuja S.D., Ashkin D., Avendano M. et al. Multidrug resistant pulmonary tuberculosis treatment regimens and patient outcomes: an individual patient data meta-analysis of 9,153 patients. PLoS Med. 2012, 9 (8): e1001300. 10.1371/journal.pmed.1001300.
  3. Banu S., Rahman S.M., Khan M.S. et al. Discordance across several methods for drug susceptibility testing of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in a single laboratory. J. Clin. Microbiol. 2014, 52 (1): 156-163.
  4. Hall L., Jude K. P., Clark S.L. et al. Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex for first and second line drugs by broth dilution in a microtitre plate format. J. Vis. Exp. 2011, 24 (52). Pii: 3094. doi: 10.3791/3094.
  5. Hall L., Jude K. P., Clark S.L. et al. Evaluation of the sensititre MycoTB Plate for susceptibility testing of the Mycobacterium tuberculosis ramplex against first- and second-line agents. J.Clin.Microbiol. 2012, 50 (11): 3732-3734.
  6. Lee J., Armstrong D., Ssengooba W. et al. Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second - line drugs. Antimicrob. Agents Chemother. 2014, 58 (1): 11-18.
  7. Mpagama S., Houpt E., Stroup S. et al. Application of quantitative second-line drug susceptibility at a multidrug-resistant tuberculosis hospital in Tanzania. BMC Infect. Dis. 2013, 13: 432.
  8. WHO 2007. Use of liquid TB culture and drug susceptibility testing (DST) in low and medium income settings. Summary report of the expert group meeting on the use of liquid culture media. WHO, Geneva, Switzerland.
  9. WHO 2011. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis: 2011 update. WHO, Geneva, Switzerland.
  10. WHO 2013. Global tuberculosis report. WHO, Geneva, Switzerland.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2015 Makarova M.V., Safonova S.G., Isaeva Y.D., Krylova L.Y., Nosova E.Y., Litvinov V.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-75442 от 01.04.2019 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies