DETECTION OF WEST NILE VIRUS RNA AND SPECIFIC ANTIBODIES IN BLOOD DONORS OF VOLGOGRAD REGION

Full Text

В природных очагах циркуляция вируса Западного Нила (ВЗН) происходит преимущественно трансмиссивным путем. Основными резервуарными хозяевами вируса являются птицы, а переносчиками - комары. Человек считается конечным звеном в цепи передачи, так как вирусемия в крови людей не достигает уровня, необходимого для заражения комаров [9]. В 2002 г. в США и Канаде впервые зарегистрирована передача вируса ЛЗН от доноров, у которых отсутствовали клинические симптомы: в Канаде - четыре случая после переливания крови, в США - 23 случая после переливания крови или ее компонентов и четыре - в результате трансплантации органов; девять реципиентов умерли [13]. С 2003 г. в обеих странах введен обязательный скрининг крови доноров методами ПЦР, которые позволяют обнаружить РНК вируса на ранних стадиях заболевания [13]. В Европе в период с 2009 по 2012 гг. было зарегистрировано 11 случаев передачи ВЗН с биоматериалом от доноров в Италии [7] и один случай в Греции [5]. В 2012 г. ECDC были разработаны методические указания по обеспечению безопасности донорской крови [14]. В РФ эпидемическая активность природных очагов ЛЗН на юге европейской части (Астраханская, Волгоградская, Ростовские области) в последнее десятилетие практически не прекращается. С 1999 по 2009 гг. здесь зарегистрировано 979 случаев заболеваний ЛЗН [3]. В следующие три года нозоареал инфекции значительно расширился [1, 2], а число больных составило 1140 человек. Подавляющее большинство заболеваний отмечено в Волгоградской области - 78,8; 37 и 46,3% от общего числа случаев, зарегистрированных в 2010, 2011 и 2012 гг., соответственно [2, 3]. Исследования сывороток крови показали наличие IgG к ВЗН у 13,5% (27/200) доноров в Волгоградской области (2010 г.) и у 5,2% (22/423) - в Ростовской обл. (2008 - 2010 гг.) [3]. Эти данные свидетельствуют об интенсивной циркуляции вируса на указанных территориях. Целью нашей работы было изучить инфицированность ВЗН доноров, проживающих на территории очагов ЛЗН с многолетней активностью, и оценить возможность передачи возбудителя при использовании крови доноров. Для этого методами ПЦР и ИФА исследовали сыворотки крови доноров, собранные в 2012 г. в Волгоградской области, где в период с 7 июля по конец октября было зарегистрировано 210 случаев ЛЗН [2]. Материалом послужили 432 образца сыворотки крови, собранные в августе и сентябре 2012 г. в Волгограде и г. Волжском, где преимущественно регистрировали случаи заболевания ЛЗН. РНК ВЗН выделяли из 1 мл сыворотки крови, используя набор реагентов «Амплисенс-МАГНО-сорб». Постановку ПЦР и детекцию продуктов амплификации проводили с использованием набора реагентов «Амплисенс WNV-Fl» согласно инструкции производителя (производство ЦНИИ эпидемиологии). Аналитическая чувствительность метода - 500 копий РНК ВЗН/мл. Для определения IgM и IgG использовали коммерческий набор реагентов «Биоскрин ВЗН (IgM)» и «Биоскрин ВЗН (IgG)» производства ЗАО «БиоСервис» (г. Боровск, Московская область). Положительными считали образцы, для которых полностью выполняли условия, указанные в инструкции к наборам. Согласно результатам серологического анализа 16,2% (70/432) доноров имели антитела к ВЗН, причем у 8,8% (38/432) выявлены только IgG, у 0,93% (4/432) - только IgM и у 6,5% (28/432) - антитела обоих классов. 38 доноров, вошедших в первую группу, можно рассматривать как реконвалесцен-тов, переболевших ЛЗН в предыдущий эпидемический сезон. Исследования, проведенные в Волгограде после вспышки 2010 г., показали, что через год после перенесенного заболевания антитела только этого класса присутствуют в крови у 27,8% реконвалесцентов. Вторая группа объединяет четырех доноров, находящихся в начальном периоде заболевания: титры IgM варьировали от 1:100 до 1:800. Известно, что антитела этого класса появляются у доноров в среднем через 3,9 суток после обнаружения РНК ВЗН, причем их появление коррелирует с началом снижения вирусемии. Естественное снижение концентрации вируса в крови происходит при сероконверсии IgM, вследствие чего вирусемию не удается обнаружить у большинства пациентов. Так, у больных, госпитализированных после появления клинических симптомов, антитела класса IgM выявляются в первую неделю заболевания в 100% случаев, тогда как РНК вируса выявляют только у 40% (30 - 50%) больных. В данном исследовании РНК ВЗН не была обнаружена ни у одного донора из этой группы. 28 доноров третьей группы имели антитела обоих классов. В трех случаях (0,7%, 3/432) титры IgM превышали титры IgG, что свидетельствует об острой инфекции [12]. Соотношение IgM/IgG было следующее: 1:800/1:400, 1:1600/1:400, 1:3200/1:400. В одном случае титры обоих иммуноглобулинов были равны (1:400), во всех остальных случаях титры IgG (от 1:200 до 1:3200) были выше, чем IgM (от 1:100 до 1:400) - ситуация, характерная как для выздоравливающих, так и для реконвалесцентов, перенесших заболевание в предыдущий эпидемический сезон. В связи с этим, точное определение статуса указанной части доноров данной группы требует проведения дополнительных исследований, например, изучения авидности IgG. В этой группе РНК ВЗН была выявлена в образце с титрами IgM, равными 1:3200 и IgG - 1:400 (0,2%, 1/432) от 03.08.2012 г. Таким образом, в период забора крови в острой стадии инфекционного процесса находились, по крайней мере, семь доноров (1,6%, 7/432), из которых четверо имели IgM, трое - антитела обоих классов, включая одного донора с РНК ВЗН. Анализ данных литературы показывает различную частоту обнаружения РНК ВЗН у сероотрицательных и сероположительных доноров. Например, во время вспышки ЛЗН в 2010 г. в Греции РНК ВЗН выявлена у одного из 619 обследованных сероотрицательных доноров [14], в Италии - у одного из 5726 [11]. В США среди 1468 образцов плазмы крови доноров, собранных в 6 штатах, наиболее пострадавших во время вспышки ЛЗН в 2002 г., РНК вируса обнаружили в одном сероотрицательном образце (0,07%, 1/1468) и в двух образцах (0,14%, 2/1468), содержавших одновременно IgM и IgG. В штате Калифорния (2007 г.) РНК вируса выявлена у 75 из 74 250 доноров (0,1%). Серологический анализ 34 из них показал, что в 4 образцах антитела отсутствуют, в 9 - имеются IgM и в 21 - антитела обоих классов [8]. При исследовании 155 280 образцов крови доноров из Нью-Йорка во время вспышки 2010 г. РНК ВЗН обнаружена в 20 (0,0129%) образцах, среди которых два были положительными по IgM и пять - по IgM и IgG одновременно [6]. Таким образом, частота обнаружения РНК ВЗН в целом очень низка. Поэтому отсутствие в данном исследовании сероотрицательных образцов, содержавших РНК вируса, можно рассматривать как следствие небольшой выборки. Считается, что риск заражения при переливании крови или пересадке органов наиболее высок в период вирусемии, до начала иммунного ответа [10]. Специальные исследования показали, что методами ПЦР РНК вируса в среднем удается детектировать в образце крови в течение 14 дней после инфицирования, причем максимум вирусемии наблюдается на 5 - 6 сутки. В отдельных случаях РНК ВЗН выявляли у доноров через 40 дней [10]. Такие же поздние сроки отмечены и при анализе клинических случаев. Сероконверсию IgM у доноров регистрируют в среднем на 8, а IgG - на 10 - 11 сутки. Таким образом, вирус может продолжительное время циркулировать в крови после появления антител, однако вирусная нагрузка в этот период значительно снижается [10]. Подтверждением служит тот факт, что практически во всех описанных в настоящее время случаях передачи ВЗН с компонентами крови (при переливании крови) была использована кровь сероотрицательных доноров с вирусе-мией [7]. Иная ситуация складывается при пересадке органов: зафиксированы случаи передачи ВЗН от доноров, у которых инфекция перед забором органов для трансплантации не была выявлена методом ПЦР, а серологические методы не применяли, а также от доноров с недетектируемой методом ПЦР вирусемией, но с выявленными при ретроспективном серологическом анализе IgM [7]. Учитывая эти данные, можно считать, что среди исследованных нами образцов, по крайней мере, пять (один образец с РНК ВЗН и четыре с антителами класса IgM) представляют опасность при дальнейшем использовании. Это свидетельствует о возможности нетрансмиссивной передачи ВЗН на территории России и необходимости введения соответствующего контроля. В настоящее время для скрининга крови доноров рекомендуют использовать метод ПЦР, который позволяет выявлять ВЗН на ранних стадиях заболевания [14], в том числе до начала появления клинических симптомов. Последние регистрируют лишь у 26% доноров [15]. Скрининг крови доноров рекомендуют проводить либо в формате минипулов, объединяя образцы плазмы крови от 6 - 16 пациентов, либо исследуя образцы индивидуально. Выбор стратегии определяется интенсивностью циркуляции вируса как на обследуемой, так и на соседних территориях [15]. Выявление одного положительного минипула служит основанием для перехода к исследованиям индивидуальных образцов. В случае отсутствия положительных результатов при обследовании индивидуальных образцов крови в течение 7 дней рекомендуют возвращаться к исследованию минипулов. Следует отметить, что при использовании формата минипулов доноров с низким уровнем вирусемии не всегда удается выявить, что приводит к случаям передачи ВЗН [6]. Полученные данные свидетельствуют о том, что скрининг крови доноров на эндемичных по ЛЗН территориях только методом ПЦР следует считать недостаточным: из пяти образцов, представляющих опасность, в четырех РНК ВЗН не была обнаружена. Поэтому для повышения эффективности скрининга можно рекомендовать анализ только индивидуальных образцов крови без объединения их в минипулы параллельно с исследованием образцов методом ИФА на наличие IgM. Несмотря на то, что при этом в категорию риска попадут не только доноры, находящиеся на ранних стадии заболевания, но и реконвалесценты, такой подход позволит исключить возможность передачи вируса с кровью доноров, у которых РНК ВЗН не удалось выявить методом ПЦР.

About the authors

L. S Karan

Central Research Institute of Epidemiology

Moscow, Russia

M. V Fedorova

Central Research Institute of Epidemiology

Moscow, Russia

K. A Gridneva

Central Research Institute of Epidemiology

Moscow, Russia

A. N Chaika

Volgograd, Russia

E. I Romasova

Volgograd, Russia

References

Supplementary files