ANTAGONISTIC ACTIVITY OF NOVEL GREEN MICROALGAE STRAINS

Full Text

В настоящее время особое внимание уделяется изучению механизмов, лежащих в основе резистентности патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, а также поиску новых природных соединений, обладающих антибактериальной активностью [14]. Исследование внеклеточных метаболитов и клеточных экстрактов морских и пресноводных микроводорослей как источника биологически активных веществ, используемых в терапевтических целях, были начаты в середине XX века и не утратили своей актуальности по сегодняшний день [2, 11]. В настоящее время доказана их антибактериальная, антипротозойная, антиплазмодиальная, противогрибковая, противовирусная активность [15, 16]. Исследуется биохимическая природа этих явлений. Так, первым биологически активным веществом с выраженной антибактериальной активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий, выделенным из культуры микроводорослей рода Chlorella, был хлореллин, представляющим собой смесь жирных кислот. В последующем было установлено, что антибактериальной активностью обладают также продуцируемые водорослями низкомолекулярные метаболиты (глицерогликолипиды, диацилглицерины, моногалактозилдиацилглицерины, дигалактозилдиацилглицерины, свободные стерины, сульфохиновозилдиацилглицерины, триацилглицерины и др.), фото-синтетические пигменты (а- и Р-каротиноиды, фукоксантин, астаксантин), фенольные соединения (полифенолы и их производные, тонины), свободные аминокислоты и др. [6, 13]. Кроме того, следует отметить, что использование микроводорослей как источника противомикробных соединений, обусловленное, прежде всего, их способностью синтезировать данные вещества в культуральных условиях, позволяет рассматривать их как перспективный объект управляемого биосинтеза [1, 4]. Проблема поиска новых штаммов и соединений, представляющих потенциальный интерес для медицины в качестве перспективных противомикробных агентов, является актуальной. Исходя из этого, целью настоящего исследования является скрининг новых штаммов микроводорослей на наличие выраженной антибактериальной активности. Объектом исследования послужили чистые культуры пресноводных и галофильных микроводорослей отдела Chlorophyta, выделенные из природных водоемов Оренбургской области. Среди них: Chlorococcum infusionum (Schrank) Menegh., Chlamydomonas reinhar-dii P.A. Dang., Scenedesmus obliquus (Turpin) Ktitz, Pediastrum duplex Meyen var. duplex, Coelastrum microporum Nageli, Dictyosphaerium sp., Chlorella vulgaris Bory, Monoraphidium arcuatum (Korschikov) Hindak (=Ankistrodesmus arcuatus Korschikov), Scenedesmus magnus Meyen var. magnus (= S. quadricauda var. setosus Kirchn.), Dunaliella parva Lerche, Asteromonas gracilis Artari. Культуры микроводорослей были выделены из поверхностных проб воды с помощью батометра Руттнера с глубины не более 50 см. Идентификацию водорослей проводили на основании их фенотипических свойств в соответствии с определителями серии [7, 10, 12]. Альгологически чистые культуры получали методом механического разобщения шпателем на соответствующих плотных питательных средах или отсаживанием единичных клеток с помощью микроманипулятора при микроскопии. Экспериментальные исследования проводили с использованием аксенически чистых культур водорослей. Антагонистическую активность водных экстрактов исследуемых культур микроводорослей оценивали фотометрическим методом [1]. Клеточные экстракты получали путем центрифугирования жидкой культуры, ресуспендирования клеток в дистиллированной воде с последующим замораживанием-оттаиванием. Полученные экстракты в объеме 0,4 мл вносили в смесь 2,5 мл мясо-пептонного бульона с 0,1 мл (109/мл) взвеси условно патогенных бактерий. В качестве контрольных проб к 0,1 мл взвеси тест-штаммов добавляли 0,4 мл среды, используемой для приготовления экстрактов. Опытные и контрольные пробы культивировали в течение 24 часов при температуре 37°С, а затем определяли оптическую плотность образцов на фотометре ИФА-ОЭП при длине волны 492 нм. По подавлению роста в опытных пробах, по сравнению с контрольными, судили о наличии антагонистической активности. В качестве тест-объектов использовали штаммы грамотрицательных и грамположительных условно патогенных бактерий (Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus) из коллекции культур микроорганизмов лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Экспериментальное сокультивирование осуществляли при температуре 25°С в без-бактериальной воде с уровнем минерализации 120 г/л, полученной путем мембранной фильтрации и автоклавирования рапы соленого озера Тузлучное (Оренбургская область). Исходная концентрация условно патогенных бактерий составила 105 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали тест-штамм в безбактериальной рапе, не содержащей микроводоросли. Учет вели по количеству выросших колоний E. coli на среде Эндо. В первые 4 часа высевы делали через каждый час, а в последующем с периодичностью в 2 ч. Для определения антимикробной активности грязи использовали разведенную 0,9% раствором NaCl (в соотношении 1:1) и профильтрованную через крупнопористый фильтр нативную грязь озера Тузлучное. Экспериментально исследована антагонистическая (антибактериальная) активность по отношению к условно патогенным бактериям E. coli, K. ozaenae, P. aeruginosa, S. aureus у клеточных экстрактов 11 культур водорослей, принадлежащих к отделу Chlorophyta, 9 из которых являются пресноводными (S. obliquus, S. magnus var. magnus, C. microporum, P. duplex var. duplex, C. infusionum, C. vulgaris, M. arcuatum, Dictyosphaerium sp., C. reinhar-dii), а 2 культуры: A. gracilis, D. parva - галофильными. В результате выявлено, что антагонистическое действие на отдельных представителей условно патогенных бактерий оказывали 100% изученных культур. Однако спектр антибактериальной активности клеточных экстрактов разных видов, а также чувствительность условно патогенных бактерий отличались. Установлено, что клеточные экстракты всех исследуемых штаммов водорослей оказывали высокое ингибирующее воздействие на E. coli, подавляя рост на 60 - 95%. Под влиянием экстрактов Dictyosphaerium sp., C. vulgaris, M. arcuatum отмечали максимальную задержку роста кишечной палочки (более 90%). Также среди изученных культур зеленых водорослей, за исключением D. parva, была отмечена широкая распространенность антагонистической активности по отношению к S. aureus (38,5 - 94,5%). По отношению к K. ozaenae антагонистическую активность проявляли 73% штаммов, максимальная активность была зарегистрирована у клеточных экстрактов культур P. duplex var. duplex, Dictyosphaerium sp., C. vulgaris (ингибирование роста бактерий свыше 90%). Клеточные экстракты культур S. obliquus, S. magnus var. magnus и M. arcuatum ингибировали рост K. ozaenae в среднем на 50%. Экстракты C. microporum, C. infusionum, C. reinhardii, A. gracilis, D. parva не обладали антагонистической активностью (снижение роста менее чем на 20%). Клеточные экстракты этих же культур водорослей обладали столь же низкой антагонистической активностью и по отношению к P. aeruginosa, тогда как экстракты S. obliquus, S. magnus var. magnus, P. duplex var. duplex, C. vulgaris, M. arcuatum, Dictyosphaerium sp. подавляли рост псевдомонад на 81,2 - 96,7%. В целом, хлорококковые водоросли S. obliquus, S. magnus var. magnus, P. duplex var. duplex, C. vulgaris, M. arcuatum, Dictyosphaerium sp. обладали более выраженной антагонистической активностью по отношению к условно патогенным бактериям, по сравнению с вольвоксовыми - C. reinhardii, A. gracilis, D. parva. Антагонистическая активность микроводорослей имеет значение в самоочищении водоемов от фекального загрязнения, поскольку водоросли, обладающие данным признаком, способны подавлять развитие условно патогенных и энтеропатогенных санитарно-показательных бактерий, что обусловливает их активное участие в поддержании санитарно-гигиенических характеристик природных водоемов. Ранее на примере гало-фильной водоросли D.salina нами было показано ускорение элиминации E. coli из рапы [8], аналогичный эффект был отмечен и для экстракта клеток другой галофильной микроводоросли A. gracilis. Губительный эффект экстракта клеток A. gracilis на аллохтонную микрофлору укорачивал сроки сохранения E. coli в рапе, способствуя более быстрой элиминации, что, вероятно, происходило за счет высвобождения внутриклеточных антагонистических веществ при разрушении водорослевых клеток, о чем свидетельствует отсутствие антагонистического действия под влиянием живой культуры A. gracilis. Более выраженный эффект действия клеточных экстрактов по сравнению с супернатантами отмечали и ранее у водорослей Microcystis aeruginosa, Platimonas viridis, Nephrochloris salina [3]. Внутриклеточно локализованные вещества, выделяющиеся при разрушении микроводорослей, могут также играть роль в обеспечении антибактериального действия пелои-да. Описана также способность пелоидов к самоочищению [9]. Исходя из этого, нами было оценено бактерицидное влияние пелоида по отношению к условно патогенным бактериям на примере лечебной грязи оз. Тузлучное. Отмечено, что длительность сохранения E. coli уменьшалась до 24 часов в опытной пробе по сравнению с контролем (стерильная рапа), в котором кишечная палочка сохранялась 76 часов. Таким образом, грязь озера Тузлучное ускоряла элиминацию условно патогенных бактерий из рапы. Антибактериальное действие пелоида оз. Тузлучное по отношению к условно патогенным микроорганизмам, с одной стороны, объясняет лечебный эффект грязи, а с другой стороны, ее способность к самоочищению. Учитывая, что большая часть пелоида оз. Тузлучное представлена клеточными экстрактами гидробионтов, можно заключить, что его бактерицидные свойства связаны не только с высокой минерализацией среды, а также с биологически активными веществами организменного происхождения, обладающими антагонистическим влиянием на условно патогенные бактерии. Согласно литературным данным, антибиотическая активность зеленых водорослей определяется пигментами, ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав липидов водорослевых клеток, фенольными соединениями, аминокислотами и др. [5]. В результате окисления хлорофилла и свободных жирных кислот синтезируются вещества, обладающие антибактериальным эффектом. Имеются сведения, что максимальное содержание свободных жирных кислот в культуральной жидкости водорослей достигается в стационарную фазу роста и напрямую связано с процессами автолиза [5]. Примером бактерицидного действия белково-хлорофилльного комплекса является ингибирование роста бактерий Pseudomonas saccharophila под действием водорослей D. maritima [5]. Исходя из выше сказанного, можно полагать, что подавление роста условно патогенных бактерий в эксперименте в присутствии водорослевых экстрактов происходит под действием внутриклеточно локализованных бактериостатических или бактерицидных веществ, выделяющихся в среду в результате разрушения клеток водорослей, что может происходить в естественных условиях водоема. Учитывая, что в условиях борьбы за экологическую нишу на одну из ведущих позиций выходит антагонизм, обеспечивающий доминирование конкурентоспособных видов в сообществе, можно заключить, что вещества, выделяющиеся из разрушенных клеток автохтонных водорослей, обеспечивают резистентность биотопа к заселению аллохтон-ными микроорганизмами и стабильность структуры биоценоза. Скорость элиминации аллохтонных микроорганизмов может значительно повышаться при массовом отмирании микроводорослей, что является одним из механизмов самоочищения водоема. Таким образом, исследованные новые штаммы зеленых микроводорослей, благодаря наличию у них выраженной антагонистической активности, могут иметь широкое практическое применение, связанное с доочисткой сточных вод в системах очистных сооружений.

About the authors

E. A Selivanova

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

M. E Ignatenko

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

N. V Nemtseva

Research Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

References

Supplementary files