REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION IN TULAREMIA LABORATORY DIAGNOSTICS

Full Text

В практике здравоохранения диагноз туляремии у больных людей устанавливают на основе клинико-эпидемиологических данных, подтвержденных лабораторными иммуно-серологическими методами. Клиническая диагностика туляремии в ранний период затруднена из-за наличия неспецифических симптомов, характерных для других инфекционных заболеваний. Серологическая диагностика, свидетельствующая о заболевании, основана на выявлении антител у больных в реакциях агглютинации (РА) и непрямой гемагглютинации (РНГА); антитела определяются, как правило, только через 7 - 15 суток. Дальнейшее нарастание этих титров антител выше диагностических (>1:100) подтверждает свежий случай туляремии [3]. Более ранняя диагностика (в течение первой недели болезни) возможна с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Между тем, до настоящего времени этот эффективный метод серологической диагностики туляремии не находит широкого применения из-за отсутствия диагностической тест-системы и доступен лишь специализированным научным лабораториям. Бактериологическая диагностика туляремии имеет вспомогательное значение. Высокочувствительный метод определения ДНК Francisella tularensis - полимеразная цепная реакция (ПЦР), его диагностические возможности недостаточно изучены и он не внедрен в клиническую практику [3]. Отмечено, что при исследовании крови больных в ПЦР чувствительность реакции составляла 103 - 104 КОЕ/мл [5]. Более эффективной оказалась ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), позволившая выявлять 101 - 102 КОЕ/мл [7]. Повышение специфичности и чувствительности ПЦР до 1 КОЕ/мл возможно при использовании меченных флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб (зондов), комплементарных участку PCR-продукта [11]. Таким образом, наиболее эффективным методом выявления возбудителя может стать ПЦР-РВ в качестве дополнительного для ранней диагностики туляремии. Цель работы - совершенствование лабораторной диагностики туляремии путем определения ДНК F.tularensis в сыворотке крови больных методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Исследование проводили на 39 образцах сывороток периферической крови, полученных от больных в период трансмиссивной эпидемической вспышки туляремии в г. Ханты-Мансийск летом 2013 года. Сыворотки (n=13) были отобраны у больных в период 11 - 22 сут от начала заболевания (1 группы больных); 26 парных сывороток (2 группа) включали: первые сыворотки (n=13), взятые в начальный период заболевания до 7 - 10 сут, вторые (n=13) - через 7 - 28 сут после первого взятия. Сыворотки доставляли в лабораторию в течение 24 час. при 4 - 8°С, замораживали и хранили при -20°C. В качестве контроля использовали 6 сывороток больных с диагнозами: хронический бруцеллез (1), микоплазмоз (1) и неясной этиологии (4). Сыворотки исследовали с помощью серологических реакций: РА с туляремийным диагностикумом (НПО Микроген) и РНГА (макро-метод) с эритроцитарным туляремийным антигенным диагностикумом ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, а также с помощью ПЦР-РВ. Для выделения ДНК использовали комплекты наборов «Проба НК» (НК), «Проба ГС» (ГС) и «Проба Рапид» (ПР) (ДНК-Технология, Россия). Выделение ДНК проводили по инструкции производителя, соотношение отобранного образца сыворотки (100 мкл) и реагента ПР составляло 1:6. ДНК-мишенями в амплификации служили: участок ISFtu2 - элементно-подобный вставки в геноме F.tularensis и ген tul4 (1рпА), кодирующий иммуногенный эпитоп белка м.м. 17 кД наружной мембраны F.tularensis. В состав амплификационных смесей были включены выбранные нами видоспецифические праймеры: ISFTu2F/R [11] и Tul4GF/R [1], а также зонды: ISFTu2P [11] и tul4-PR2 (FAM) CTCCAGAAGGTTCTAAGTGCCATGAT-(RTQ1) для увеличения специфичности реакции. Последний зонд подобран совместно с сотрудниками ЗАО «Синтол» (Россия). Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ с флуоресцентными зондами состояла из 2,5 мкл 10х ПЦР-буфера (рН 8,8), 1,5 мкл 25 mM MgCl2, 2,5 мкл смеси дНТФ по 2,5 mM каждого (2,0 мкл для тест-системы ISFTu2+ISFTu2P), 12 pM каждого праймера, 6 pM флуоресцентной пробы, деионизированной воды, фермента 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами и 5 мкл ДНК-матрицы (конечный объем смеси - 25 мкл). Контролем служили: деионизированная дистиллированная вода - отрицательный контроль; образец, содержащий ДНК-матрицу F.tularensis (штамм 503) - положительный контроль. Предел определения ДНК F.tularensis составлял 3,9х102 КОЕ/мл (эквивалентный ДНК-копиям/мл). ПЦР-РВ проводили в приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия). Программа термоциклирования реакционных смесей: I цикл - 94° - 5 мин, II - (94° - 30 сек, Т° отжига - 60 сек) х 45 циклов. После амплификации проводили плавление продукта в диапазоне 68 - 94°С. Использовали повышение температуры (на 1°) и удержание ее на каждом шаге по 5 сек. Детекцию полученных фрагментов осуществляли гибридизационно-флуоресцентным методом. При анализе результатов использовали программу Rotor-Gene 6000 (версия 1.8.17.5), специфичность амплификационного продукта определяли по кинетическим кривым плавления и контрольным образцам. Для статистической обработки результатов использовали общепринятые биометрические методы. Доверительный интервал для средних величин рассчитывали с вероятностью при Р=0,05. Первоначально сыворотки всех больных были исследованы серологическими методами для определения диагностических возможностей традиционных методов. Специфические антитела при исследовании сывороток 1 группы больных выявлены у 12 из 13 чел. (92,3+14,5%) в РА с титрами антител от 1:50 до 1:400 и в РНГА у всех 13 чел. (100+13%) с титрами от 1:400 до 1:1600. Антитела в сыворотках 2 группы больных обнаружены в РА в первые сутки от начала заболевания у 3 человек (23,1+23,4%) с титрами 1:50 - 1:800, в соответствующих парных сыворотках этой группы выявлены антитела с титрами 1:50 - 1:800 у 12 больных (92,3+14,5%); в РНГА у 4 (30,8+10,4%) с титрами 1:100 - 1:1600, в парных сыворотках - с титрами 1: 100 - 1:1600 у всех 13 больных (100+13%). Для выявления наибольшей эффективности ПЦР-РВ были апробированы три метода экстракции ДНК из сывороток крови больных на примере 1 группы. ДНК из сывороток выделяли 3 методами: НК, ГС, ПР. При выделении ДНК методами НК и ГС положительные результаты получены с 4 образцами сывороток (30,8+25,6%) с праймерами и зондом Tul4GF/R+tul4-PR2 и 8 образцами (61,5+27%) с ISFTu2F/ R+ISFTu2P. При выделении ДНК методом ПР положительные результаты были получены с 11 сыворотками (92,3+14,8%) в реакции с Tul4GF/R+tul4-PR2 и 13 (100+13%) - с ISFTu2F/R+ISFTu2P. Полученные результаты свидетельствовали о лучшей экстракции ДНК методом ПР и предпочтительном использовании праймеров с зондом ISFTu2F/R+ISFTu2P. В связи с полученными результатами ДНК из сывороток 2 группы выделяли только методом ПР. ДНК F.tularensis обнаружена во всех 26 образцах (100+13%) в ПЦР-РВ с ISFTu2F/R+ISFTu2P, тогда как при использовании Tul4GF/ R+tul4-PR2 ДНК выявлена в 10 из 13 первых сывороток (76,9+23,4%) и 9 парных сывороток (69,2+25,6%). В контрольных сыворотках больных с различной этиологией ДНК возбудителя туляремии не была выявлена. Таким образом, ПЦР-РВ показала определенные преимущества перед серологическими методами особенно для диагностирования заболевания в первые сутки после заражения. Наиболее эффективным при исследовании сывороток больных в ПЦР-РВ было сочетание праймеров и зонда ISFTu2F/R+ISFTu2P. Использование другого сочетания праймеров и зонда Tul4G+tul4-PR2 оказалось менее перспективным в связи с более длительной амплификацией ПЦР-продукта длиной 357 пар нуклеотидов (п.н.), тогда как размер ампликонов при использовании ISFTu2+ISFTu2P составляет 97 п.н. Так как мы использовали сыворотку крови больных, важно было понять, как бактерии (и ДНК) могли попасть в нее из форменных элементов крови. В эксперименте ex vivo показано, что вирулентный штамм F.tularensis мог быть обнаружен в лейкоцитах, плазме, эритроцитах крови человека [4, 6]. Впервые нами показано, что ПЦР-РВ является эффективным методом выявления ДНК F.tularensis в сыворотке крови больных для ранней диагностики туляремии, а также для диагностики на протяжении первого месяца заболевания. В организме больного человека, как показано ранее, туляремийные бактерии содержатся в очень малом количестве, культуры иногда выделяли в ранние сроки от начала заболевания из кожной язвы, бубона (лимфоузла), крови [2, 10]. Имеются данные о редких случаях изоляции возбудителя туляремии из крови больных в более поздние сроки болезни, чаще при наличии пневмонии или иммунодефицита. У данных больных отмечалась бактериемия с гематогенной диссеминацией возбудителя [8, 9]. Обобщая данные нашего исследования, можно заключить, что по времени выделения и количеству экстрагированной ДНК F.tularensis из сыворотки крови больных наиболее оптимальным оказался экспресс-метод «Проба Рапид». Использование праймеров с флуоресцентным зондом обеспечило высокую чувствительность, специфичность ПЦР-РВ, что позволило определять ДНК F.tularensis в сыворотках крови как в ранний период заболевания, когда не выявлены специфические антитела, так и в более отдаленные сроки - через 3 - 4 недели от начала заболевания, что подтверждает результаты иммуно-серологической диагностики туляремии.

About the authors

M. I Kormilitsyna

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

I. S Mescheryakova

Moscow, Russia

T. V Mikhailova

Moscow, Russia

A. A Dobrovolsky

Regional Clinical Hospital

Khanty-Mansiysk, Russia

References

Supplementary files