FEATURES OF BIOFILM MORPHOLOGY, FORMED BY CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE GRAVIS tox+ STRAINS

Full Text

В настоящее время заболеваемость дифтерией как в России, так и за рубежом почти не регистрируется. Однако, в условиях проведения вакцинации дифтерийным анатоксином искоренить бактерионосительство невозможно, и циркуляция возбудителя среди населения сохраняется [2, 3]. Известно, что направленные на борьбу с возбудителем дифтерии антибактериальные препараты не всегда эффективны при проведении санации бактерионосителей, что может быть связано со способностью возбудителя формировать биопленки [1]. Многие заболевания, вызываемые бактериями, сопровождаются формированием в организме хозяина биопленок микроба-возбудителя данной патологии [4, 5]. Бактериальные биопленки представляют собой сложные микробные сообщества, сформированные множественными слоями бактериальных клеток, прикрепленных к поверхности раздела фаз и друг к другу, покрытых экзополисахаридом (ЭПС). Внутри ЭПС осуществляются коммуникационные взаимодействия клеток, в том числе, и при участии генетически детерминированного регуляторного механизма «Quorum Sensing» [9]. В биопленке, по сравнению с планктонными культурами бактерий, иначе протекают физиологические процессы, связанные с продукцией метаболитов и биологически активных веществ, что способствует усилению их защиты от воздействия антибиотиков, факторов врожденного и адаптивного иммунитета. Возникновение у бактерий подобных поведенческих особенностей является одним из факторов, способствующих развитию хронических инфекционных заболеваний у человека [5, 6]. Изучение процессов биопленкообразования у C. diphtheriae с помощью электронной сканирующей микроскопии, проводимой in situ, позволяет оценить структурнофункциональные характеристики биопленок, в том числе, клеточные структуры, участвующие в их образовании. Знание структуры биопленочных сообществ возбудителя дифтерии может дать информацию о возможных способах его защиты от внешних факторов и роли процессов биопленкообразования в длительной персистен-ции C. diphtheriae в организме бактерионосителей. Целью настоящей работы явилось изучение структуры однородных микробных сообществ штаммов C. diphtheriae gravis tox+ при формировании биопленок in vitro. Были использованы штаммы: C. diphtheriae gravis tox+ № 665, полученный из ГИСК им. Л.А.Тарасевича, и C. diphtheriae gravis tox+, выделенный от больного с диагнозом «локализованная форма дифтерии» бактериологической лабораторией ЦГСЭН Ростова-на-Дону. Культивирование штаммов дифтерийных бактерий осуществляли в стеклянных пробирках, содержащих по 3 мл 20% сывороточного бульона. Тестирование штаммов на способность формировать биопленки проводили по методике P. R. Watnick [11]. Интенсивность биопленкообразования штаммов возбудителя дифтерии оценивали, измеряя оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм. Для исследования использовали 120- и 720-часовую биопленочные культуры исследованных штаммов C. diphtheriae gravis tox+. При проведении сканирующей электронной микроскопии приготовление препаратов осуществляли путем погружения в среду культивирования нержавеющей подложки для поверхностной адгезии бактериальных клеток, формирующих биопленку. Образцы биопленочной культуры токсигенных штаммов C. diphtheriaе gravis tox+ № 665 и C. diphtheriaе gravis tox+ (циркулирующий), адгезированные к подложке, подвергали химической фиксации. Микробные клетки обрабатывали 4% раствором глутарового альдегида и 40% раствором формальдегида, фиксировали в течение 24 часов при комнатной температуре. Образцы биопленочных культур C. diphtheriae после фиксации дегидратировали. Дегидратацию образцов проводили в охлажденных до +4°С водных растворах этилового спирта возрастающей концентрации для предотвращения экстракции различных компонентов клеток (30% - 15 мин; 50% - 15 мин; 70% - 15 мин; 96% - 15 мин; 100% - 15 мин) и в 100% ацетоне (двукратно по 10 минут). Затем образцы биопленок высушивали на воздухе. Обезвоженные образцы биопленки помещали на предметный столик сканирующего электронного микроскопа и напыляли золотом в напылительной вакуумной установке EicoIB-3 ion coater («Eico», Япония) при ионном токе 6 - 8 мА. Полученные образцы исследовали в сканирующем электронном микроскопе S-450 («Hitachi», Япония) при ускоряющем напряжении 30 кВ. Динамика образования ЭПС при культивировании музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae имела общие закономерности. Так, с начала образования ЭПС (48 час культивирования) уровень ОП был минимальным и составил для музейного штамма C. diphtheriae № 665 - 0,233, для циркулирующего - 0,062. Затем к 120 часу культивирования интенсивность образования ЭПС у музейного штамма достигла максимума, составив 0,630, и значительно увеличилась у циркулирующего штамма C. diphtheriae (ОП - 0,290). К 168 часу роста наблюдали резкое снижение значений ОП у двух исследованных штаммов (0,395 - у музейного и 0,209 - у циркулирующего штамма). Далее происходило постепенное нарастание уровня ОП, которое достигло к 720 часу у музейного штамма значений 0,524, у циркулирующего - 0,481. При сравнении процесса образования ЭПС музейным и циркулирующим штаммами C. diphtheriae gravis tox+ были выявлены и некоторые отличия. Так, интенсивность образования ЭПС музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ была выше (диапазон колебаний ОП находился в пределах от 0,233 до 0,630), чем циркулирующим (ОП - от 0,062 до 0,481). Причем, наиболее четко это прослеживалось с 48 часа по 456 час культивирования. Между показателями интенсивности образования ЭПС двумя исследованными штаммами максимальные различия (0,340) были обнаружены на 120 час культивирования, минимальные (0,043) - на 720 час. Обращает на себя внимание тот факт, что для пик образования ЭПС музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ № 665 приходился на ранние сроки (120 час культивирования), циркулирующим - на значительно более поздние (720 час культивирования). Электронно-микроскопическое исследование препаратов биопленок возбудителя дифтерии проводили на 120 и 720 часы культивирования, что соответствовало пикам формирования ЭПС музейным и циркулирующим штаммами C. diphtheriae gravis tox+ при длительном их культивировании in vitro. Использование сканирующей микроскопии позволило получить изображения, отражающие особенности морфологии биопленочных культур дифтерийных бактерий. Образованные возбудителем дифтерии биопленки представляли собой погруженные в экзополисахаридный матрикс конгломераты клеток, которые варьировали по плотности, создавая открытые области, являющиеся, вероятно, водными каналами. Экзополисахарид имел вид множества слизистых, соединяющихся между собой тяжей паутины, которые покрывали микробные клетки общим слоем. Известно, что размеры микробных клеток типовой культуры C. diphtheriae варьируют в пределах 0,3 - 0,8х1,5 - 8,0 мкм [1, 7]. При анализе их возможных изменений у биопленочных культур музейного и циркулирующего штаммов C. diph-theriae было установлено, что на пиках формирования ЭПС на 120 и 720 часы культивирования ширина микробных клеток не изменялась и находилась в диапазоне от 0,4±0,03 мкм до 0,7±0,1 мкм, тогда как длина клеток имела достоверные отличия. На пике образования ЭПС (120 час) длина микробных клеток музейного штамма C. diphtheriae gravis tox+ № 665 составляла 1,4±0,08 мкм. При более длительных сроках культивирования данного штамма (720 час) содержание ЭПС было меньше, однако длина клеток была достоверно (р<0,05) больше и составила 1,7±0,1 мкм. При исследовании размеров клеток циркулирующего штамма C. diphtheriae gravis tox+ была обнаружена аналогичная закономерность: при максимальном количестве ЭПС, который у данного штамма приходился на 720 час культивирования, длина клеток была меньше (1,3±0,05 мкм), чем на более раннем этапе (120 час) биопленкообразования (1,6±0,05 мкм). Как известно, процесс формирования биопленки сопровождается образованием экзополисахаридного матрикса - продукта жизнедеятельности самих микробных клеток [9, 10]. Микробные клетки как музейного, так и циркулирующего штаммов C. diphtheriae gravis tox+ в процессе биопленкообразования обладали разобщенным во времени процессом формирования ЭПС, что сопровождалось изменением их размеров и пространственной организации. Пик образования ЭПС музейным штаммом C. diphtheriae gravis tox+ приходился на более ранние сроки культивирования (120 час), чем циркулирующим (720 час). При анализе изменений размеров бактериальных клеток музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae при формировании биопленки была установлена их обратная корреляция с интенсивностью образования ЭПС. При максимальном содержании ЭПС, которое приходилось на разные сроки культивирования для двух исследованных штаммов возбудителя дифтерии, наблюдали уменьшение размеров клеток корине-бактерий. Это могло быть связано с тем, что клетки в составе биопленки растут значительно медленнее, чем планктонные, в результате чего происходит замедление метаболических процессов, приводящее к диссоциации R-формы колоний в S-форму, за счет чего биопленки оказываются более стабильными, чем планктонные формы клеток [6, 8]. Такие состояния бактерий могут запускать механизмы адаптации, а именно, устойчивости к антибиотикам [6]. При этом создаются условиях для длительной персистенции возбудителя дифтерии в организме бактерионосителей, что осложняет проводимую антибиотикотерапию. Проведенная электронно-сканирующая микроскопия показала, что бактериальные клетки музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae в составе биопленки представляли собой палочки с хорошо видными зернами волютина, располагавшиеся хаотично и собранные в плотно сцепленные кластеры, между которыми находилось свободное пространство, формирующее, вероятно, водные каналы. Экзополисахаридный матрикс в виде «тяжей паутины» покрывал микробные клетки общим слоем. Выявленные на электронно-микроскопическом уровне морфологические особенности бактериальных биопленок музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae и закономерности динамики образования ЭПС отражали, вероятно, особые адаптивные возможности возбудителя, обусловливающие его конкурентоспособность в борьбе за сайты адгезии, устойчивость к факторам естественного иммунитета и, как результат, длительную персистенцию в организме бактерионосителей.

About the authors

Ya. N Frolova

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

G. G Kharseeva

Rostov State Medical University

Rostov-on-Don, Russia

V. N Gerasimov

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

S. A Kotov

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

I. A Dyatlov

State Scientific Centre of Applied Microbiology and Biotechnology

Obolensk, Moscow Region, Russia

References

Supplementary files