TH1/2-BALANCE SHIFT DURING ACUTE GRAFT-VERSUS-HOST REACTION DEVELOPING AGAINST THE BACKGROUND OF EXPERIMENTAL HYPERLIPIDEMIA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Одной из наиболее популярных на сегодняшний день лабораторных моделей для изучения реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) является экспериментальная система, в которой мышам-гибридам первого поколения (C57BL x DBA)F1 (BDF) переносятся лимфоидные клетки одной из родительских линий (C57BL или DBA) [5, 20, 21]. Такая полуаллогенная система представляет особый интерес для экспериментаторов, поскольку тип развивающейся в ней РТПХ определяется выбором донора трансплантируемых лимфоцитов: при введении клеток линии C57BL у мышей-реципиентов развивается острая РТПХ (оРТПХ), достаточно быстро приводящая к гибели значительной части животных в результате тяжелого поражения внутренних органов. А при введении клеток линии DBA возникает хроническая РТПХ (хРТПХ), которая развивается гораздо медленнее и сопровождается выраженными аутоиммунными реакциями (в частности, возникновением люпус-подобного иммунокомплекс-ного гломерулонефрита). Показано, что развитие и интенсивность патологических симптомов у животных в данной модели регулируется цитокинами, которые продуцируются активированными хелперами первого (Th1) и второго (Th2) типов и их соотношениями на различных этапах патогенеза острой и хронической РТПХ. При этом возникновение оРТПХ определяется выраженным доминированием Th1, так что воздействие, тормозящее активацию хелперов этого типа и препятствующее их эффектам, приводит к резкому снижению смертности мышей-реципиентов и уменьшает выраженность признаков заболевания [5, 20, 22, 24]. Развитие же хРТПХ при переносе клеток линии DBA не сопровождается таким выраженным преобладанием ТЫ-зависимых иммунных реакций. Это объясняется особым дефектом иммунной системы у мышей DBA - снижением способности CD8+-клеток продуцировать IFN-y [19]), и на первый план выходят патологические симптомы, связанные с активностью Th2: поликлональная стимуляция B-лимфоцитов, появление высоких титров аутоантител, отложение иммунных комплексов в тканях и другие признаки патологического функционирования иммунной системы у мышей-реципиентов [8, 15]. Более того, нами было обнаружено, что развитие хРТПХ в данной модели может протекать по двум вариантам клинического течения, также зависящим от создаваемого в организме реципиентов баланса между Th1- и ^2-клетками [2, 15]. При относительном преобладании Th2 в ранние сроки после индукции хРТПХ исходом заболевания, регистрируемым через 3 - 4 месяца, является возникновение классического люпус-подобного гломерулонефрита, давно описанного при этой модели. В то же время, у тех животных, у которых развитие хРТПХ происходило на фоне относительного сдвига ТЫ/Ш2-соотношения в сторону Th1, формировалось иммунопатологическое состояние, характеризующееся глубоким подавлением гуморального иммунного ответа на экзогенные антигены, а поражение почек было минимальным (более полное описание этих клинических вариантов хРТПХ представлено в работе О.ТКудаевой и др. [15]. Вышеописанные особенности данной лабораторной модели делают ее очень удобной для изучения Th1/Th2-баланса, его влияния на развитие иммунопатологических состояний и его изменений под воздействием различных агентов. Ранее мы использовали один из вариантов этой модели (развитие хРТПХ) для изучения влияния экспериментальной дислипидемии на Th1/Th2-соотношение in vivo. Было обнаружено [3], что индукция хРТПХ на фоне гиперхолестеринемии, вызванной многократным введением полоксамера 407 (Р407), приводит к достоверному увеличению частоты развития TM-зависимого варианта хРТПХ и, следовательно, эффект Р407, не ограничиваясь изменениями липидного метаболизма, выражается и в существенном влиянии на функционирование иммунной системы животных. Для подтверждения этого вывода в настоящей работе было исследовано влияние вызывающего дислипидемию агента - Р407 - на развитие оРТПХ в аналогичной полуал-логенной системе. МАТЕРИАЛ Ы И МЕТОДЫ Эксперименты выполнены на 280 мышах-самках линии C57BL/6 и гибридах Fi(DBA x C57BL/6). Животных получали из вивария СО РАМН в возрасте 2,5 - 3 месяца. Экспериментальную дислипидемию, характеризующуюся значительным повышением холестерина и триглицеридов в сыворотке крови животных, вызывали по методу Johnston Т.Р. [12] внутрибрюшинным введением полоксамера 407 (Pluronic F-127, Sigma) в дозе 7,5 мг/мышь в 0,5 мл среды RPMI-1640 через сутки в течение двух недель, как это было описано ранее [4]. Контрольным животным в те же сроки вводили 0,5 мл растворителя. Острую РТПХ индуцировали внутривенным введением мышам-гибридам BDF спленоцитов, полученных от родительской линии C57BL, в дозе 100х106 клеток/мышь однократно на следующий день после последнего введения Р407. Индукция оРТПХ у контрольных животных и у мышей с дислипидемией проводилась во всех экспериментах в один и тот же день. Концентрацию общего холестерина в сыворотке крови мышей определяли ферментативным методом с холестериноксидазой, используя наборы Analyticon CHOL, а содержание триглицеридов - методом с липопротеиновой липазой, глицерокиназой и глицерин-3-фосфатоксидазой, используя наборы Analyticon TG. Результаты измерений выражали в mM. Полученные данные приводятся в виде средних величин параметров, измеренных в нескольких независимых экспериментах. Статистическую значимость различий между исследуемыми показателями оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона - Манна - Уитни. РЕЗУЛ ЬТАТЫ Измерения уровня холестерина и триглицеридов у мышей-реципиентов в группе с введением Р407 показали, что к моменту индукции оРТПХ эти животные характеризуются существенным изменением параметров липидного метаболизма. Концентрация холестерина в сыворотке составляла у них 14 - 17 mM (при норме у интактных мышей BDF, равной 2,75 mM [4]), а триглицеридов - 40 - 50 mM (у интактных - 2,44 mM). Стоит отметить, что после прекращения инъекций Р407 эти параметры уже через 48 часов существенно снижаются и через 3 - 4 суток возвращаются к исходному нормальному уровню, так что все наблюдаемые в дальнейшем эффекты введения Р407 следует объяснять теми изменениями в иммунной системе животных, которые были обусловлены вызывающим дислипидемию агентом к начальному моменту индукции оРТПХ. При изучении кривых смертности животных в результате оРТПХ в течение 50 дней видно, что, во-первых, смертность за этот период в группе мышей с дислипидемией намного превышает смертность в контрольной группе с оРТПХ (к концу срока наблюдения в контрольной группе выжило 50% животных, в группе с дислипи-демией - 30%) и, во-вторых, падеж животных в группе с дислипидемией начинается заметно раньше и все время наблюдения опережает гибель мышей в контроле. Поскольку динамика смертности и, в конечном итоге, процент погибших животных является основным (и, если не считать морфологических данных, чуть ли не единственным) объективным критерием тяжести патологического процесса и интенсивности его развития при оРТПХ, на основании полученных результатов можно сделать вывод об иммуномодулирующем эффекте Р407, способствующем развитию оРТПХ в использованной полуаллогенной системе C57BL ^ (C57BL x DBA)F1. Помимо основного показателя смертности животных были исследованы также эффекты предварительного введения Р407 на состояние лимфоидных органов у мышей BDF в процессе развития оРТПХ. Как видно из данных, приведенных на рис. 1, развитие иммунопатологического процесса приводит к прогрессирующей деструкции тимуса, что является признаком, характерным для оРТПХ, и отличает ее от хРТПХ [14]. При этом, если на пятые сутки после индукции оРТПХ вес и клеточность тимуса в сравниваемых группах практически не отличаются друг от друга (и от значений этих параметров у ин-тактных мышей BDF), то в сроки 12 и 20 суток эти показатели оказываются достоверно ниже в группе с предварительно вызванной дислипидемией, чем в контрольной группе мышей. Это можно считать дополнительным свидетельством более интенсивного развития оРТПХ при ее индукции на фоне экспериментально вызванной дис-липидемии. вес пглтса, мг Кая*н*стж] клепан р тыкнута, 1 :;п Рис. 1. Влияние гиперлипидемии на степень деструкции тимуса при острой РТПХ. Светлые столбики - контрольная группа мышей с оРТПХ; темные - группа мышей с оРТПХ, индуцированной на фоне дислипидемии. * Достоверное отличие от соответствующего контроля (p<0,05). Совершенно другая картина была обнаружена при измерении параметров, характеризующих состояние селезенки (в те же сроки, что и показателей состояния тимуса). Уже на пятые сутки индукции как у мышей контрольной группы с оРТПХ, так и в группе с оРТПХ, развившейся на фоне дислипидемии, обнаруживается выраженная спленомегалия (увеличение веса и клеточности селезенки по сравнению с интактны-ми животными), также характерная для начальной стадии этого заболевания [19]. Однако в дальнейшем выраженность этого патологического признака снижается, и к двадцатым суткам после индукции оРТПХ величина селезенки приближается к ее исходным значениям. Существенно, что спленомегалия у контрольных мышей с оРТПХ во все сроки измерения оказывается больше, нежели у мышей с оРТПХ, развившейся на фоне дислипидемии: средний вес селезенки на 5, 12 и 20 сутки после индукции РТПХ составлял у мышей в контрольной группе - 187, 207 и 170 мг, а в группе с дислипидемией - 153, 157 и 85 мг, соответственно. Увеличение селезенки в обеих экспериментальных группах с оРТПХ было статистически достоверным при р<0,01 (по сравнению с интактными мышами BDF, у которых ее вес составлял в среднем 88 мг). Похожие данные были получены и при сравнении клеточности селезенки у мышей этих двух сравниваемых групп. Результаты измерений еще одного показателя состояния иммунной системы у животных с оРТПХ - содержания лейкоцитов в периферической крови - даны на рис. 2, из которого (2а) видно, что по мере развития оРТПХ количество лейкоцитов в крови прогрессивно снижается (с минимумом около 17 дня после индукции), но затем начинает постепенно восстанавливаться и к 38 дню возвращается к исходному уровню. Это хорошо согласуется с данными Mori Т. et al. [17], обнаружившими лейкопению у мышей на 14 день после индукции оРТПХ. При этом, как видно из рис. 2, количество лейкоцитов в крови у животных с предварительно вызванной дислипидемией во все сроки измерения (начиная с 7 дня после индукции) было выше величины этого параметра у контрольных мышей, и величина этого показателя на 17 день снизилась лишь на 58% от исходной величины (в то время как у мышей контрольной группы - на 76%). Однако такое различие между сравниваемыми группами нельзя трактовать как проявление более мягкого течения основного патологического процесса в группе мышей, у которых оРТПХ была индуцирована на фоне экспериментальной дислипидемии. Об этом свидетельствуют кривые, приведенные на рис. 2б. Здесь представлены те же данные, что и на рис. 2а, но сгруппированные по-иному: все мыши с оРТПХ были разделены не на группы с введением Р407 и без него (как это было сделано на рис. 2а), а на группу, включающую тех животных, которые погибли за время наблюдения, и группу выживших в течение этого срока. Практически полное совпадение динамики падения количества лейкоцитов крови в этих двух группах и отсутствие отличий между ними на 17 день (в момент максимума падения) говорят о том, что наблюдаемая при оРТПХ лейкопения не коррелирует с интенсивностью процессов, происходящих в пораженных тканях и приводящих к гибели животных. Следовательно, степень ее выраженности не предсказывает исхода заболевания и ее нельзя считать показателем интенсивности развития оРТПХ. Рис. 2. Динамика содержания лейкоцитов в периферической крови мышей с острой РТПХ. а - содержание лейкоцитов в крови мышей с оРТПХ в контрольной группе и группе с дис-липидемией, б - содержание лейкоцитов в крови мышей с оРТПХ в группах выживших в течение 38 суток и погибших за это время. ОБСУЖДЕНИЕ Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об усилении интенсивности оРТПХ в группе мышей, у которых иммунопатологический процесс индуцировался на фоне дислипидемии, вызванной многократным введением Р407. Клиническая картина оРТПХ характеризуется преобладанием Th1-зависимых иммунных реакций, определяющих степень поражения внутренних органов (в первую очередь, кишечника, печени и легких) и скорость гибели животных. Показателем активности TM-лимфоцитов в иммунной системе мышей-реципиентов является выраженность деструктивных изменений в тимусе (особенно на ранней стадии заболевания) и, вероятно, степень нарушений гемопоэза в костном мозге [7]. Показано, что экспериментальные воздействия, подавляющие пролиферацию Th1-клеток при оРТПХ и блокирующие эффекты продуцируемых ими цитокинов, значимо увеличивают сроки выживания мышей и уменьшают поражение тимуса, вызываемое донорскими клетками-киллерами [25]. Многочисленные данные такого рода, полученные на различных лабораторных моделях, не оставляют сомнений в том, что интенсивность оРТПХ определяется сдвигом баланса хелперов в сторону Th1. В то же время, в раннем периоде развития оРТПХ активируются также и ^2-зависимые процессы в иммунной системе реципиентов [19]. Наиболее заметным и постоянным их проявлением служит поликлональная активация B-клеток и, как результат ее, выраженная спленомегалия. Результаты наших экспериментов говорят о том, что развитие оРТПХ, которая была индуцирована на фоне предшествующей дислипидемии, приводит к увеличенной гибели животных, повышает степень деструкции тимуса, но сопровождается менее выраженной спленомегалией. Все это хорошо укладывается в исходно предполагаемую нами картину сдвига Th1/Th2-баланса в сторону Th1 под влиянием многократного введения Р407. Таким образом, данные, полученные в настоящем исследовании на модели оРТПХ, подтверждают выводы, сделанные ранее при использовании модели хРТПХ в сходной полуаллогенной системе. Наиболее интересным, по нашему мнению, вопросом, возникающим в связи с вышеописанными экспериментами, является вопрос о том, каким образом введение Р407 может сдвигать Th1/Th2-соотношение, влияя тем самым на течение иммунопатологических процессов, и каков может быть механизм, связывающий этот эффект с вызываемыми Р407 нарушениями липидного метаболизма. По нашему предположению [3, 15], закономерная связь между изменениями обмена липидов под воздействием Р407 и его влиянием на Th1/Th2-баланс в организме животных обусловлена его ингибирующим эффектом на степень активации ядерных рецепторов LXR (liver X receptors), которые играют важную роль в регуляции различных функций как на уровне отдельных клеток, так и на уровне целостного организма [1, 10, 18]. Предполагаемый механизм воздействия Р407 может быть представлен следующим образом. Попадая в лизосомы и обладая выраженными детергентными свойствами, Р407 подавляет осуществляемый кислой лизосомальной липазой (LAL) гидролиз эфиров холестерина, которые поглощаются клетками в составе липопротеинов низкой плотности, и тем самым, препятствует выходу свободного холестерина в цитоплазму. Снижение уровня холестерина в цитоплазме приводит к уменьшению его окисления и превращения в оксистеролы (в частности, в 27-гидроксихолестерин), являющиеся физиологическими лигандами LXR. Вследствие снижения уровня естественных лигандов уменьшается количество активированных оксистеролами комплексов LXR, и в результате снижается уровень тех белков, экспрессия генов которых находится под контролем LXR. В частности, снижается уровень экспрессии и функциональная активность мембранных белков-транспортеров ABCA1 и ABCG1, удаляющих холестерин из цитоплазмы и клеточных мембран, а также снижается активность холестерин-7а-гидроксилазы - ключевого фермента, определяющего скорость превращения холестерина в желчные кислоты и, соответственно, выведения его из организма. Благодаря этому механизму эффект Р407 на метаболизм холестерина выражается в накоплении его в клетках и существенном повышении его уровня в сыворотке крови. Поскольку активация LXR в обычных условиях тормозит синтез провоспалительных цитокинов (в частности, IFN-y и TNF-a), препятствуя их NF-kB-зависимой экспрессии [16, 23], снижение степени активации этих ядерных рецепторов приводит к увеличению продукции цитокинов, способствующих образованию Th1 и ингибирующих развитие Th2, что и обусловливает сдвиг Th1/Th2-баланса под влиянием Р407. Эта схема воздействия Р407 на обмен холестерина и на иммунную систему животных, будучи, несомненно, упрощенной и грубой, тем не менее, хорошо согласуется с известными фактами, обнаруженными при исследовании экспериментальной модели дислипидемии, вызванной введением Р407. Так, установлено, что главной причиной гиперхолестеринемии при введении Р407 является снижение активности 7a-холестерингидроксилазы в печени, в то время, как основная причина гипертри-глицеридемии в этой модели заключается в подавлении Р407 (действующим как детергент) активности сывороточной липопротеинлипазы, гидролизующей находящиеся в составе липопротеинов триглицериды [12]. Показано также увеличение содержания холестерина в клетках и уменьшение экспрессии мембранного транспортера холестерина ABCA1 под влиянием Р407 [13], как это и следует из предлагаемой нами схемы. Еще одним свидетельством в пользу верности вышеописанной гипотезы могут служить экспериментальные данные, которые были получены в области исследований, прямо не связанных с изучением эффектов Р407 на клетки, но которые могут быть использованы (по аналогии) при обсуждении выбранной нами модели дислипидемии. Поскольку, по нашему предположению, первичным и ключевым эффектом Р407 является ингибирование активности LAL и секвестрация холестерина в лизосомах, представляют интерес результаты недавно проведенных исследований [6], в которых исследовался метаболизм холестерина в фибробластах пациентов, страдающих болезнью накопления эфиров холестерина, у которых вследствие генетического дефекта активность LAL снижена на 90 - 95%. Было обнаружено, что в клетках таких больных не только снижен уровень свободного холестерина в цитоплазме, но и подавлена продукция 27-гидроксихолестерина, что приводило к снижению степени активации LXR (об этом свидетельствовала уменьшенная экспрессия транспортера ABCA1). Таким образом, эти опыты экспериментально доказывают постулируемую нами возможность уменьшения активации LXR при ингибирующем воздействии Р407 на активность LAL в лизосомах. При помощи вышеприведенной схемы можно также дать гипотетическое объяснение обнаруженному нами влиянию Р407 на содержание лейкоцитов в крови мышей с оРТПХ. Недавно было обнаружено, что активированные LXR оказывают ингибирующее влияние на пролиферацию и функцию Th17 (популяцию хелперов, стимулирующих развитие гранулоцитарно-макрофагального ростка в костном мозге [9, 11]) и подавляют продукцию колониестимулирующих факторов G- и M-CSF. Исходя из этого, можно предположить, что Р407 снимает блокирующее влияние LXR на Th17, вызывая тем самым стимуляцию гемопоэза, которая смягчает падение количества лейкоцитов в крови мышей с оРТПХ. Еще один вывод, вытекающий из обсуждения полученных в работе результатов, состоит в том, что использованный нами метод создания дислипидемии по методу Johnston T.P. [12] может служить удобной лабораторной моделью для изучения состояния иммунной системы при таких болезнях накопления, как болезнь Вольмана и болезнь Ниманна-Пика, при которых сниженная активность LXR обусловливает сочетание нарушений обмена холестерина с хроническими воспалительными процессами в различных органах.

About the authors

N. N Volsky

Institute of Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia

O. M Perminova

Institute of Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia

O. P Kolesnikova

Institute of Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia

References

Supplementary files