BIOFILM FORMATION BY GROUP A STREPTOCOCCI OF VARIOUS TYPES AND STUDY OF ANTIBIOTICS EFFECT ON THIS PROCESS

Full Text

Стрептококк группы А (СГА) (Streptococcus pyogenes) вызывает широкий спектр заболеваний у человека - фарингит, тонзиллит, пиодермию, скарлатину, рожу, сепсис, инвазивную инфекцию, которая иногда сопровождается развитием некротического фасцита и синдромом токсического шока. К постстрептококковым осложнениям относят такие тяжелые заболевания как ревматизм и гломерулонефрит[1, 2, 14]. Кроме того, колонии СГА обнаруживают у здоровых людей без признаков заболевания, что играет большую роль в распространении инфекции [15]. В настоящее время известно более 100 типов СГА, различающихся по М-белку. В ряде случаев типирование проводится по Т-белку, причем Т-тип не всегда совпадает с М-типом. До недавнего времени развитие стрептококковой инфекции не связывали с формированием биопленок. Одно из первых сообщений относится к 2003 г., когда японский исследователь Akiyama H. при анализе кожных поражений с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии обнаружил микроколонии СГА, окруженные гликокаликсом [5]. В дальнейшем было показано, что СГА способны формировать биопленки in vivo и in vitro и что эта способность присуща разным типам стрептококка группы А, но в различной степени[16]. Образование биопленки всегда начинается с адгезии бактерии к поверхности клетки хозяина, где она связывается с углеводными или белковыми рецепторами. В состав адгезинов СГА входят липотейхоевая кислота, гиалуроновая капсула, М-белки, ламинин-, коллаген- и фибронектин-связывающие белки [7]. Некоторые адгезины СГА, в том числе Т-антиген, связаны с пилями и фибриллами, которые обусловливают более интенсивное связывание с тканями хозяина [10]. Многочисленными исследованиями показано, что биопленки значительно менее чувствительны к антибиотикам, чем те же бактерии в планктонной форме [3]. Хотя СГА чувствительны к пенициллину при тестировании in vitro, примерно треть больных ангиной не поддается лечению этим и другими антибиотиками [6]. Поэтому представляло интерес изучить влияние антибиотиков различных групп на процесс формирования биопленок. Цель исследования - оценка способности к формированию биопленок у разных М, Т и МТ типов СГА, а также изучение влияния различных антибиотиков на этот процесс. В работе использовали 43 штамма СГА из музейной коллекции лаборатории стрептококковых инфекций ФНЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Из них: 22 типированных по М-белку, 15 штаммов Т-типа и 6 штаммов МТ-типа. Культуры СГА выращивали на бульоне Todd-Hewitt (TH) в течение 18 часов при 37°C. Исследования по формированию биопленок проводили по [13] в стерильных полистироловых 96-луночных планшетах фирмы ^star. Суточную культуру тестируемого штамма разводили в стерильном 0,9% физиологическом растворе до мутности, эквивалентной 10,0 по стандарту McFarland (Den-1 McFarland Densitometre, Biosan, Латвия), затем 1:40 бульоном ТН, обогащенным 0,5% дрожжевым экстрактом, и вносили в лунки планшета по 100 мкл на лунку ( 4 повтора для каждого штамма). В качестве отрицательного контроля использовали питательную среду. Планшеты помещали в термостат при 37°C с 5% СО2 на 2 суток. Затем планктонные клетки удаляли отсасыванием. Для окрашивания в лунки вносили по 100 мкл 1% водного раствора кристалл виолета и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Краситель удаляли, лунки промывали трижды дистиллированной водой (по 400 мкл на лунку). Затем в лунки, отмытые от несвязавшегося красителя, вносили по 150 мкл 96° этилового спирта. Экстракцию проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. Интенсивность окрашивания спиртового раствора после экстракции определяли на фотометре iEMS Reader MF (Labsystems, Швеция) при длине волны 540 нм. Более детальное исследование биопленок проводили с помощью люминесцентной микроскопии. Стрептококки выращивали на покровном стекле, помещенном в чашку Петри с питательной средой, в течение 48 часов при 37°C. Сформировавшуюся биопленку окрашивали красителем Dead/Live в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре, отмывали дважды дистиллированной водой и просматривали в люминесцентном микроскопе при увеличении х10х40. Изучение влияния антибиотиков на процесс формирование биопленок проводили с использованием штамма М 30 типа. В эксперимент взяты Р-лактамные антибиотики (бензилпенициллин, оксациллин) и цефалоспорины (цефтриаксон, цефу-роксим и цефалоспорин. Суточную культуру штамма 30М, предварительно разведенную 1:40 в бульоне TH c экстрактом дрожжей, вносили в лунки 96-луночно-го планшета. Антибиотики в соответствующем разведении добавляли в лунку одновременно с бактериальной суспензией так, чтобы конечный объем составлял 100 мкл. Планшеты инкубировали в течение 2 суток при 37°C. После этого проводили стандартную процедуру окрашивания биопленок с последующей фотометрией. В качестве положительного контроля использовали стрептококковую культуру без добавления антибиотиков, отрицательным контролем являлась стерильная питательная среда. Статистическую обработку проводили по результатам не менее трех независимых опытов. Средние значения и величину стандартной ошибки подсчитывали в программе Excel. В результате проведенных исследований установлено, что стрептококки группы А заметно различаются по способности к формированию биопленок. Следует отметить, что все штаммы с высокой способностью к образованию биопленок (OD выше 1,0) относились к М-типам. Таких штаммов обнаружено 7 из 22. Среди Т-типов такие штаммы не обнаружены, найдены штаммы с более низкой пленкообразующей способностью (OD ниже 1,0). Изучено также 6 штаммов, относящихся одновременно к М и Т типам. Среди них штамм типа МТ6 отличался высокой способностью к образованию биопленки ^D 1,4), остальные 5 штаммов имели более низкие величины ОD. Самой высокой пленкообразующей способностью обладал тип 30 М, поэтому он был выбран для проведения серии опытов с антибиотиками. Несколько ниже показатели ОD (1,5 - 1,6) отмечены у штаммов М12, М13 и М9. Самый высокий показатель OD среди Т-типов отмечен у Т14, ниже (около 0,65) - у Т19 и Т29. У остальных Т-типов пленкообразующая способность была выражена еще слабее ^D 0,3 и ниже). Интересно отметить, что типы 1М и 3MT, которые наиболее часто выделяются при стрептококковых инфекциях, в том числе при инвазивной инфекции, обладали низкой способностью к формированию биопленок. То же можно сказать о типе М5, в М-белке которого обнаружены эпитопы, перекрестно-реагирующие с тканями млекопитающих и который считается индуктором аутоиммунных реакций при ревматизме. При использовании метода люминесцентной микроскопии для окрашивания биопленок на покровном стекле с красителем Dead /Live, который позволяет определять наличие живых бактерий, обнаружены ярко-зеленые конгломераты стрептококков разной формы и размера. В следующей серии опытов проводили изучение влияния антибиотиков на формирование биопленок. Бензилпенициллин (исходная концентрация 1 млн ЕД во флаконе) испытывали в концентрации 1:10 000 ЕД - 0,0001 ЕД, остальные антибиотики - в концентрации 10 000 мкг/мл - 0,0001 мкг/мл. Антибиотики вносили в среду одновременно с культурой стрептококка и инкубировали планшет, как описано ранее. На вторые сутки с помощью фотометра определяли количество планктонных клеток в лунках, после чего их удаляли и проводили стандартную процедуру окрашивания биопленок. При использовании широкого спектра доз бензилпенициллина не наблюдали роста как планктонных клеток, так и биопленок. Такие же результаты были получены при использовании разных доз оксациллина, цефуроксима и цефотаксима. Исключением явился цефтриаксон. При добавлении малых доз этого препарата, начиная с 0,01 мкг/мл, наблюдали рост планктонных клеток и биопленок, который увеличивался по мере уменьшения дозы антибиотика. При использовании более высоких доз антибиотика не наблюдали роста планктонных клеток и формирования биопленки. При добавлении тех же доз антибиотиков к уже сформировавшейся биопленке эффект ингибиции отсутствовал. Однако эти данные носят предварительный характер и требуют дальнейшего изучения. В результате проведенных исследований установлено, что стрептококки группы А разных М- и Т-типов обладают различной способностью к формированию биопленок in vitro. Наиболее выраженная способность к биопленкообразованию отмечена у 8 штаммов из 43, причем все они относились к М-типам. У Т-типов пленкообразующая способность выражена слабее. Интересно отметить, что типы 1М и 3М (в наших экспериментах 3ТМ), которые наиболее часто выделяются при инвазивной стрептококковой инфекции, обладали невысокой способностью к формированию биопленок. Сходные данные получены другими авторами. Так, Lembke C. et al. [9] было показано, что при анализе 9 клинически значимых серотипов только 4 (2М, 6М, 14М и 18М) обладали выраженной способностью к формированию биопленки на поверхности полистирола и стекла. У типов 1М и 3М пленкообразующая способность была выражена в значительно меньшей степени. Кроме того, авторы показали, что способность к биопленкообразованию варьирует у разных штаммов в пределах одного серотипа [9]. Чувствительность к антибиотикам различна у бактерий, находящихся в планктонном состоянии и в виде биопленок. Бактерии в составе биопленки могут быть в 1000 раз более устойчивыми к антибиотикам, чем планктонные формы. Повышенная резистентность бактерий в составе биопленки связана, прежде всего, с наличием углеводного матрикса, который затрудняет проникновение как антимикробных факторов, так и факторов иммунитета хозяина [3, 4, 11, 12]. В наших опытах по изучению влияния антибиотиков на процесс формирования биопленки при одновременном внесении в лунку культуры стрептококка и антибиотика отсутствовал рост как планктонных клеток, так и биопленок. Таким образом, использованный нами штамм типа М30 в планктонной форме оказался чувствительным ко всем использованным антибиотикам, причем даже в очень малых дозах. Определить минимальную ингибирующую концентрацию удалось только для цеф-триаксона (0,01 мкг/мл). Формирование биопленки является одним из механизмов хронизации инфекционного процесса. Стрептококковый фарингит часто переходит в хроническую или возвратную форму в результате недостаточного лечения антибиотиками примерно у 30% больных [6]. Авторы показали, что штаммы, взятые от недолеченных больных, образуют биопленки in vitro, и эти биопленки требуют значительно больших доз антибиотиков по сравнению с планктонными культурами. В настоящее время установлено, что многие хронические инфекции вызываются бактериями, растущими в виде биопленок. Это бактериальное сообщество имеет сложную структуру, существует в динамике и может развиваться на абиотических (пластик, стекло, металл) и биотических (растения, животные, человек) поверхностях. Первый этап формирования биопленки представляет собой адгезию планктонных клеток к поверхности сначала с помощью электростатических связей, а затем более прочного контакта бактериальных поверхностных структур с белковыми или углеводными структурами тканей хозяина. На втором этапе происходит пролиферация бактериальных клеток и созревание биопленки. В ее состав могут входить клетки одного вида или при формировании в нее включаются бактерии других видов. В это же время происходит образование экстрацеллюлярного матрикса, стабилизирующего структуру биопленки. Однако рост сообщества ограничен размером поверхности, количеством питательных веществ и т.д. Наступает третий этап - полная или частичная деградация пленки с возможным образованием новых очагов другой локализации [11]. Межклеточные взаимодействия между бактериями в биопленке осуществляются с помощью специального механизма Quorum Sensing (QS). Для этого существуют специальные сигнальные молекулы, которые называются аутоиндукторами. У стрептококков это - олигопептиды [7, 11]. QS дает бактериям возможность проводить мониторинг окружающей среды и менять поведение на уровне клеточной популяции, изменяя число и количество клеток, а также воздействуя на защитные системы хозяина, модулируя активность различных систем организма.

About the authors

T. A Danilova

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

G. A Danilina

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

A. A Adzhieva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

A. G Minko

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

N. V Alekseeva

Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology

Moscow, Russia

References

Supplementary files