COMPARATIVE STUDY OF IMMUNOGENICITY AND PROTECTIVE EFFECT OF LIVE COLD-ADAPTED AND INACTIVATED VACCINES AGAINST TYPE A INFLUENZA

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Вирус гриппа остается актуальным патогеном для современного здравоохранения, прежде всего, в связи с сезонными эпидемиями [18, 19, 21]. Грипп как заболевание отличается серьезными осложнениями, а также может заканчиваться летальным исходом. Кроме того, вспышки и ежегодные эпидемии гриппа приводят к значительному экономическому ущербу. Вирусы гриппа обладают чрезвычайно высоким пандемическим потенциалом. К настоящему времени на уровне ВОЗ подтверждены случаи инфекции человека вирусами гриппа животных: птиц (прежде всего, серотипы H5N1, H7N9, H9N2), а также свиней и свиного происхождения, в особенности тройных реассортантов (прежде всего, серотипы H1N1, H3N2) [16 - 19]. В связи с этим, нельзя исключать появления в любом месте и в любое время нового штамма вируса гриппа с пандемическим или эпизоотическим потенциалом. Вакцинопрофилактика является одним из основных методов борьбы с гриппом [3, 19, 21], особенно в связи с высокой резистентностью вирусов гриппа к существующим препаратам для специфической терапии и профилактики гриппа, а также проблемами безопасности при их массовом применении [2, 21]. Кроме того, с учетом высокого потенциала изменчивости вируса гриппа велика вероятность появления пандемических штаммов, заведомо резистентных к специфическим противовирусным препаратам. В настоящее время основа профилактики гриппа - инактивированные трехвалентные сезонные вакцины (расщепленные и субъединичные), вводимые внутримышечно (подкожно) [3, 19, 21], хотя в последние годы стали появляться и четырехвалентные вакцины [3]. В то же время, инактивированные вакцины против гриппа имеют ряд ограничений: недостаточная иммуногенность при вакцинации некоторых популяционных групп, в особенности групп риска (маленькие дети, беременные, пожилые люди, лица с хроническими заболеваниями), а также в отношении антигенно отличных от вакцинных штаммов (дрейфовые варианты, гетерологичные штаммы) [3, 19, 21]. Живые аттенуированные вакцины против гриппа, в первую очередь на основе хододоадаптированных (ха) штаммов - альтернативный вариант для вакцинопрофилактики гриппа. Ключевая особенность живых ха вакцин - интраназальное введение, а также ограниченная репродукция в пределах респираторного тракта после иммунизации, то есть по существу имеет место контролируемая инфекция [4, 19, 21]. Использование антигена в нативной форме и способа введения, аналогичного естественному пути инфекции, определяет потенциал иммуногенности и защитной эффективности, в том числе перекрестной (против широкого набора антигенно отличных штаммов), что особенно важно для препандемических вакцин (для праймирования популяции в рамках подготовки к возможной пандемии) [3]. Считается, что живые ха вакцины против гриппа в большей степени индуцируют местные (секреторные, в месте проникновения инфекции), а не сывороточные антитела, а также различные клеточные компоненты иммунной системы (как местные, так и системные), особенно в сравнении с инактивированными вакцинами [4]. Однако эти различия могут быть в определенной степени связаны не столько с препаратом (вакциной), сколько с вариантом иммунизации (интраназальный и внутримышечный способ введения, соответственно). Кроме того, в таких исследованиях изучают инактивированные вакцины на основе производственных штаммов-реассортантов, которые, в свою очередь, получены с использованием высокопродуктивных штаммов - прежде всего, A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1), а живые вакцины - на основе ха штаммов-реассортантов, которые получены с использованием ха штаммов-доноров [4]. Известно, что иммуногенность и эффективность вакцин против гриппа может, по крайней мере, частично определяться всем комплексом белков вириона [21]. К настоящему времени накоплены данные о предотвращении лабораторно подтвержденной инфекции гриппом после иммунизации как живыми ха, так и инактивированными вакцинами [4], однако в отношении корреляции иммуногенности (сывороточных антител по РЗГА) и защитной эффективности (клинические исследования с контролируемой инфекцией) данные имеются только для инактивированных вакцин [19]. Очевидно, что в сложившейся ситуации объективная оценка живых ха вакцин возможна только в рамках прямого сравнения с инактивированными вакцинами [4]. Однако количество опубликованных прямых сравнительных исследований живых ха и инактивированных вакцин весьма ограничено, а полученные данные разнонаправ-лены или даже противоречивы [4]. Наиболее показательные результаты ряда исследований отражены в работах [7 - 15, 22]. В целом, в некоторых исследованиях более эффективны и/или иммуногенны живые ха вакцины против гриппа, в других - инактивированные вакцины. Имеются и исследования, где эффективность этих вакцин сравнима, однако при этом иммуногенность и индукция клеточных компонентов иммунной системы различны. Следует также отметить, что количество доклинических сравнительных исследований даже без учета научно-методического уровня крайне мало. Таким образом, представляет несомненный интерес изучение живых ха и инактивированных вакцин против гриппа в рамках прямых сравнительных исследований на модели лабораторных животных (мышей) с использованием аналогичных штаммов для получения инактивированной цельновирионной и живой ха вакцины против гриппа - исходный родительский (дикий) вирус и полученный на его основе ха штамм-донор, соответственно. Также целесообразно изучить роль различных вариантов иммунизации (внутримышечной и интраназальной) в иммуногенности и защитной эффективности инактивированных и живых ха вакцин против гриппа, поскольку вариант иммунизации (способ введения) может определять иммуногенность и защитную эффективность вне зависимости от типа вакцины (живая аттенуированная, инактивированная). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Все использованные методики основаны на [6, 20]. Работа проводилась в полном соответствии с действующими санитарно-эпидемиологическими правилами [1]. В работе использовали группы по 22 нелинейные мыши (беспородные самки весом 14 - 16 г на момент первой иммунизации) из НЦБТ РАМН, филиал «Андреевка», Московская область); 9-дневные куриные эмбрионы. Получение суспензии эритроцитов кур проводили после выдерживания 9-дневных куриных эмбрионов при 34°С в течение 3 - 4 дней (до возраста 12 - 13 дней). В работе использовали очищенные и концентрированные вирусы гриппа А/ Краснодар/101/59 (H2N2) и А/Краснодар/101/59/30КЭ/5MDCK/1/7/4 (H2N2), родительский дикий штамм (Ад) и полученный на его основе ха вариант (Ах), соответственно. Маточный материал (неочищенный) получен из музея вирусов лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов отдела вирусологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Для получения вакцин и определения иммуногенности и защитного эффекта вирусы пассировали на куриных эмбрионах: 48 часов при 34 (Ах) и 36 (Ад) °C. После пассирования вирусы очищали и концентрировали поэтапным центрифугированием: 10 минут при 2000 g, 30 минут при 5000 g и 30 минут при 35 000 g (последний этап повторяли не менее 3 раз). Ресуспендирование проводили в стерильном фосфатносолевом растворе (ФСР). После накопления вирусы контролировали на стерильность (тиогликолевая среда, ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Московская область), а также биологическую активность. Дальнейшую работу проводили только с теми партиями вирусных препаратов, которые были стерильны и удовлетворяли требованиям по биологической активности. Ад контролировали по гемагглютинирующей (реакция гемагглютинации с эритроцитами кур; ГАЕ/0,05 мл) и инфекционной (титрование на куриных эмбрионах, инкубация 48 часов при 36°C; ЭИД50/0,1 мл) активности. Из партии очищенного и концентрированного стерильного вирусного препарата Ад готовили инактивированную цельновирионную вакцину. Инактивацию проводили 0,05% формальдегидом (2 часа при 36°C). Оптимальный режим инактивации выбирали на основе данных по динамике инактивации для полученного очищенного и концентрированного вирусного препарата. Удаление инактивирующего агента проводили центрифугированием (30 минут при 35 000 g), при этом формальдегид удаляли вместе с супернатантом, а осадок антигена ресуспендировали в ФСР. Инактивированную цельновирионную вакцину проверяли на полноту инактивации (на куриных эмбрионах), биологическую активность (гемагглютинация), а также стерильность. Ах контролировали на ха, температурочувствительный (тч) и аттенуированный (атт) фенотип. Контроль на ха и тч фенотип осуществляли путем титрования Ах в сравнении с Ад на куриных эмбрионах при разной температуре (25, 34, 36, 38 и 40°C), инкубация 48 часов (72 часа для 25°C). Атт фенотип контролировали при интрана-зальной инфекции мышей (при частичном эфирном наркозе в объеме 50 мкл на мышь; вирусы не разводили). Партию вакцины на основе очищенного и концентрированного стерильного вирусного препарата считали ха при условии существенно сниженной репродукции при повышенной температуре (тч) и существенно повышенной репродукции при пониженной температуре (ха), а также отсутствию вируса в экстракте легких мышей через 72 часа после интраназальной инфекции в сравнении с Ад. Выделение (титрование) вируса из экстракта легких мышей проводили с использованием куриных эмбрионов; инкубация 48 часов при 34 (Ах) и 36 (Ад)^. Адъюванты к вакцинам (вирусным препаратам) для иммунизации животных не добавляли. В качестве контроля использовали группы неиммунизированных мышей той же партии. Таблица 1. Схема иммунизации мышей № группы Вакцинный вирус Тип вакцины Введение 1 Ад инакт. в/м 2 Ад инакт. и/н 3 Ах ха в/м 4 Ах ха и/н Группы мышей иммунизировали двукратно с интервалом 14 дней в соответствии со схемой (табл. 1) инактивированной вакциной на основе Ад или живой ха вакциной на основе Ах внутримышечно в заднюю конечность (в объеме 0,1 мл) или интрана-зально (при частичном эфирном наркозе, в объеме 50 мкл на мышь). Биологическая активность партии Ах для иммунизации составила 106 ЭИД50/0,1 мл (34°C). С использованием неиммунизированных мышей той же партии дополнительно контролировали атт фенотип Ах в сравнении с Ад, как описано выше. Отбор крови, выделение легких, а также инфекцию Ад проводили через 14 дней после второй иммунизации. Отбор крови осуществляли под полным эфирным наркозом, после чего проводили выделение легких. Интраназальную инфекцию проводили под частич- 5 Неиммуниз. (контроль) ным эфирным наркозом с использованием Ад в 3 разведениях (без разведения, в 10 и 100 раз), выделение легких этих мышей проводили через 72 часа после инфекции. Обработку и анализ сывороток и экстрактов легких проводили одновременно. Сыворотки после получения и очистки центрифугированием (1000 g, 10 мин) разводили в ФСР 1:10 и прогревали на водяной бане при 56°С в течение 30 минут. Азид натрия к сывороткам не добавляли. 10% экстракты легких прогревали в тех же условиях без дополнительного разведения. Эти сыворотки и экстракты легких использовали для определения иммуногенности вакцин. Из экстрактов легких (без прогревания) иммунизированных мышей (после инфекции Ад) выделяли (титровали) вирус с использованием куриных эмбрионов (инкубация 48 часов при 36°C). Эти экстракты легких использовали для определения защитного эффекта. Иммуногенность определяли по реакции задержки (торможения) гемагглютина-ции (РЗГА) с использованием суспензии эритроцитов кур. Реакцию ставили против очищенных и концентрированных вирусов гриппа Ад и Ах, использовали вирусные препараты тех же партий, что и для изготовления вакцин. РЗГА ставили в 4 повторах при рабочей дозе вируса 8 ГАЕ/0,05 мл. Минимальный определяемый титр (предел чувствительности) составил 1:5. Защитный эффект определяли по уровню Ад в легких иммунизированных мышей после инфекции, как описано выше. Полная защита - отсутствие вируса в легких иммунизированных мышей после инфекции в пределах чувствительности метода. Статистическую обработку проводили с использованием SPSS (IBM, США). РЕЗУЛ ЬТАТЫ В первой серии экспериментов проводили анализ иммуногенности ха и инактивированных вакцин при различных способах иммунизации по РЗГА с сыворотками (сыворотки прогреты) против обоих вакцинных штаммов (Ад и Ах). Г i-yrm-Si Защитный эффект (титр Ад, 10х) ха и инактивированных вакцин при различных способах введения и дозах (разведениях) Ад при инфекции мышей; 95. % CI; Ах - контроль атт фенотипа; линия - предел чувствительности метода. Иммуногенность (по РЗГА с сыворотками) после двукратной иммунизации для всех изученных вариантов была минимальной, ни в одном случае не наблюдались титры 1:40 и более. Лишь в группе 3 (в/м иммунизация ха вакциной) отмечалось существенное повышение титров сывороточных антител против Ад, в остальных случаях титры антител повышались несущественно или не определялись в пределах чувствительности метода. В следующей серии экспериментов проводили анализ иммуногенности ха и инактивированных вакцин при различных способах иммунизации по РЗГА с экстрактами легких (экстракты прогреты) против обоих вакцинных штаммов (Ад и Ах). Иммуногенность (по РЗГА с экстрактами легких) после двукратной иммунизации для всех изученных вариантов была минимальной, ни в одном случае не наблюдались титры 1:40 и более. Лишь в группе 4 (и/н иммунизация ха вакциной) отмечалось существенное повышение титров сывороточных антител против Ад, в остальных случаях титры антител не определялись в пределах чувствительности метода. В завершающей серии экспериментов определяли защитный эффект по уровню репродукции Ад в легких после инфекции мышей, иммунизированных ха и инактивированными вакцинами при различных способах введения препаратов. После двукратной иммунизации отмечался неодинаковый защитный эффект при использовании ха и инактивированных вакцин при различных способах введения препаратов и с учетом разведения Ад при инфекции мышей (рис.). Полная защита от инфекции (Ад не выделяется после инфекции иммунизированных мышей) отмечалась только для группы 3 (в/м иммунизация ха вакциной). В сравнении с Таблица 2. Средние величины показателей по всем сериям экспериментов (совокупные данные) № группы Иммуногенность Защитный эффект сыворотка легкие 10 100 Ад Ах Ад Ах 1 5 <5 <5 <5 2,5 2,5 1,8 2 <5 <5 <5 <5 2,2 1,8 0,7 3 20 <5 <5 <5 <0,25 <0,25 <0,25 4 <5 <5 20 <5 1,5 <0,25 <0,25 5 <5 <5 <5 <5 5,0 4,0 1,0 Примечание. Иммуногенность по РЗГА в сыворотке и легких против Ад и Ах (средний титр антител, 1/х); защитный эффект - средний титр вируса (ЭИД50/0,1 мл; 1 - неразведенный Ад, 10 и 100 - разведения Ад при инфекции) в легких мышей (10х); <5 и <0,25 - сигнал ниже предела чувствительности метода. контрольными группами существенное повышение защитного эффекта отмечалось для всех изученных групп, в несколько большей степени для группы 4 (и/н иммунизация ха вакциной; полная защита при инфекции разведенными вирусами Ад) и сравнимое для групп 1 и 2 (в/м и и/н иммунизация инактивированной вакциной, соответственно). Следует подчеркнуть, что Ад хорошо размножался в легких неиммунизированных мышей той же партии в сравнении с Ах, который в пределах чувствительности метода не выделялся, то есть сохранил атт фенотип. Средние величины показателей по всем сериям экспериментов обобщены в табл. 2. ОБСУЖДЕНИЕ Вакцинация остается основным способом борьбы с гриппом, однако применяемые для профилактики гриппа вакцины, главным образом инактивированные, вводимые внутримышечно (подкожно), имеют ограничения: недостаточная имму-ногенность среди ряда групп риска, а также в отношении антигенно отличных от вакцинных штаммов [3, 19, 21]. Сложная технология получения инактивированных вакцин, в особенности стадия инактивации и очистки от инактивирующего агента (например, формальдегида), обусловливает высокую стоимость и временные ограничения производства. Кроме того, в настоящее время мощности всех производителей вакцин против гриппа недостаточно для реализации массовой вакцинопрофилактики сезонных эпидемий гриппа, тем более, для подготовки к возможной пандемии. Живые ха вакцины, вводимые интраназально - альтернативный подход вакцинопрофилактики гриппа. К преимуществам этих вакцин относят простой и быстрый способ иммунизации, использование антигена в нативной форме, а также индукцию иммунитета в месте проникновения инфекционного агента. Однако используется живой, хотя и аттенуированный вирус (имеет место контролируемая инфекция), что определяет возможные проблемы с безопасностью, в том числе способа введения, а также биобезопасности [4]. В связи с этим, необходим глубокий научный и объективный анализ эффективности и безопасности живых аттенуированных вакцин против гриппа. В настоящее время единые критерии оценки эффективности для живых ха вакцин против гриппа на уровне ВОЗ не приняты. При этом для инактивированных вакцин как суррогатный показатель защитной эффективности используется иммуногенность по титрам сывороточных антител в РЗГА, а титр 1:40 определяет 50% защиту от инфекции [19]. Таким образом, научно обоснованный подход объективной оценки эффективности и иммуногенности живых аттенуированных, в том числе ха, вакцин против гриппа - в прямых сравнительных исследованиях с инактивированными вакцинами. Следует однако подчеркнуть, что способ введения (интраназально и внутримышечно) и характеристики вакцинных штаммов-доноров (высокопродуктивные и холодоадаптированные) могут, как отмечалось выше, оказывать существенное влияние на эффективность и иммуногенность вакцин, и это также необходимо учитывать. Актуальность подхода сравнительного изучения живых ха и инактивированных вакцин против гриппа в целом и с учетом штаммов-доноров и способа введения, в частности, подтверждается разнонаправленными и даже противоречивыми данными опубликованных к настоящему времени исследований как клинических, так и доклинических, причем количество последних весьма ограничено [4]. В наших исследованиях впервые проведено прямое сравнение инактивированных и живых ха вакцин, изготовленных из аналогичных штаммов - дикого вируса А/ Краснодар/101/59 (H2N2) (Ад) и полученного на основе этого родительского варианта живого ха вируса А/Краснодар/101/59/30КЭ/5MDCK/1/7/4 (H2N2) (Ах) - при внутримышечной и интраназальной иммунизации мышей. Иммуногенность определяли по РЗГА против обоих вакцинных штаммов (Ад и Ах) в сыворотке, а также легких (экстракты). Кроме того, оценивали защитный эффект по уровню репродукции Ад в легких иммунизированных мышей после инфекции. Совокупность полученных данных показывает, что живые ха и инактивированные вакцины, изготовленные из аналогичных штаммов, неодинаково повышают имму-ногенность (титры антител по РЗГА в сыворотке и легких) и защитный эффект после двукратной иммунизации мышей при различных способах введения вакцин. Ни один из вариантов вакцин и способа иммунизации не индуцировал титры антител 1:40 и более в сыворотке и легких. Необходимо отметить, что изначально планировалось определение только сывороточных антител. Однако несмотря на весьма низкую иммуногенность по РЗГА в сыворотке (в ряде случаев титры антител в пределах чувствительности метода не определялись) наблюдалось существенное повышение защитного эффекта в сравнении с контролем (все варианты, с учетом разведения Ад при инфекции мышей). Для поиска возможного объяснения феномена также был проведен анализ иммуногенности по РЗГА в легких, который выявил сходную картину. Наибольшая иммуногенность по сывороточным антителам отмечалась для в/м введения живой ха вакцины, а в легких - для и/н введения этой вакцины, причем против Ад в обоих случаях. В то же время, как отмечалось выше, все варианты вакцин и способа иммунизации индуцировали, по крайней мере, частичную защиту от инфекции в сравнении с неиммунизированным контролем (с учетом разведения Ад при инфекции мышей). Полная защита от инфекции (Ад не выделяется из легких иммунизированных мышей после инфекции в пределах чувствительности метода) однако отмечалась только для в/м введения живой ха вакцины, то есть в/м введения антигена в нативной форме. Кроме того, результаты показывают, что хотя несколько более высокая иммуно-генность по РЗГА в сыворотке и легких связана с защитой от инфекции в сравнении с контролем, защитный эффект отмечался и без индукции титров антител в легких и сыворотке. Ни в одном случае иммуногенность не достигала уровня 1:40 и более, который признается как достаточный для 50% защиты от инфекции [19]. Другими словами, полная защита от инфекции в этой серии экспериментов не связана c антителами в сыворотке и/или легких, определяемыми по РЗГА (иммуногенность), но может определяться другими факторами гуморальных и/или клеточных компонентов иммунитета. Строго говоря, РЗГА показывает лишь факторы, задерживающие гемаг-глютинацию, тогда как в ходе иммунизации могли индуцироваться, например, нейтрализующие антитела. Нельзя также исключать различные механизмы реализации защитного действия для живых ха и инактивированных вакцин против гриппа, причем определенную роль также может играть и способ введения, в том числе вне зависимости от типа используемой вакцины. Что касается роли способа введения вакцины, то в/м введение связано с индукцией антител в сыворотке, а и/н - в легких, хотя существенное повышение титров отмечалось только для живой ха вакцины против Ад, а не Ах. Следует также отметить, что большая иммуногенность, а также защитный эффект с учетом способа введения для ха вакцины могут определяться оптимальными антигенными характеристиками ха штамма-донора (Ах) в сравнении с исходным родительским вариантом (Ад), при том что иммуногенность определялась против обоих штаммов, а защитный эффект - против Ад, поскольку Ах обладает атт фенотипом и не размножается в легких мышей. Что касается литературных данных по сравнению живых аттенуированных и инактивированных вакцин, то они, как отмечалось выше, разнонаправлены и противоречивы, а также не учитывают способ введения и штаммовые особенности вакцин. В одном из немногих доклинических сравнительных исследованиях, проведенном однако на хорьках [10], отмечалась сравнимая иммуногенность и защитная эффективность для ха и инактивированных вакцин. Эти результаты не согласовываются с полученными нами на мышах данными. Кроме того, хотя имеются результаты сравнительных исследований различных способов иммунизации вакцин против гриппа (внутримышечный и интраназальный) [4], в них часто изучают инактивированные и живые (дикие) вирусы гриппа [5]. В завершении следует отметить технологические аспекты работы с живыми ха вирусами и вакцинами на их основе. В отличие от инактивированных вакцин, которые проходят стадию инактивации и дополнительной очистки, живые ха вакцины - по сути очищенные и концентрированные вирусные препараты, которые при необходимости разводят до нужной дозы (ЭИД5о/0,1 мл). Каждая партия живой ха вакцины как иммунобиопрепарат должна проходить контроль по биологической активности (фенотипу), что повышает риск контаминации посторонними агентами. Кроме того, множественные пассажи при понижающейся температуре (классический способ получения ха штаммов доноров), необходимость регулярного пересева существенно повышают риск контаминации маточного материала. В нашем случае на первых этапах исследования выявились определенные сложности, связанные с контаминацией маточного материала некоторых серий, в особенности Ах.

About the authors

O. S Kashirina

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

M. I Chernikova

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

Yu. M Vasiliev

Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera

Moscow, Russia

References

Supplementary files